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INSTITUTO FEDERAL GOIANO
CÂMPUS URUTAÍ
Curso de Licenciatura em Ciências
Biológicas
MARIA CRISTINA ARAÚJO VAZ
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CONFRONTO in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. COM FUNGOS...
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MARIA CRISTINA ARAUJO VAZ
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FITOPATOGÊNICOS e NÃO FITOPATO...
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Dedico a minha família, as
minhas filhas e ao meu
Orientador.
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus pela vida, por ter proporcionado conviver com
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RESUMO
VAZ, M.C.A. Confronto in vitro de isolados de Trichoderma spp. com fungos
fitopatogênicos e não fitopatogêncios...
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ABSTRACT
VAZ, M.C.A. Isolates Trichoderma spp. in front of plant pathogenic fungi and no plant
pathogenic fungi in vi...
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SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS.....................................................................................................
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LISTAGEM DE QUADROS
Quadro 1. Avaliação qualitativa de acordo com a escala de Bell et al. (1982) do
pareamento de isolad...
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1. INTRODUÇÃO
Um dos fungos utilizados para controle biológico pertence ao gênero
Trichoderma sp. Pers. (1794), que tem ...
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A grande importância nos processos de biocontrole depende, não
exclusivamente do antagonista e sim dos tipos de cultivos...
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2. REVISÃO LITERATURA
2.1. O universo dos fungos e sua relação com a patogenicidade
Os fungos existentes na natureza pod...
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Este organismo não é um agente causal de doenças em plantas. O antagonismo
de T. harzianum tem se destacado por Romeiro ...
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Segundo Harman et al. (2004) espécies de Trichoderma spp. estão presentes no
solo e são agentes de controle biológico ba...
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Os fungos do gênero Trichoderma possuem grande variedade antagônica que é
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3. MATERIAIS E MÉTODOS
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3.3. Teste in vitro de pareamento entre fungos miceliados
O confrontamento foi realizado utilizando discos de micélio, ...
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Figura 1. Pareamento de isolado de Alternaria sp. (acima e micélio marrom) com
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Figura 2. Exemplos de crescimentos miceliais pertencentes a diferentes notas de acordo
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
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Generalizando os isolados de Fusarium sp. e Bipolaris sp. testados tiveram seu
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Quadro 2. Avaliação qualitativa de acordo com a escala de Bell et al. (1982) do
pareamento de isolados de Fusarium oriu...
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O isolado de Aspergillus niger oriundo de feijão-porco, considerado um fungo
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Quadro 3. Análise de frequência dos resultados obtidos de acordo com a escala de Bell
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6. LITERATURA CITADA
AGRIOS, G.N. Plant pathology. 4a Ed., Academic Press. 1997. 606p.
ALEXOPOULOS, C.J.; MIMS, C.W.; L...
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CHAO, W. L.; NELSON, E. B.; HARMAN, G. E.; HOCH, H. C. Colonization of the
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LORITO, M.; HARMAN, G. E.; HAYES, C. K.; BROADWAY, R. M.; TRONSNO,
A.; WOO, S. L.; DI PIETRO, A. Chitinolytic enzymes p...
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ROSA, D. D. et al. Efeito de herbicidas sobre agentes fitopatogênicos. Acta
Scientiarum Agronomy, v.32, n.3, p.379-383,...
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CONFRONTO in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. COM FUNGOS FITOPATOGÊNICOS e NÃO FITOPATOGÊNICOS.
O objetivo deste trabalho foi realizar o confrontamento de isolados de Trichoderma spp. com fungos fitopatogênicos e não fitopatogênicos. Os isolados de Trichoderma spp e de fungos filamentosos (Fusarium solani, Alternaria sp., Colletotrichum gloeosporioides, e Aspergillus niger) foram repicados em meio batata-dextrose-ágar (BDA). O confrontamento foi realizado utilizando placas de Petri, sendo inoculado em posições opostas discos de micélio (9 mm) de Trichoderma spp. e fungos filamentosos. Após a inoculação as placas permaneceram sob regime de 25 oC, à 12 horas de luz, por um período de sete dias. Após este período avaliou-se qualitativamente de acordo com a Escala de Bell et al. (1982), que consiste na adequação de notas para a porcentagem de área do meio de cultura sob de expressão do antagonismo. A maioria dos isolados de Trichoderma spp. expandiram na superfície da placa e nenhuma combinação ou repetição foi classificada pela nota 5, ou seja, nota dada ao fungo fitopatogênico quando completa o crescimento em toda a superfície do meio de cultura impedindo o crescimento de Trichoderma spp. Os isolados de Fusarium sp. e Bipolaris sp. testados tiveram seu crescimento fortemente inibido pelos isolados de Trichoderma spp. testados. O isolado de Aspergillus niger oriundo de feijão-porco, considerado um fungo um aerobionte parasita fraco oriundo, demostrou bastante variabilidade de interação antagônica com os isolados de Trichoderma. O isolado Alternaria oriundo de salsa foi o mais suscetível ao antagonismo promovido pelos isolados de Trichoderma spp. Este trabalho demonstrou o antagonismo diferencial de isolados de Trichoderma contra isolados de fungos.

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Trabalho de Conclusão de Curso: Maria Cristina de Araújo Vaz, Urutaí, GO, março de 2015.

  1. 1. i INSTITUTO FEDERAL GOIANO CÂMPUS URUTAÍ Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas MARIA CRISTINA ARAÚJO VAZ Trabalho de Conclusão de Curso: CONFRONTO in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. COM FUNGOS FITOPATOGÊNICOS e NÃO FITOPATOGÊNICOS URUTAÍ – GO 2015
  2. 2. ii MARIA CRISTINA ARAÚJO VAZ Trabalho de Conclusão de Curso: CONFRONTO in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. COM FUNGOS FITOPATOGÊNICOS e NÃO FITOPATOGÊNICOS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Licenciatura em Ciências Biológicas do Instituto Federal de Educação, Ciências e Tecnologias Goiano – Câmpus Urutaí, como requisito parcial para a obtenção do título de Licenciado em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Milton Luiz da Paz Lima URUTAÍ – GO 2015
  3. 3. ii
  4. 4. iii MARIA CRISTINA ARAUJO VAZ CONFRONTO in vitro DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. COM FUNGOS FITOPATOGÊNICOS e NÃO FITOPATOGÊNICOS Trabalho de Curso aprovado como requisito parcial para a conclusão do curso de Licenciatura em Ciências Biológicas do Instituto Federal de Educação, Ciências e Tecnologias Goiano – Câmpus Urutaí, pela banca examinadora composta pelos membros a seguir: Prof. D.Sc. Milton Luiz da Paz Lima (IF Goiano – Câmpus Urutaí) Presidente da banca examinadora Prof. D.Sc. Pabline Marinho Vieira (IF Goiano – Câmpus Urutaí) Membro titular da banca examinadora Prof. D.Sc. Gleina Costa Silva Alves (IF Goiano – Câmpus Urutaí) Membro titular da banca examinadora Data da defesa do Trabalho de Curso: 12/3/2015.
  5. 5. iv Dedico a minha família, as minhas filhas e ao meu Orientador.
