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SILVA, J.

  1. 1. Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. SELEÇÃO IN VITRO POPULAÇÕES DE MICRORGANISMOS ANTAGONISTAS E RELACIONAMENTO CONTRA A FUSARIOSE-DO-FEIJOEIRO (Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli) Jakelinny Martins Silva1 , Lucimeris Ruaro2 , Guilherme Malafaia1 , Milton Luiz da Paz-Lima1* RESUMO: O objetivo deste trabalho foi obter e selecionar in vitro populações de microrganismos antagonistas e efeito contra a fusariose-do-feijoeiro. Dezoito isolados de leveduras e bactérias de solo e isolados de fungos fitopatogênicos representados por Alternaria solani, Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli e Lasiodiplodia theobromae foram avaliados. As cultivares foram cultivadas nos tratamentos: 1) testemunha, 2) feijão inoculado com levedura, 3) feijão inoculado com Fusarium sp. 4) feijão inoculado com levedura e Fusarium sp. No teste in vitro, dos 18 isolados antagonistas, 13 inibiram A. solani, 2 inibiram Fusarium sp. e 1 foi antagonista à L. theobromae. O isolado C17 foi o isolado que apresentou maior antagonista, sendo pré-selecionado para testes in vivo. No teste in vivo, demonstrou que a levedura apresentou efeito de promoção de crescimento, não demonstrando interação para controle de doença, demonstrado pelos parâmetros de produção. Portanto, supõe-se que a levedura C17 pode atuar como promotora de crescimento. Através desse trabalho foi possível identificar isolado potencial para estudos de controle biológico no campo e seu uso nas interações vegetais, reduzindo a aplicação de adubos químicos na agricultura. Palavras-chave: antagonismo, microbiolização; Phaseolus vulgaris. ABSTRACT: The objective of this study was to obtain and select populations of antagonistic microorganisms in vitro and your effect against Fusarium bean. Eighteen isolates of yeasts and bacteria from soil, and isolates from plant pathogenic fungi represented by Alternaria solani, Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli and Lasiodiplodia theobromae were analyzed. The cultivars were grown in treatments: 1) control, 2) bean inoculated with yeast, 3) bean inoculated with Fusarium sp., 4) beans inoculated with yeast and Fusarium sp. In in vitro tests, of 18 antagonistic isolates, 13 inhibited A. solani, 2 inhibed Fusarium sp. and one inhibited L. theobromae. The isolate C17 was the one that showed higher antagonist, being choiced for testing in vivo. The in vivo test showed that the yeast was most effective in growth promoting, showing no interaction for disease control, demonstrated by the production parameters. Therefore, it is assumed that the yeast C17 can act as a growth promoter. Through this work it was possible to identify isolated potential for biological control studies in the field and your use in plant interactions reducing the use of chemical fertilizers in agriculture. Key-words: antagonism, microbiolization; Phaseolus vulgaris. ____________________________________________________________________________________________________ 1 Instituto Federal Goiano – Campus Urutaí. Rodovia Geraldo Silva nascimento, km 2,5, Zona Rural. CEP: 75.790-000, Urutaí, GO. *E-mail: fitolima@gmail.com. Autor para correspondência. 2 Setor de Ciências Agrárias, Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, Rua dos Funcionários, 1540, Bairro Juvevê, CEP 80035 - 050, Curitiba, PR. Recebido em: 01/03/2014.Aprovado em: 11/03/2015.
  2. 2. J. M. Silva et al. 97 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. INTRODUÇÃO Na natureza, as populações de microrganismos interagem com outras populações e representam o repertório mais rico em diversidade química e molecular, constituindo a base de processos ecológicos, como os ciclos biogeoquímicos, além de manterem relações vitais entre si e com os organismos “superiores” (ZILLI et al., 2003). Assim, a diversidade microbiana é importante em diversos processos como, por exemplo, na decomposição da matéria orgânica (MO), ciclagem de nutrientes, agregação do solo, equilíbrio ecológico e consequente controle de fitopatógenos (KENNEDY, 1999). Os fungos apresentam-se como um grupo amplo e diverso (MOREIRA; SIQUEIRA, 2008), e possuem distribuição cosmopolita, sendo a maioria as pluricelulares, exceto às leveduras (AMORIM et al., 2011). A maioria dos registros e descrições apontam, aproximadamente, 100.000 espécies de fungos conhecidos e que possuem modo de vida saprofítico; em torno de 8.000 causam doenças em uma ou mais espécies vegetais agrupando os fungos fitopatogênicos (MANFIO, 2000). Os fungos fitopatogênicos podem causar redução da taxa de crescimento e desenvolvimento da planta, motivada por danos na parte área, caule ou sistema radicular, influenciando na diminuição e qualidade dos produtos (ISAAC, 1992). Nos últimos anos, tem-se notado uma crescente preocupação, em todo o mundo, com os problemas ambientais decorrentes das diversas atividades humanas, incluindo a agricultura (BENÍTEZ et al., 2004). A proteção de plantas por meio do uso de agrotóxicos apresenta características atraentes, como a simplicidade, a previsibilidade e a necessidade de pouco entendimento dos processos básicos do agroecossistema para a sua aplicação. Essa simplificação interessa basicamente à comercialização de insumos que interferem em muitas espécies e consequentemente desequilibram o sistema (BETTIOL, 2008). O uso intensivo de agrotóxicos para controle de doenças, pragas e plantas invasoras na agricultura, tem, reconhecidamente, promovido diversos problemas de ordem ambiental, como a contaminação de alimentos, do solo, da água e dos animais; a intoxicação de agricultores; resistência de patógenos, pragas e plantas invasoras e certos princípios ativos de agrotóxicos; surgimento de doenças iatrogênicas (as que ocorrem, devido ao uso de agrotóxicos); o desequilíbrio ecológico, alterando a ciclagem de nutrientes e matéria orgânica; a eliminação de organismos benéficos; a redução da biodiversidade, dentre outros (ZILLI et al, 2003). O conhecimento sobre microrganismos como agentes de controle de pragas e doenças de plantas foram revelados há centenas de anos. Uma das funções que envolvem a população dos microrganismos não fitopatogênicos habitantes da filosfera, rizosfera e espermosfera está relacionada com a interferência no desenvolvimento de fitopatógenos (LUZ, 1991). Em Fitopatologia, o controle biológico visa o emprego de microrganismos antagonistas no controle das doenças de plantas (BETTIOL; GHINI, 2003). O uso do controle biológico em substituição ao químico é dependente da disponibilidade e da efetividade dos agentes de biocontrole, bem como dos produtos comerciais, contendo estes microrganismos. Entretanto, até o momento, vem crescendo a autorização para liberação, principalmente, de produtos biológicos disponíveis no mercado (Quality®, Organic CS® e Trichodel®, para essa modalidade de controle (LOPES, 2001). Os testes in vitro possuem as vantagens de possibilitar a análise de grande número de potenciais antagonistas, permitir o estudo do mecanismo de ação e facilitar a observação das interações contra fitopatógenos. Além disso, os organismos selecionados in vitro podem servir como fonte de genes para transformação de