  6. 6. v AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus pela vida, por ter proporcionado conviver com pessoas especiais que contribuíram para minha formação e que se tornaram especiais. As minhas filhas que me apoiaram nessa etapa da minha vida, dando suporte quando tudo parecia não ter solução. Em especial ao meu esposo João Vaz pelo companheirismo, amor, dedicação e compreensão no decorrer do curso. Ao Instituto Federal Goiano Câmpus Urutaí juntamente com docentes, funcionários e direção que foram muito importantes nessa etapa da minha vida, proporcionando a realização do curso de Ciências Biológicas. Ao meu orientador o Professor Dr. Milton Luiz da Paz Lima pela paciência, por me ajudar, ensinar, pelas orientações, incentivos e por muitas vezes me aconselhar. Aos professores pelos ensinamentos, incentivo e contribuição no decorrer do curso de Licenciatura em Ciências Biológicas do Instituto Federal Goiano Câmpus Urutaí. As minhas amigas Alessandra Reis e Camila Vaz que estiveram junto comigo no decorrer do curso e me acompanharam na confecção do TC. Ao meu amigo Caio César Pereira pela paciência e perseverança, por ter me ajudado nos experimentos no Laboratório de microbiologia do Instituto Federal Goiano Câmpus Urutaí.
  7. 7. vi “Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai- vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.” Charles Chaplin
  8. 8. vii RESUMO VAZ, M.C.A. Confronto in vitro de isolados de Trichoderma spp. com fungos fitopatogênicos e não fitopatogêncios. Trabalho de Conclusão de Curso. Urutaí, GO, 2015. O objetivo deste trabalho foi realizar o confrontamento de isolados de Trichoderma spp. com fungos fitopatogênicos e não fitopatogênicos. Os isolados de Trichoderma spp e de fungos filamentosos (Fusarium solani, Alternaria sp., Colletotrichum gloeosporioides, e Aspergillus niger) foram repicados em meio batata-dextrose-ágar (BDA). O confrontamento foi realizado utilizando placas de Petri, sendo inoculado em posições opostas discos de micélio (9 mm) de Trichoderma spp. e fungos filamentosos. Após a inoculação as placas permaneceram sob regime de 25 o C, à 12 horas de luz, por um período de sete dias. Após este período avaliou-se qualitativamente de acordo com a Escala de Bell et al. (1982), que consiste na adequação de notas para a porcentagem de área do meio de cultura sob de expressão do antagonismo. A maioria dos isolados de Trichoderma spp. expandiram na superfície da placa e nenhuma combinação ou repetição foi classificada pela nota 5, ou seja, nota dada ao fungo fitopatogênico quando completa o crescimento em toda a superfície do meio de cultura impedindo o crescimento de Trichoderma spp. Os isolados de Fusarium sp. e Bipolaris sp. testados tiveram seu crescimento fortemente inibido pelos isolados de Trichoderma spp. testados. O isolado de Aspergillus niger oriundo de feijão-porco, considerado um fungo um aerobionte parasita fraco oriundo, demostrou bastante variabilidade de interação antagônica com os isolados de Trichoderma. O isolado Alternaria oriundo de salsa foi o mais suscetível ao antagonismo promovido pelos isolados de Trichoderma spp. Este trabalho demonstrou o antagonismo diferencial de isolados de Trichoderma contra isolados de fungos. PALAVRA-CHAVE: confrontamento, fungos fitopatogênicos, controle biológico, Trichoderma spp.
  9. 9. viii ABSTRACT VAZ, M.C.A. Isolates Trichoderma spp. in front of plant pathogenic fungi and no plant pathogenic fungi in vitro assay. Final Paper. Urutaí, GO, 2015. The aim of this study was the antagonic growth of Trichoderma spp. with filamentous fungi. The Trichoderma spp. and filamentous fungi (Fusarium solani, Alternaria sp., Colletotrichum sp., Colletotrichum sp. and Aspergillus niger) were transferred patterns forming cultures aged 7 to 10 days cultured in potato dextrose agar (PDA). The confrontation was performed using Petri dishes, using PDA culture medium, and inoculating under the same mycelial disks in opposite position (9 mm) from Trichoderma spp. and filamentous fungi. After this was evaluated qualitatively according to the scale of Bell et al. (1982), which consists of the suitability scores for percentage of area in the culture medium of expression of antagonism. Most of Trichoderma spp. expanded on the plate surface and any combination or repetition was classified by grade 5, ie the score given when complete filamentous fungus growth on the entire surface of the culture medium by antagonism the growth of Trichoderma spp. Generalizing the isolates of Fusarium sp. and Bipolaris spp. tested had their growth strongly inhibited by Trichoderma spp. tested. The isolated from Aspergillus niger isolated jack bean, a fungus considered one airborn, slow parasite, demonstrated quite variability of antagonistic interaction with the tested Trichoderma isolates, not found for pathogenic fungi tested behavior. The isolated Alternaria isolated by parsley more susceptible to antagonism promoted by Trichoderma spp. This work demonstrated the antagonism by Trichoderma isolates against filamentous fungi. KEYWORD: confrontation, pathogenic fungi, biological control, Trichoderma spp.
  10. 10. 1 SUMÁRIO AGRADECIMENTOS..................................................................................................... v RESUMO ....................................................................................................................... vii ABSTRACT .................................................................................................................. viii LISTAGEM DE QUADROS ........................................................................................... 2 LISTAGEM DE TABELAS............................................................................................. 2 LISTAGEM DE FIGURAS ............................................................................................. 2 1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 3 2. REVISÃO LITERATURA........................................................................................... 5 2.1. O universo dos fungos e sua relação com a patogenicidade............................................. 5 2.2. O fungo Trichoderma ......................................................................................................... 5 2.3. Trichoderma como agente de controle biológico.............................................................. 6 2.4 Fungos Fitopatogênicos .................................................................................................... 11 3. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................... 12 3.1 Obtenção de isolados de Trichoderma spp....................................................................... 12 3.2. Obtenção e incubação de isolados de fungos filamentosos............................................ 13 3.3. Teste in vitro de pareamento entre fungos miceliados................................................... 14 3.4. Análise dos dados............................................................................................................. 15 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 17 5. CONCLUSÕES.......................................................................................................... 26 6. LITERATURA CITADA........................................................................................... 27