  3. 3. Seleção in vitro populações de... 98 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. microrganismos não antagônicos (MARIANO, 1993). A mucha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli) ocasionada por um patógeno de solo, que tem sua agressividade expressa em maior potencial em condições de compactação ou desbalanço nutricional do solo, é considerada uma importante doença na cultura do feijoeiro, tendo seu controle promovido somente por estratégias de manejo cultural (RAVA et al., 1996). O agente causal da murcha ou amarelecimento-de-Fusarium é o fungo Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli. O primeiro relato da doença ocorreu em 1929, em campos de feijão localizados no Vale de Sacramento, na Califórnia, EUA, tendo reaparecido na mesma área entre 1933 e 1940, quando foi cultivado o feijoeiro novamente. Especificamente no caso do Brasil, os primeiros a relatarem a doença aconteceram no município de Laranjal Paulista - SP. Posteriormente, foi diagnosticada em campos de feijão tipo vagem, ainda no estado de São Paulo, provenientes de Juquiá, Cosmópolis, Campinas, Itariri e Mogi Guaçu (ITO, 2004). Essa preocupação é resultado da busca por tecnologias de produção rentáveis, socialmente justas e com um enfoque ecológico eminente. Para responder a esta demanda, soluções têm sido desenvolvidas pela pesquisa científica apoiadas em processos biológicos naturais. Deste modo, o controle biológico da murcha-de-fusarium do feijoeiro constitui alternativa cada vez mais importante, para minimizar o impacto desta doença nos campos de produção, uma vez que, na agricultura convencional, vem utilizando de forma complementar, contribuindo para a redução do uso dos agrotóxicos, enquanto na agricultura orgânica, insere-se como uma alternativa real e consciente para sustentabilidade do sistema de produção agrícola (BENÍTEZ et al. 2004). O objetivo deste trabalho foi obter e selecionar in vitro populações de microrganismos antagonistas e efeito contra a fusariose do feijoeiro. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido na Fazenda Palmital (Rodovia Geraldo Silva Nascimento, Km 2,5, 17º29’07” latitude sul, 48º12’32” longitude oeste, 724m de altitude), no Laboratório de Microbiologia e no telado da área da fruticultura do Instituto Federal Goiano câmpus Urutaí, localizado na cidade de Urutaí, GO. Foram coletadas amostras de solo, de diferentes locais com sistemas de uso do solo distintos: mata com intervenção antrópica (código M), pastagem com plantio predominante de capim braquiária havendo a presença de animais (código P) e campo cultivado com cultivo de milho, feijão, trigo e tigueras de soja. Para coleta dessas amostras de solo, foi utilizado um trado tipo caneco para coletar o solo de áreas de M, P e C, separadamente em um balde, as amostras foram homogeneizadas, adicionadas a peneira de malha de dois milímetros para separar o solo e os materiais indesejáveis como, por exemplo, folhas e pedaços de galhos das árvores. As amostras foram armazenadas em um saco plástico e identificadas de acordo com sua procedência (M, P e C). No processamento microbiológico, foi utilizada a técnica de diluição em série e riscagem em placas de Petri. Os tratamentos foram inoculados em meio de cultura batata- dextrose-ágar (BDA), com auxílio de alça de Drigalski e incubados em temperatura ambiente (25ºC) por cinco dias. Em seguida, as colônias de leveduras e bactérias de crescimento isolado foram repicadas e isoladas para uma placa de Petri contendo meio BDA. A coleção montada foi devidamente depositada na Coleção Micológica de Referência do IFGoiano. Foram utilizados três isolados de fungos fitopatogênicos (Alternaria solani, Lasiodiplodia theobromae e Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli ) e 18 isolados de leveduras e bactérias de solo pertencentes a coleção microbiológica do IF Goiano câmpus Urutaí. Os isolados de leveduras de solo utilizados foram: Solos de mata (M05, M20 e