  11. 11. 2 LISTAGEM DE QUADROS Quadro 1. Avaliação qualitativa de acordo com a escala de Bell et al. (1982) do pareamento de isolados de Colletotrichum (Coll) oriundo de pinhão manso e Colletotrichum oriundo de pupunha com diferentes isolados de Trichoderma spp....... 18 Quadro 2. Avaliação qualitativa de acordo com a escala de Bell et al. (1982) do pareamento de isolados de Fusarium oriundo de pupunha e Bipolaris oriundo de braquiária com diferentes isolados de Trichoderma spp................................................ 20 Quadro 3. Análise de frequência dos resultados obtidos de acordo com a escala de Bell et al. (1982) para os isolados oriundos de Aspergillus niger feijão-de-porco e Alternaria salsa pareados com isolados de Trichoderma estudados................................................ 22 LISTAGEM DE TABELAS Tabela 1. Listagem de isolados de Trichoderma e suas hospedeiras de origem que foram utilizados nos pareamentos. ................................................................................. 13 LISTAGEM DE FIGURAS Figura 1. Pareamento de isolado de Alternaria sp. (acima e micélio marrom) com isolado de Trichoderma sp. (abaixo e micélio esverdeado). A produto comercial de formulação em pó; B. produto comercial de formulação emulsionável, C. cultura pareada de um isolado de Trichoderma (pupunha) com Alternaria sp.......................... 15 Figura 2. Exemplos de crescimentos miceliais pertencentes a diferentes notas de acordo com a escala de Bell et al. (1982). A. nota 1, B. nota 2, C. nota 3, D. nota 4. ............... 16 Figura 3. Porcentagem das classes de reação antagônica segundo a escala de Bell et al. (1982) para os diferente fungos filamentares. ................................................................ 25
  12. 12. 3 1. INTRODUÇÃO Um dos fungos utilizados para controle biológico pertence ao gênero Trichoderma sp. Pers. (1794), que tem relevante importância econômica para agricultura, e estes podem ser utilizados no controle de doenças em muitas plantas cultivadas, promovendo crescimento, tal como, induzindo a resistência de plantas a doenças (MOHAMED & HAGGAG, 2006). Como capacidade de degradar parede celular de outros fungos utilizando enzimas próprias, capacidade de produzir substâncias antifúngicas, possuem muitas estratégias de sobrevivência, que os torna competitivos e possuem alta proliferação na rizosfera (RESENDE et al., 2004; SAMUELS, 2006; BELL et al., 1982; CHET et al., 1997). As espécies de Trichoderma spp. (INDEX FUNGORUM, 2015) são oportunistas, simbiontes de plantas, grandes produtoras de antibióticos (KUMAR et al., 2012), competidores no solo, saprofíticas de solo (MOREIRA e SIQUEIRA, 2002), e muitas dessas espécies são antagonistas de outros fungos e bactérias, e isso inclui os fitopatógenos, com suas estruturas resistentes (AMORIM e PASCHOLATI, 2011), que são dificilmente atacadas por microrganismo (BEDENDO et al., 2011). Esses fungos possuem variadas formas de atuar que podem ser: antibiose, hiperparasitismo, competição e em outros casos pode ser através da promoção de crescimento (MELO, 1996). Lorito et al. (1996) aponta que essas características são fundamentais para utilizar os isolados como agentes de biocontrole. Os métodos de controle biológico devem ser baseados na seleção de microrganismos antagônicos, podendo ser in vitro ou in vivo. Os testes in vitro permitem conhecer o crescimento e os mecanismos de ação envolvidos, o que facilita observar interações entre o fungo antagônico e o fitopatógeno (LIU et al., 2009; LOUZADA et al., 2009; CARVALHO et al., 2011). A realização do biocontrole pode ser feita de forma indireta, através de competições por espaços e nichos de absorção de nutrientes, através da promoção do crescimento em plantas, ativação de mecanismos de defesa, produção de antibióticos ou por micopredatismo direto (AGRIOS, 1997; AMORIM et al., 2011).
  13. 13. 4 A grande importância nos processos de biocontrole depende, não exclusivamente do antagonista e sim dos tipos de cultivos e condições do ambiente como a disponibilidade de nutrientes, do pH, da temperatura e umidade. A ativação dos mecanismos está ligada a produção de metabólitos e outros compostos específicos como crescimento de plantas, enzimas hidrolíticas, antibióticos e permeases de carbonos e nitrogênio (BENITÉZ et al., 2004). A busca de alternativas mais sustentáveis de exploração dos recursos faz com que as táticas de controle químico sejam substituídas por opções tecnicamente apropriadas, economicamente viável e socialmente aceitáveis (MACEDO, 2000). Existem 55 produtos comerciais registrados no mundo que possuem como ingrediente ativo cepas de Trichoderma spp. (BETTIOL et al., 2012). Pode-se notar que o uso de produtos biológicos contra fitopatógenos vem sendo bastante estudados (KUMAR et al., 2012; CARVALHO et al., 2011; LIU et al., 2009; LOBO JUNIOR et al., 2009; LOUZADA, 2009; HOITINK et al., 2006; FOSTER, 1950), pois esses podem causar impactos ambientais, provocando sérios problemas para agricultores. O uso de agentes biocontroladores vem sendo testados, pois são produtos naturais sustentáveis que não agridem o meio ambiente. A maioria dos produtos comerciais que tem como i.a. Trichoderma spp. estão sendo liberados ou em fase de registro no MAPA (MAPA, 2014). Por isso a importância deste antagonista como alternativa sustentável para controle de fungos fitopatogênicos. Microorganismos fitopatógenos têm coexistido com plantas desde o início da agricultura, causando danos e perdas econômicas. Métodos tradicionais para o controle desses fitopatógenos tem sido a aplicação de pesticidas químicos e fungicidas, porém o uso dos agrotóxicos tem causado drásticos impactos ambientais. Uma das maneiras mais promissoras de conseguir que se tenha uma redução no uso desses químicos, até uma futura substituição, é a utilização de agentes de controle biológico (ACBs) (HOWELL, 2002; ZIMAND et al. 1996; VERMA et al. 2007). O objetivo do trabalho foi avaliar o antagonismo in vitro de isolados de Trichoderma spp. confrontando com fungos fitopatogênicos e não fitopatogênicos.
  14. 14. 5 2. REVISÃO LITERATURA 2.1. O universo dos fungos e sua relação com a patogenicidade Os fungos existentes na natureza podem expressar aspectos positivos. Na agricultura podem se valer do uso de cepas e isolados úteis para o controle biológico de outros fungos e outros microrganismos, insetos e pragas presentes no ambiente (YEDIDIA et al., 2001; PAULITZ, 1990), além disso, possuem a indescritível e essencial função de decomposição da matéria orgânica (MOREIRA e SIQUEIRA, 2002); e podem ainda associarem-se com raízes de plantas e ampliarem a capacidade de absorção de água e fixação de fósforo sendo representados pelas chamadas micorrizas (MOREIRA e SIQUEIRA, 2002; GRISI, 1995). Na indústria podem servir para produção de alimentos, biorremediadores (MONTIEL et al., 2004) substâncias essenciais para produção de medicamentos. Na biologia molecular (COX et al., 2002) são importantes fontes de manipulação de genes essenciais para diversas áreas do conhecimento. Sobre os malefícios provocados por fungos incluem o fato de produzirem substâncias alucinógenas, os fungos que infectam plantas vivas produzem fitotoxinas, além destas substâncias podem ainda produzir micotoxinas nos órgãos de reserva, e este grupo pode causar doenças e animais, vegetais e humanos. 2.2. O fungo Trichoderma O fungo Trichoderma harzianum foi descrito por Rifai, e sua descrição foi registrada em Mycological Papers volume 116, página 38 no ano de 1969 (INDEX FUNGORUM, 2015). É um fungo mitospórico pertencente ao Reino Fungi, pertence ao grupo dos fungos Mitospórico, sub-grupo Hifomicetos. Sua forma anamórfica pertence ao Reino Fungi, Divisão Ascomycota, Sub-divisão Pezizomycotina, Classe Sordariomycetes, Sub-classe Hypocreomycetidae, Ordem Hypocreales, Família Hypocreaceae.