  4. 4. J. M. Silva et al. 99 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. M22), solos de pastagem (P01, P03, P05, P06, P13, P20 e P22) e solos de campo cultivado (C01, C07, C17, C18, C19 e C23) e bactérias de solo: solo de mata (M21) e solo de pastagem (P08). Estes isolados foram repicados em meio de cultura BDA (batata- dextrose-ágar) e utilizados nos testes de antagonismo. Inicialmente, foram depositados discos de micélio (9 mm de diâmetro) do isolado fúngico fitopatogênico ao centro da placa de Petri, contendo meio BDA, e em seguida, utilizando o método da riscagem por “cerqueamento", foram plaqueados 18 isolados de leveduras e bactérias do solo ao redor do disco de micélio. O experimento de seleção in vitro dos isolados de leveduras contra L. theobromae, A. solani e Fusarium sp. foi representado por 54 tratamentos (3 fungos fitopatogênicos e 18 leveduras e bactérias), duas repetições, uma testemunha para cada isolado fitopatogênico (sem cerqueamento com levedura), sob delineamento inteiramente casualizado, no esquema fatorial. Foi avaliado o crescimento micelial do fitopatógeno (mm), crescimento fúngico (%), a inibição do crescimento micelial (%) e ação antagônica entre leveduras e bactérias do solo sobre o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos (+ e -). O crescimento micelial do fitopatógeno foi obtido, medindo-se com a régua o diâmetro da colônia aos 12 dias após a inoculação. A inibição do crescimento micelial (%) foi obtida, medindo-se o diâmetro de crescimento da colônia fúngica na placa de Petri, contendo os tratamentos e comparando- a com o diâmetro da colônia da testemunha, resultando num valor em porcentagem obtido por regra de três aos 12 dias após a inoculação representado a seguir: ICM= 100 – %CF onde: ICM = Inibição do crescimento micelial %CF = Valor do crescimento fúngico (%) O crescimento fúngico (%) foi calculado utilizando a seguinte fórmula: %CF = (DCF x 100) / 90 onde: %CF = Valor do crescimento fúngico (%) DCF = Diâmetro da colônia fúngica (mm) A ação antagônica foi avaliada em positiva (quando o crescimento micelial do fitopatógeno ultrapassou a barreira formada pela levedura) e negativa (quando o crescimento micelial do fitopatógeno encontrava-se dentro dos limites formados pela colônia de levedura). O isolado que apresentou maior percentual de inibição de crescimento dos fitopatógenos foi selecionado para testes in vivo que representa a próxima etapa deste trabalho. Os resultados obtidos foram analisados através de análise de variância, Teste de Tukey, a 5% de probabilidade, com auxílio do programa de comparação de médias Assistat. Antagonismo contra a fusariose do feijoeiro em telado O experimento foi conduzido no viveiro onde sementes de feijão pertencentes a cultivar BRS Executivo e Pérola foram plantadas, e cultivadas em vasos (contendo 5 L de solo e 3 plantas por vaso) repletos com 3 partes de terra de barranco e 1 parte de areia peneirada e 1 parte de húmus, formando um substrato que, posteriormente, a mistura do solo fumigada. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados representados por quatro tratamentos aplicados para a cultivar BRS Executivo e Pérola, sob cinco repetições, representados por: Tratamento 1 – Feijão, Tratamento 2 – Feijão inoculado com Levedura (isolado C17), Tratamento 3 – Feijão inoculado com isolado fitopatogênico de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, Tratamento 4 – Feijão inoculado com Levedura (C17) e também inoculado com Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. O isolado de Fusarium oxysporum f. sp. Phaseoli, foi coletado em plantas de feijoeiro oriundas de campos de
  5. 5. Seleção in vitro populações de... 100 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. produção localizados na cidade de Cristalina, GO, no ano de 2012. As sementes dos tratamentos 2 e 4 foram microbiolizadas com uma solução de leveduras (1,2 x 105 ascósporos/mL) imersas na solução de leveduras C17 por um tempo aproximado de 15 minutos. Os tratamentos 3 e 4 receberam 2 discos de micélios contendo o isolado de Fusarium sp. em cada cova de plantio (três covas por vasos). As avaliações da incidência de murcha e seca causada por Fusarium sp foram feitas aos 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 e 82 dias após o plantio (dap). Oitenta e dois dap, as plantas foram retiradas dos vasos, pesadas para obtenção da massa fresca da raiz (g) e da parte aérea (g). Após, foram acondicionadas em envelopes de papel pardo e colocadas em estufa de ventilação forçada a 60 ºC, para secagem num período de sete dias. Após esse período, foram retiradas da estufa e pesadas para a obtenção da massa seca da raiz (g), parte aérea (g), número de vagens e número de sementes por planta. Para o obtenção da massa verde da raiz e parte aérea, foi utilizada e seguinte fórmula: MV = MF - MS onde: MV = Massa Verde MF = Massa Fresca MV = Massa Seca Os resultados obtidos foram analisados através da análise de variância, Teste de Tukey, a 5 % de probabilidade, com auxílio do programa de comparação de médias Assistat. RESULTADOS E DISCUSSÃO Para os fitopatógenos Alternaria solani e Lasiodiplodia theobromae, quando combinados com o isolado C17, apresentaram menor crescimento micelial comparados com a testemunha, apresentando os valores de 18,5 e 43 mm respectivamente. Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, isolado oriundo de feijão, apresentou menor crescimento micelial quando combinado com o isolado C07 (Tabela 1). O crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos não diferiu estatisticamente para os isolados de levedura M22 e testemunha. Os isolados de levedura em ordem de ranqueamento inibiram com maior intensidade A. solani, Fusarium sp. e L. theobromae (Tabela 1). Muitas vezes a relação fisiológica e a capacidade intraespecífica que cada organismo patogênico ou não, explica comportamentos diferenciais que os isolados apresentam, isto caracteriza a fatia da diversidade metabólica que os isolados selvagens de leveduras apresentam interações naturais ou artificiais (MOREIRA; SIQUEIRA, 2008). As metodologias para distinção e caracterização dos isolados com finalidade para controle biológico, podem apresentar resultados promissores para escolha e "screening" de isolados. O fungo A. solani quando combinado com o isolado M22, apresentou maior crescimento micelial (79 mm) se comparado com a testemunha. Nenhum dos isolados de A. solani, mesmo combinado com os isolados de leveduras e bactérias do solo, tiveram crescimento cobrindo toda a placa como apresentou a testemunha. Nas placas, contendo os isolados de leveduras P01, P05, P06, P20, P22 e C19 e a presença de Fusarium sp., o fitopatógeno completou todo espaço na placa de Petri como ocorreu com a testemunha. Onde havia a presença dos isolados M21 (bactéria) e C17 (levedura) não observou o crescimento micelial de L. theobromae em toda área da placa de Petri, porém, o isolado fitopatogênico ultrapassou a área delimitada pela levedura M21, caracterizando-se assim, o não antagônico ao crescimento do fitopatógeno, o que não foi observado para o isolado C17 (Tabela 1).
  6. 6. J. M. Silva et al. 101 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. Tabela 1. Crescimento micelial (mm) de Alternaria solani, Fusarium sp. e Lasiodiplodia theobromae quando combinados com isolados de leveduras e bactérias do solo (CV% = 8.74), Urutaí, GO, 2011 Isolados Alternaria solani* Fusarium sp.* Lasiodiplodia theobromae* M05 51 efB 77,5 abA 90 aA M20 54 deB 77 abA 90 aA M21 27,5 ijB 76 abA 71,5 aA M22 79 abA 76,5 abA 90 aA P01 68cdB 90 aA 90 aA P03 44,5 hiB 82,5 abA 90 aA P05 56,5 deB 90 aA 90 aA P06 50,5 fgB 90 aA 90 aA P08 26 ijB 82,5 abA 90 aA P13 30 ijC 65 bB 90 aA P20 68 cdB 90 aA 90 aA P22 70,5 bcB 90 aA 90 aA C01 43 hiB 80,5 abA 90 aA C07 23 ijB 35 cB 90 aA C17 18,5 jB 36,5 cA 43 bA C18 47 ghB 82 abA 90 aA C19 48,5 ghB 90 aA 90 aA C23 52,5 efB 80,5 abA 90 aA Testemunha 90 aA 90 aA 90 aA CV% 16.14 8.28 3.86 *As médias seguidas pela mesma letra maiúsculas nas linhas, e minúsculas nas colunas, não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade O isolado C17 destacou-se por apresentar-se mais eficiente na inibição do crescimento de A. solani e L. theobromae apresentando valores de 79,4 e 52,3 %, respectivamente e isolado C07 foi o que apresentou-se mais eficiente na inibição do crescimento de Fusarium sp. (61,15%) (Tab. 2). O isolado M22 foi o que apresentou menor valor de inibição do crescimento micelial para A. solani e os isolados P01, P05, P06, P20, P22 e C19 para Fusarium sp. Todos os isolados, exceto o C17, não foram eficientes no controle de L. theobromae.