  15. 15. 6 Este organismo não é um agente causal de doenças em plantas. O antagonismo de T. harzianum tem se destacado por Romeiro (2007) como agente de biocontrole contra inúmeros fungos fitopatogênicos. Uma das características deste gênero de fungo antagonista é o elevado antagonismos a um número elevado de fungos patogênicos e não patogênicos na natureza. Um dos pioneiros no desenvolvimento de metodologia para detecção e seleção de isolados para uso como candidatos para controle biológico foram os trabalhos desenvolvidos por Bell et al. (1982). O gênero Trichoderma apresenta 306 táxons descritos incluindo espécies variedades e formae speciales descritas em literatura, e destas existem 7 variedades e duas formae speciales (INDEX FUNGORUM, 2014). O micoparasitismo é um mecanismo que envolve antibiose e canibalismo que são provocados por enzimas hidrolíticas (quitinases, glucanases, proteases e lípases) que provocam a morte de um deles que irá servir de alimento para o outro que sobreviveu. Espécies de Trichoderma spp. enzimas hidrolíticas que possuem atividade deletéria contra fitopatógenos (MELO, 1996). Alem disso o gênero Trichoderma spp. podem prejudicar a viabilidade de fungos específicos como a Rhizoctonia solani (MAFIA et al., 2003). Já os hiperparasitas atacam hifas e estruturas de reprodução e sobrevivência do fitopatógeno, o que resulta na redução da infecção e do inoculo (BETTIOL,1991). No processo de micoparasitismo, a primeira barreira encontrada pelo fungo é a parede celular. A composição química da parede celular dos fungos é bastante complexa, constituídos principalmente por polissacarídeos, ligados ou não a proteínas ou lipídeos, polifosfatos e íons inorgânicos formando a matriz de cimentação. Quitina, glucanas, galactomananas, manoses e proteínas são compostas mais frequentes, embora sua quantidade varie entre as diferentes espécies de fungos (FUKUDA et al., 2009). 2.3. Trichoderma como agente de controle biológico Um dos primeiros artigos publicados sobre o uso de Trichoderma utilizados como agentes de controle biológico de plantas no Brasil ocorreu em 1950, onde Foster (1950), o qual descreve um tipo de inativação do vírus do mosaico do fumo (TMV) com filtrados da cultura do fungo Trichoderma sp. (BERTTIOL e MORANDI, 2009).
  16. 16. 7 Segundo Harman et al. (2004) espécies de Trichoderma spp. estão presentes no solo e são agentes de controle biológico bastante estudados e vendidos comercialmente como biopesticias, biofertilizantes ou inoculantes de solo. Essas espécies representam grande componente de diversidade de vida na terra, e esses números, variedades, papéis, e as interações de espécies de Trichoderma sp. no ambiente vêm sendo descobertas (SAMUELS, 2006). Os usos na agricultura além de controle de fitopatógenos, são: decomposição matéria orgânica, promoção de microflora competitiva e deletéria via colonização da rizosfera e da melhoria da sanidade das plantas durante os estádios de crescimento (HOWELL et al., 2000; HARMAM et al., 2004; HOITINIK et al., 2006). Os fungos das espécies de Trichoderma spp. são importantes saprófitas do solo, agem sobre estruturas especializadas de resistência. Esses fungos podem apresentar mecanismos que o conferem ação de atuarem como: antibiose, hiperparasitismo, competição e em alguns casos pode promover o crescimento (MELO, 1996). Segundo Altiere (2002), o solo possui uma diversidade biológica e é um componente importante para a sanidade e estabilidade do agroecossistema. A elevada diversidade de organismos é capaz de criar um sistema em que ocorra competição por fontes e nichos, e a existência da dinâmica predador/presa limitam populações de bactérias, fungos e nematoides fitopatogênicos, e também com os problemas causados por insetos. O controle de plantas daninhas de várias culturas utilizam moléculas químicas denominadas de herbicidas, que podem afetar o desenvolvimento de organismos não alvo, como é citado o caso de fungos antagonistas. Evidências de que estes herbicidas influenciam no crescimento ou em desenvolvimento de diversos fungos fitopatogênicos ou saprofíticos do solo foi verificado por Rosa et al. (2010). O fungo Trichoderma sp. vem sendo amplamente utilizado como agente antagonista no controle da uma ampla gama de fungos fitopatogênicos (GRIGOLETTI JR et al., 2000). O inóculo é encontrado naturalmente em solos de clima temperado e tropical, podem viver saprofiticamente ou até mesmo parasitando outros tipos de fungos (HARMAN et al., 2004).
  17. 17. 8 Os fungos do gênero Trichoderma possuem grande variedade antagônica que é baseada em ativações de arsenais bioquímicos de mecanismos variados, e isso possibilita uma potente atividade contra fungos fitopatogênicos, e também possuem capacidade de controlar um grande número de doenças que atacam plantas (ALUKO e HERRING, 1970). Várias empresas utilizam este fungo para formular produtos no Centro-Sul do Brasil. Mas o uso ainda se encontra restrito, e isso se deve à falta de informação sobre controle biológico de quem o produz, e esta torna o produto desacreditado no mercado de defensivos agrícolas (BERTTIOL e MORANDI, 2009). Vários fungos são usados como antagonistas em controle biológico como Ampelomyces quisqualis, Arthrobotrys spp., Aspergillus flavus, Clonostachys rosea, Gliocladium spp., Coniothyrium minitans, Hansfordia pulvinata, Myrothecium verrucaria, Paecilomyces spp., Phlebiopsis sp., Pochonia sp., Pseudozyma sp., Ulocladium oudemansii, fungos leveduriformes, Pythium oligandrum. No entanto, Trichodema spp. apresentam resultados promissores no controle de outros fungos fitopatogênicos. É imprescindível à capacidade reprodutiva, a habilidade de sobrevivência em condições que são desfavoráveis (AMORIM e PASCHOLATI, 2011), são eficientes para mobilizar e absorver nutrientes possui eficácia em promoções de enraizamentos de plântulas (CHAO et al., 1986; BAKER, 1988) e são agressivos à fungos patogênicos (CHET et al., 1997). Espécies do gênero Trichoderma spp. também são utilizados como base como bioprotetores comerciais, como comerciais temos Agrotrich® e o Trichodel® . O primeiro tem sua formulação via pó, sendo aplicado no substrato, semente, adubo ou no solo. O segundo é utilizado na forma líquida e pode ser incorporado ao substrato que irá ser utilizado ou pulverizado nas plantas (MACIEL et al., 2012) Trabalhos realizados com testes de confrontamento direto in vitro são importantes para selecionar variedades de isolados antagonistas, pois esses fornecem informações úteis sobre sua eficiência, variabilidade e suscetibilidade a fitopatógenos, expressos em condições controladas, e isso minimiza os efeito da temperatura, umidade e luminosidade, a microflora do solo (BELL et al., 1982). Esses ensaios garantem grandes vantagens para análise de um grande número de fungos com potencial antagônico, permitindo estudar o mecanismo de ação, facilitando a observação de
  18. 18. 9 interações entre o antagonista e o patógeno, em níveis ultra-estruturais, isso pode ser observado somente através da microscopia ótica ou eletrônica. Estes organismos que são selecionados in vitro servem também como uma grande fonte de genes que podem transformá-los em microrganismos não antagônicos (MARIANO, 1993). A aplicação massal de Trichoderma spp. que controlam os fitopatógenos, podem estimular mecanismos de resistência sistêmica adquirida. Mas esse efeito só é alcançado se forem obtidos formulações estáveis, que carregam uma grande quantidade de esporos viáveis, que possam ser competitivos no seu sítio de atuação representado pelo solo (LOBO JUNIOR et al., 2009). Um dos grandes alvos para demonstrar a eficiência do uso de agentes de controle biológico são os produtores e a assistência técnica, dada a eficiência imediatista apresentada por medidas de controle química no campo. A aplicação de um bioproduto no campo deverá seguir etapas essenciais como: i) Na dose o produto deverá apresenta o número de esporos (conídios) viáveis recomendados; ii) A viabilidade dos esporos não poderá ser comprometida, e esta deverá ser mantida sob condições adequadas; iii) solo úmido sem a incidência de raios solares e temperaturas entre 20 a 25 ºC são, geralmente, as condições ideais para o desenvolvimento do antagonista; iv) A eficiência de Trichoderma spp. é limitada sob temperaturas mais baixas, e nenhuma em solo seco; v) Garantias sobre a qualidade e viabilidade de esporos e a compatibilidade com insumos químicos são responsabilidades do fornecedor. Se necessários testes de quantidade e viabilidade de esporos podem ser feitos em laboratórios de empresas de pesquisa e universidades, com relativa facilidade. Alguns entusiastas pregam a eficiência ou vendem produtos para o controle biológico como solução definitiva para os patógenos de solo, o que definitivamente não ocorre. Dúvidas sobre a eficiência de formulações podem ser esclarecidas com testes no local, comparando o antagonista com uma testemunha (área sem aplicação do produto) para checar as reais diferenças de controle de doenças e rendimento das culturas. A dosagem mais eficiente para controle de um patógeno não é necessariamente a mais alta. Acima da dosagem ideal, a eficiência do controle biológico e a produtividade caem. Além disso, os custos de produção podem aumentar, já que o produtor está fazendo uso de mais um insumo (LOBO Jr et al., 2009).
  19. 19. 10 Berttiol et al. (2012) listaram 55 produtos comerciais registrados no mundo que possuem como ingrediente ativo como constituinte cepas de Trichoderma spp. Agroguard WG® (Trichoderma harzianum), Agrotrich e Agrotrich Plus® (mistura Trichoderma spp.), Antagon WP® (mistura Trichoderma spp.), Binab® (T. harzianum e T. polysporum), Bio-cure-F® (T. viridae), Bio Fit® (T. harzianum e T. virens), Bio Traz® (T. harzianum e T. virens), Bioderma® (T. viridae), Bioderma H® (T. harzianum), BioFungo® WP (T. harzianum ATCC52443), Bionitrongen G (T. harzianum, Glomus sp. e Bradyrhizobium japonicum), Biorend T® (T. harzianum e quitosana), Biotrich® (Trichoderma spp.), ECO-77® (T. harzianum cepa B77), ECO-T® (T. harzianum), Ecohope – Ecohope-Dry® (T. asperellum=T. atroviridae SKT-1 Ferm. P- 16510), Ecotrich ES® (T. harzianum), Esquive WP® (T. atroviridae isolado 11237), Fitotripen WP® (T. harzianum, T. koningii e T. viridae), FoliGuard® (T. harzianum), ICB Nutrisolo SC e WP® (T. viridae, T. harzianum, T. koningii e Trichoderma sp.), Lycomax® (T. harzianum), Micover Gold e Plus® (T. harzianum, Glomus intraradices e Pseudomonas sp.), Mycobac WP® (T. lignorum), Natibiol® (T. harzianum), Nicoderma® (T. viridae), Promot® WP(T. harzianum e T. koningii), Quality WG® (T. asperellum), RootShield® (T. harzianum KRL-AG2 (T-22))/PlantShield® (T. harzianum KRL-AG2 (T-22)), SentinelTM - Trichoprotection® (T. atroviridae LC52), SoilGard 12 G® (T. virens = Gliocladium virens GL-21), Trianum® (T. harzianum isolado T-22), Tricho® D WP (T. harzianum isolado T-22), Trichobiol® WP (T. lignorum), Trichodel® (Trichoderma spp.), Trichoderma harzianum® (T. harzianum), Trichodermax® EC (Trichoderma asperellum), Trichodermil® (T. harzianum cepas ESALQ-1306 e ESALQ-1303), Trichodermus® WP (T. harzianum), Trichogen® WP (T. lignorum), Trichol® (Trichoderma sp.), Trichomax® (Trichoderma sp.), Trichonat EF® (Trichoderma sp.), Trichonativa® (T. virens cepa Sherwood Nativa, T. harzianum cepa Queule Nativa e T. parceanamosum cepa Trailes Nativa), Trichoplus JCO® (Mix de isolados de Trichoderma spp. e T. harzianum (esporos, micélio e metabólitos)), Trichosav® (T. harzianum), Trichosoil® (T. harzianum), Trichozam® (Trichoderma spp.), Trichoteam® (Trichoderma sp.), Tricodamp® (Trichoderma sp.), Tricovab® (T. stomaticum), Trifender® (T. asperellum), Trifesol® (T. viridae 2684), Tusal® (T. harzianum e T. viridae) e VinevaxTM - Trichoprotection® (T. harzianum).
  20. 20. 11 Outros microrganismos que assim como Trichoderma são ingredientes ativos no mercado mundial de biocontrole (fungos, leveduras, bactérias e microalgas) de doenças de plantas são representados por Ampelomyces quisqualis, Arthrobotrys spp., Aspergillus flavus, Clonostachys rosea, Gliocladium spp., Coniothyrium minitans, Hansfordia pulvinata, Myrothecium verrucaria, Paecilomyces spp., Phlebiopsis sp., Pochonia sp., Pseudozyma sp., Ulocladium oudemansii, fungos leveduriformes, Pythium oligandrum, Agrobacterium radiobacter e Rhizobium radiobacter, Bacillus spp., Burkholderia cepacea, Pantoea agglomerans, Pseudomonas spp., Serratia phymuthica, Streptomyces sp. e microalgas. 2.4 Fungos Fitopatogênicos Os fungos estão entre os importantes agentes causais de doenças em plantas. Os fungos fitopatogênicos provocam doenças em plantas que podem causar sua morte. São compostos por um grupo numeroso de organismos, bastante diversificado morfologicamente e filogeneticamente. É um grupo heterogêneo, reunido diversas características básicas, permitindo assim sua distinção de outros seres vivos. Segundo Alexopoulos et al. (1996) essas características são: talo eucariótico (constituído por duas estruturas básicas assimilativas e reprodutivas), heterotrofismo, absorção de nutrientes e formação de esporos. A maioria dos fungos fitopatogênicos possui talo micelial, que é composto por filamentos tubulares denominadas hifas. As hifas podem ser septadas ou não septadas, podem sofrer modificações na morfologia. A estrutura básica de reprodução são os esporos, um propágulo especializado, microscópico, que contêm uma ou mais células. O esporo pode ter papel na sobrevivência do fungo. As características morfológicas do esporo variam, como tamanho, forma, coloração, septação, ornamentação da parede, etc. Os fungos possuem dois tipos de ciclo de vida, assexuado e sexuado. No ciclo assexuado os esporos são reproduzidos por mitose. E no ciclo sexuado reproduzem-se por meiose (AMORIM et al. 2011).
  21. 21. 12 3. MATERIAIS E MÉTODOS Os ensaios foram realizados no ano de 2014 no Laboratório de Microbiologia e Fitopatologia do Instituto Federal Goiano Câmpus Urutaí utilizando isolados pertencentes a Coleção Micológica de Referência. 3.1 Obtenção de isolados de Trichoderma spp. Quatorze isolados pertencentes a Coleção Micológica de Referência do IF Goiano Câmpus Urutaí foram obtidos a partir de isolamentos que tinham como fonte diferentes hospedeiros de origem. Estes isolados que estava conservados em sílica gel, foram repicados em placas de Petri de 90 mm de diâmetro, contendo meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA), para obtenção de culturas padrões, como 7-10 dias de crescimento, em regime de 25 o C e fotoperíodo de 12 horas de luz. A listagem de isolados de Trichoderma encontra-se na Tabela 1. Durante o pareamento foram utilizados como controle positivo, dois isolados de Trichoderma comerciais (Trichodermil SC 1306® e Quality WG® ) listados na Tabela 1. As matrizes de Trichoderma spp., foram cultivadas, em seguida foram recortados discos de 9 mm de diâmetro para serem depositados próximos as margens da placa de Petri contendo meio de cultura BDA.
  22. 22. 13 Tabela 1. Listagem de isolados de Trichoderma e suas hospedeiras de origem que foram utilizados nos pareamentos. Ord. Substrato de isolamento dos isolados de Trichoderma sp. 1 Soja (cód. Nd) 2 Algodão 3 Abacaxi (cód. 589) 4 Eucalipto (nd) 5 Algodãozinho (Cód. 210 ) 6 Milho (Cód. 15) 7 Jaca (nd) 8 Pupunha (nd) 9 Guatambu do Cerrado (Cód. 62 ) 10 Araticunzinho (Cód. 215) 11 Ficus (Cód. 208) 12 Sucupira (Cód. 563 ) 13 Trichoderma asperellum (Sólido - Qualiti WG®) (Cód. 597) 14 Trichoderma harzianum (líquido - Trichodermil SC1306®)(Cód. 588) Cód. Representa a numeração do registro do isolado cadastrado na coleção micológica. 3.2. Obtenção e incubação de isolados de fungos filamentosos A partir de culturas monospóricas repicadas em meio BDA, com objetivo de obtenção de matrizes dos isolados oriundos da coleção repicou-se: a) Fusarium solani - pupunha (Cód. 607); b) Alternaria sp. - salsa (Cód. 593); Colletotrichum gloeosporioides – pinhão manso (sem código); c) Colletotrichum gloeosporioides - pupunha (Cód. 067); d) Aspergillus niger – feijão-de-porco (Cód. 377). Destes os três isolados primeiros são fitopatogênicos e o último é não patogênico. Estes fungos que serviram como cepas matrizes para fornecimento de micélio, e após incubação por um período de 7-10 dias, a 25 o C sob fotoperíodo de 12 horas, discos foram recortados e depositados na lateral oposta a uma placa de Petri contendo meio BDA, sendo constituída de dois discos de micélio, um do antagonista (Trichoderma spp.) e outro de um fungo filamentoso.
  23. 23. 14 3.3. Teste in vitro de pareamento entre fungos miceliados O confrontamento foi realizado utilizando discos de micélio, com exceção do isolado de Aspergillus niger que utilizou-se o método de “Pescagem Direta” para inoculação das placas opostas aos isolados de Trichoderma. O experimento foi composto por duas repetições, representadas por 14 isolados de Trichoderma spp., combinados com cinco isolados de fungos fitopatogênicos e não fitopatogênicos pareados, totalizando um delineamento inteiramente casualizado, representado por 140 unidades experimentais, ou 140 placas de Petri contendo combinações de isolados de Trichoderma com isolados de fungos filamentosos. Avaliou-se o experimento utilizando a escala de Bell et al. (1982) para análise da proporção do antagonismo entre os dois fungos pareados em meio de cultura, que era representado por nota 1. O Trichoderma cresceu completamente sobre o fitopatógeno cobrindo a superfície do meio; nota 2. O Trichoderma cobriu pelo menos dois terços da superfície do meio de cultura; nota 3. O Trichoderma e patógeno cada um colonizou metade da placa de Petri, não havendo dominância dos microrganismos; nota 4. O patógeno colonizou pelo menos 2/3 da superfície do meio de cultura, sendo que o Trichoderma resiste a colonização; nota 5. O patógeno completou o crescimento do Trichoderma e ocupou toda a superfície do meio de cultura.
  24. 24. 15 A B C Figura 1. Pareamento de isolado de Alternaria sp. (acima e micélio marrom) com isolado de Trichoderma sp. (abaixo e micélio esverdeado). A. produto comercial de formulação em pó; B. produto comercial de formulação emulsionável, C. cultura pareada de um isolado de Trichoderma (pupunha) com Alternaria sp. 3.4. Análise dos dados Consistiu na interpretação qualitativa das notas e da frequência de repetições que apresentam classificações em diferentes notas analisadas por fungo fitopatogênico e não fitopatogênico (Fig. 2) e frequência de classificação das relações antagônicas entre os pares de isolados (Fig. 3).
  25. 25. 16 A B DC Figura 2. Exemplos de crescimentos miceliais pertencentes a diferentes notas de acordo com a escala de Bell et al. (1982). A. nota 1, B. nota 2, C. nota 3, D. nota 4. [Escala de Bell et al. (1982): Nota 1. O Trichoderma sp. cresceu completamente sobre o fungo filamentoso cobrindo a superfície do meio; Nota 2. O Trichoderma sp. cobriu pelo menos dois terços da superfície do meio de cultura; Nota 3. O Trichoderma sp. e o fungo filamentoso cada um colonizou metade da placa de Petri, não havendo dominância; Nota 4. O fungo filamentoso colonizou pelo menos 2/3 da superfície do meio de cultura, sendo que o Trichoderma sp. resiste a colonização;]
  26. 26. 17 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Embora sejam pertencentes ao mesmo gênero os dois isolados de fungos fitopatogênicos de Colletotrichum sp. apresentaram comportamentos diferenciais, sendo o isolado oriundo de pinhão-manso mais agressivo ao crescimento micelial do que aos isolados de Trichoderma oriundos de diferentes hospedeiros testados (Quadro 1). O isolado oriundo de pupunha sofreu maior efeito antagonista (Quadro 1). Os isolados de Trichoderma oriundos de araticunzinho e do produto comercial Quality® tiveram maior poder antagonista contra o isolado de Colletotrichum oriundo de Pupunha (Quadro 1). Não houve reação de antagonismo dentre os isolados de Trichoderma spp. testados quando pareados com Colletotrichum isolado de pinhão manso (Quadro 1).
  27. 27. 18 Combinações 1 2 3 4 5 Coll Pinhao Manso x Trichoderma Algodãozinho 0 0 0 2 0 Coll Pinhao Manso x Trichoderma Eucalipto 0 0 0 2 0 Coll Pinhao Manso x Trichoderma Guatambu do Cerrado 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Sucupira 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Soja 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Algodão 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Abacaxi 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Jaca 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Ficus 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Pupunha 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Araticunzinho 0 0 1 1 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Sólido 0 0 1 1 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Líquido 0 0 0 2 0 Coll Pinhão Manso x Trichoderma Milho 0 0 0 2 0 Coll Pupunha x Trichoderma Algodão 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Pupunha 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Sólido 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Lìquido 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Milho 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Sucupira 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Algodãozinho 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Abacaxi 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Eucalipto 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Jaca 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Ficus 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Guatambu do Cerrado 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Araticunzinho 0 2 0 0 0 Coll Pupunha x Trichoderma Soja 0 2 0 0 0 Isolado1Isolado2 Quadro 1. Avaliação qualitativa de acordo com a escala de Bell et al. (1982) do pareamento de isolados de Colletotrichum (Coll) oriundo de pinhão manso e Colletotrichum oriundo de pupunha com diferentes isolados de Trichoderma spp. Escala de Bell et al. (1982): Nota 1. O Trichoderma sp. cresceu completamente sobre o fungo filamentoso cobrindo a superfície do meio; Nota 2. O Trichoderma sp. cobriu pelo menos dois terços da superfície do meio de cultura; Nota 3. O Trichoderma sp. e o fungo filamentoso cada um colonizou metade da placa de Petri, não havendo dominância; Nota 4. O fungo filamentoso colonizou pelo menos 2/3 da superfície do meio de cultura, sendo que o Trichoderma sp. resiste a colonização; Nota 5. O fungo filamentoso completou o crescimento ocupando toda superfície da placa contendo o meio de cultura.
  28. 28. 19 Generalizando os isolados de Fusarium sp. e Bipolaris sp. testados tiveram seu crescimento fortemente inibido pelos isolados de Trichoderma spp. testados (Quadro 2). Isto equivale, ao considerarmos a área de ocupação do meio de cultura pelos pares, o Trichodema cresceu sobre a área 66,6% (44,4 % para Fusarium sp.), ou seja, inibiu o crescimento do fitopatógeno (Quadro 2). Quanto ao Trichoderma oriundo de algodãozinho e Fusarium oriundo de pupunha, o antagonista cresceu em 100 % da área inibindo totalmente o crescimento do fitopatógeno (Quadro 2). O isolado Bipolaris sp. oriundo de braquiária o fungo Trichoderma sp. ocupou 66,6 % da área do meio de cultura, inibindo o crescimento do fitopatógeno (Quadro 2). Diferencialmente os isolados de Trichoderma sp. oriundo de eucalipto e abacaxi cresceram 100 % da área, inibindo a totalidade o crescimento do fitopatógeno (Quadro 2).
  29. 29. 20 Quadro 2. Avaliação qualitativa de acordo com a escala de Bell et al. (1982) do pareamento de isolados de Fusarium oriundo de pupunha e Bipolaris oriundo de braquiária com diferentes isolados de Trichoderma spp. Escala de Bell et al. (1982): Nota 1. O Trichoderma sp. cresceu completamente sobre o fungo filamentoso cobrindo a superfície do meio; Nota 2. O Trichoderma sp. cobriu pelo menos dois terços da superfície do meio de cultura; Nota 3. O Trichoderma sp. e o fungo filamentoso cada um colonizou metade da placa de Petri, não havendo dominância; Nota 4. O fungo filamentoso colonizou pelo menos 2/3 da superfície do meio de cultura, sendo que o Trichoderma sp. resiste a colonização; Nota 5. O fungo filamentoso completou o crescimento ocupando toda superfície da placa contendo o meio de cultura. Combinações 1 2 3 4 5 Fusarium Pupunha x Trichoderma Jaca 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Milho 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Araticunzinho 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma T. Líquido 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Abacaxi 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Soja 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Algodãozinho 2 0 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Sucupira 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Pupunha 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Ficus 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Guatambu do Cerrado 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma T.Sólido 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma A lgodão 0 2 0 0 0 Fusarium Pupunha x Trichoderma Eucalipto 0 2 0 0 0 Bipalares Braquiaria x Trichoderma T . Sólido 0 2 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Guatambu do Cerrado 0 2 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Ficus sp 0 2 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Algodão 0 2 0 0 0 Bipalares Braquiaria x Trichoderma Pupunha 0 2 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Araticunzinho 0 2 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Sucupira 0 2 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma T. Líquido 0 2 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Abacaxi 2 0 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Eucalipto 2 0 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Jaca 0 2 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Soja 0 1 1 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Algodãozinho 2 0 0 0 0 Bipolares Braquiaria x Trichoderma Milho 0 2 0 0 0 Isolado3Isolado4
  30. 30. 21 O isolado de Aspergillus niger oriundo de feijão-porco, considerado um fungo um aerobionte parasita fraco (AMORIM e PASCHOLATI, 2011) oriundo, demostrou bastante variabilidade de interação antagônica com os isolados de Trichoderma testados, comportamento não encontrados para os fungos fitopatogênicos testados. Ressalvando as variações de antagonismo, o isolado Trichoderma sp. cresceu numa superfície do meio de cultura de 66,6% na maioria nos pareamentos, inibindo o crescimento de Aspergillus niger e Alternaria sp. (Quadro 3). O isolado denominado de Trichoderma Solido isolado do produto comercial Qualiti WG® apresentou uma variação em seu antagonismo onde Aspergillus niger oriundo de feijão-de-porco colonizou 66,6 % da placa inibindo ação do Trichoderma que resistiu a colonização (Quadro 3). Em relação ao Trichoderma do algodãozinho, soja e Ficus sp. o antagonista e Aspergillus niger oriundo de feijão-de-porco ocuparam uma área de meio de cultivo de 50 % (Quadro 3). O isolado Alternaria oriundo de salsa foi o mais suscetível ao antagonismo promovido pelos isolados de Trichoderma spp. (Quadro 3). Os isolados de Trichoderma sp. oriundos de abacaxi, fícus, araticunzinho, eucalipto, T. Liquido (Trichodermil SC1306®), soja, T. Sólido (Qualiti WG®), milho e algodão) ocuparam uma área da superfície do meio de cultura de 66,6 % da placa e os outros 33,3% foram colonizados por Alternaria sp. (Quadro 3).
  31. 31. 22 Quadro 3. Análise de frequência dos resultados obtidos de acordo com a escala de Bell et al. (1982) para os isolados oriundos de Aspergillus niger feijão-de-porco e Alternaria salsa pareados com isolados de Trichoderma estudados. Escala de Bell et al. (1982): Nota 1. O Trichoderma sp. cresceu completamente sobre o fungo filamentoso cobrindo a superfície do meio; Nota 2. O Trichoderma sp. cobriu pelo menos dois terços da superfície do meio de cultura; Nota 3. O Trichoderma sp. e o fungo filamentoso cada um colonizou metade da placa de Petri, não havendo dominância; Nota 4. O fungo filamentoso colonizou pelo menos 2/3 da superfície do meio de cultura, sendo que o Trichoderma sp. resiste a colonização; Nota 5. O fungo filamentoso completou o crescimento ocupando toda superfície da placa contendo o meio de cultura. Combinações 1 2 3 4 5 Asp . Niger F. Porco x Trichoderma Guatambu do Cerrado 0 2 0 0 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma T. Sólido 0 1 0 1 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma Araticunzinho 0 2 0 0 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma Algodão 0 0 2 0 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma Sucupira 0 2 0 0 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma Algodãozinho 0 0 2 0 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma Eucalipto 0 2 0 0 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma T. Líquido 0 2 0 0 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma Soja 0 0 2 0 0 Asp. Niger F. Porco x Trichoderma Pupunha 0 2 0 0 0 Asp . Niger F. Porco x Trichoderma Jaca 0 2 0 0 0 Asp . Niger F. Porco x Trichoderma Milho 0 2 0 0 0 Asp . Niger F. Porco x Trichoderma Ficus sp 0 0 2 0 0 Asp . Niger F. Porco x Trichoderma Abacaxi 1 1 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Algodãozinho 2 0 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Guatambu do Cerrado 2 0 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Ficus sp 0 2 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Araticunzinho 0 2 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Abacaxi 2 0 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Eucalipto 1 1 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Pupunha 2 0 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma T. Líquido 0 2 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Soja 0 2 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Jaca 2 0 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma T. Sólido 0 2 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Milho 0 2 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Sucupira 2 0 0 0 0 Alternaria Salsa x Trichoderma Algodão 0 2 0 0 0 Isolado5Isolado6
  32. 32. 23 O antagonismo de Trichoderma spp. é explicado pela produção de antibióticos, de amplo espectro, tais como gliotoxina, viridina, trichodermina, suzucacilina, alameticina e dermadina, que têm a capacidade de inibir o desenvolvimento de outros fungos (DENNIS; WEBSTER, 1971). Além de antibióticos, esse microrganismo produz enzimas, como celulase e hemicelulase, as quais degradam materiais lignocelulolíticos e causam lise na parede de células de fungos patogênicos (MELO, 1996). A maioria dos isolados de Trichoderma spp. expandiram na superfície da placa e nenhuma combinação ou repetição foi classificada pela nota 5, ou seja, nota dada ao fungo filamentoso quando completa o crescimento em toda a superfície do meio de cultura impedindo o crescimento de Trichoderma spp. (Quadros 1, 2 e 3). Os isolados de Trichoderma vendidos e comercializados (denominados de T sólido e T líquido) não expressaram nem apresentaram destaque no antagonismo (Quadros 1, 2 e 3). Não houve o melhor isolado de Trichoderma spp. com efeito antagonista sobre Colletotrichum oriundo de pinhão manso e pupunha (Quadro 1). Para o isolado de Fusarium oriundo de pupunha, o melhor isolado de Trichoderma sp. com efeito antagônico foi o isolado oriundo de algodãozinho (Quadro 2). Para o isolado de Bipolaris oriundo de braquiária, os melhores isolados de Trichoderma sp. com efeito antagônico foram os isolados oriundos de abacaxi e eucalipto (Quadro 2). Para o isolado de Aspergillus niger oriundo de feijão-de-porco, o melhor isolado de Trichoderma sp. com efeito antagônico foi o isolado oriundo de abacaxi (Quadro 3). Para o isolado de Alternaria sp. oriundo de salsa, os melhores isolados de Trichoderma sp. com efeitos antagônicos foram os isolados de abacaxi (Quadro 3). O antagonismo de Trichoderma spp. é explicado pela produção de antibióticos, de amplo espectro, tais como gliotoxina, viridina, trichodermina, suzucacilina, alameticina e dermadina, que têm a capacidade de inibir o desenvolvimento de outros fungos (DENNIS; WEBSTER, 1971). Além de antibióticos, esse microrganismo produz enzimas, como celulase e hemicelulase, as quais degradam materiais lignocelulolíticos e causam lise na parede de células de fungos patogênicos (MELO, 1996).
  33. 33. 24 Para os cinco isolados de fungos fitopatogênicos e não fitopatogênicos confrontados com isolados de Trichoderma a maioria teve seu crescimento inibido em 75%, com exceção do isolado de Colletotrichum sp. oriundo de pinhão manso (Figura 3).
  34. 34. 25 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 %deplacaspertencentesasnotas Escala de Bell et al. (1982) Colletotrichum sp. - Pupunha 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 %deplacaspertencentesasnotas Escala de Bell et al. (1982) Fusarium pupunha 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1 2 3 4 5 %deplacaspertencentesasnotas Escala de Bell et al. (1982) Bipolaris - braquiaria Figura 3. Porcentagem das classes de reação antagônica segundo a escala de Bell et al. (1982) para os diferente fungos fitopatogênicos e não fitopatogênico.
  35. 35. 26 5. CONCLUSÕES A maioria dos isolados de Trichoderma spp. expandiram na superfície da placa e nenhuma combinação ou repetição foi classificada pela nota 5, ou seja, nota dada ao fungo filamentoso quando completa o crescimento em toda a superfície do meio de cultura impedindo o crescimento de Trichoderma spp. Generalizando os isolados de Fusarium sp. e Bipolaris sp. testados tiveram seu crescimento fortemente inibido pelos isolados de Trichoderma spp. testados. O isolado de Aspergillus niger oriundo de feijão-porco, considerado um fungo um aerobionte parasita fraco oriundo, demostrou bastante variabilidade de interação antagônica com os isolados de Trichoderma testados, comportamento não encontrados para os fungos fitopatogênicos testados. Não houve o melhor isolado de Trichoderma spp. com efeito antagonista sobre Colletotrichum oriundo de pinhão manso e pupunha. Para o isolado de Fusarium oriundo de pupunha, o melhor isolado de Trichoderma sp. com efeito antagônico foi o isolado oriundo de algodãozinho. Para o isolado de Bipolaris oriundo de braquiária, os melhores isolados de Trichoderma sp. com efeito antagônico foram os isolados oriundos de abacaxi e eucalipto. Para o isolado de Aspergillus niger oriundo de feijão- de-porco, o melhor isolado de Trichoderma sp. com efeito antagônico foi o isolado oriundo de abacaxi. Para o isolado de Alternaria sp. oriundo de salsa, os melhores isolados de Trichoderma sp. com efeitos antagônicos foram os isolados de abacaxi. O isolado Alternaria oriundo de salsa foi o mais suscetível ao antagonismo promovido pelos isolados de Trichoderma spp.
  36. 36. 27 6. LITERATURA CITADA AGRIOS, G.N. Plant pathology. 4a Ed., Academic Press. 1997. 606p. ALEXOPOULOS, C.J.; MIMS, C.W.; LACKWELL,M. Introductory Micology. 4a ed. New York, Willey,1996. ALTIERI. M. Agroecologia: Bases Científicas para uma Agricultura Sustentável. Guaíba: Editora Agropecuária, 2002. 592 p. ALUKO, M. O.; HERRING, T. F. The mechanisms associated with the antagonistc relationship between Corticium solani and Gliocladium virens. Transcritions of the British Mycological Society, Great Britain, v. 55, p. 173 – 179, 1970). AMORIM, L. e PASCHOLATI, S.F. Ciclo das relações patógeno hospedeiro. In: AMORIM, L. REZENDE, J.A.M., BERGAMIN FILHO, A. Manual de fitopatologia, volume 1, Editora Agronômica Ceres, São Paulo, SP, 2011. AMORIM, L., REZENDE, J.A.M., BERGAMIN FILHO, A. Manual de Fitopatologia - princípio e conceitos, vol 1., 4a. Ed. Editora Agronômica Ceres, São Paulo, SP, 2011. BAKER, R. Trichoderma spp. as plant growth stimulants. Critical Reviews in Biotechnology, Boca Raton, v. 7, n. 1, p. 97-105, Jan. 1988. BEDENDO, I.P., MASSOLA JUNIOR, N.S., AMORIM, L. Controles cultural, físico e biológico de doenças de plantas. In: AMORIM, L. REZENDE, J.A.M., BERGAMIN FILHO, A. Manual de fitopatologia, volume 1, Editora Agronômica Ceres, São Paulo, SP, 2011. BELL, D.K., WELLS, H.D. & MARKHAM, C. R. 1982. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathology 72(4):379- 382. BENITEZ, T.; RINCÓN, A.M.; LIMÓN, M.C.; CODÓN, A.C. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. International Microbiology, Madrid, v.7, nº 4, p. 249-260. 2004. BERTTIOL, W., MORANDI, M.A.B., PINTO, Z.V., PAULA JUNIOR, T. J., CORRÊA, E.B., MOURA, A.B., LUCON, C.M.M., COSTA, J.C.B, BEZERRA, J.L. Produtos Comerciais à Base de Agentes de Biocontrole de Doenças de Plantas. Disponível em: <http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/66628/1/Doc-88- 1.pdf>, Documentos 88, Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, SP, 2012. BERTTIOL, W.; MORANDI, M.A. B. Biocontrole de Doenças de Plantas: Uso e Perspectivas. Embrapa Meio Ambiente. Jaguariúna SP. 2009. BUENO, C. J.; FISCHER, I. H. Manejo de Fungos Fitopatogênicos habitantes do solo. Disponível em: <http:/www.aptaregional.sp.gov.br/artigo.php?id_artigo=459> Acesso em 20 de março de 2015. CARVALHO, D.D.C.; MELLO, S. C. M.; LOBO JUNIOR, M.; SILVA, M. C. Control of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli in vitro and on seeds and growth promotion of common bean in early stages by Trichoderma harzianum. Tropical Plant Pathology, v.36, n.1, p.28-34, 2011.
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