  7. 7. Seleção in vitro populações de... 102 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. Tabela 2. Inibição do crescimento micelial (%) de Alternaria solani, Fusarium sp. e Lasiodiplodia theobromae em relação à testemunha quando combinados com isolados de leveduras e bactérias do solo (CV% = 34,42), Urutaí, GO, 2011 Isolados Alternaria solani Fusarium sp. Lasiodiplodia theobromae M05 43,4 ghA 13,95 bcB 0 bB M20 40 ghA 14,5 bcB 0 bB M21 69,45 cdA 15,6 bcB 20,6 bB M22 12,3 ijA 15,05 bcA 0 bA P01 24,45 ijA 0 cB 0 bB P03 50,6 efA 8,35 bcB 0 bB P05 37,3 hiA 0 cB 0 bB P06 43,9 ghA 0 cB 0 bB P08 71,15 bcA 8,35 bcB 0 bB P13 66,75 deA 27,8 bB 0 bC P20 24,5 ijA 0 cB 0 bB P22 21,7 ijA 0 cB 0 bB C01 52,25 efA 10,6 bcB 0 bB C07 74,5 abA 61,15 aA 0 bB C17 79,45 aA 59,5 aB 52,3 aB C18 47,85 fgA 8,95 bcB 0 bB C19 46,15 ghA 0 cB 0 bB C23 41,7 ghA 10,6 bcB 0 bB Testemunha 0 jA CV% = 20.04 0 cA CV% = 53.50 0 bA CV% = 96.80 *As médias seguidas pela mesma letra maiúsculas nas linhas, e minúsculas nas colunas não diferem estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade. Segundo Moura (2007), em testes in vitro, isolados do fungo Trichoderma sp. (SN11, T15, T25, TR2) mostraram-se eficientes na inibição do crescimento micelial de Fusarium sp., Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Rhizopus stolonifer e Lasiodiplodia theobromae na cultura do melão cantaloupe híbrido ‘Hy–Mark’, onde houve 100% de inibição do crescimento destes isolados, quando combinados com Trichoderma sp. De acordo com Tonucci (2004), o extrato aquoso de basidiocarpos de Lentinula edodes não demonstraram efeito inibitório do crescimento micelial e germinação de conídios de A. solani, podendo ser explicados pela baixa concentração ou qualidade das substâncias inibitórias produzidas por L. edodes, ou ainda, por fatores naturais de resistência do patógeno como, por exemplo, a melanina, que pode proteger o fungo contra condições desfavoráveis como temperatura, radiação UV e até mesmo compostos secretados por microrganismos antagonistas. Dos 18 isolados bacterianos e de leveduras utilizados, 13 foram antagonistas à A. solani, 2 foram antagonistas à Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli e 1 foi antagonista à L. theobromae. Os isolados de bactérias do solo P08 e M21 foram antagonistas apenas ao crescimento micelial de A. solani. O isolado de levedura C17 foi o isolado com maior efeito antagonista (Tabela 3).
  8. 8. J. M. Silva et al. 103 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. Resultados obtidos por Louzada et al. (2009), isolados de Trichoderma, Verticillium e Gliocladium, contra Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium solani in vitro, observaram que os diferentes isolados tinham efeito de inibição do crescimento micelial sobre o mesmo patógeno, o mesmo observado neste trabalho. Treze isolados de leveduras e bactérias do solo foram antagônicos ao crescimento micelial de Alternaria solani, sendo eles: M05, M20, M21, P03, P05, P08, P13, C01, C07, C17, C18, C19 e C23. A. solani foi o isolado fitopatogênico que apresentou ser mais sensível à presença de isolados de leveduras e bactérias do solo, apresentando maior número de isolados antagonistas ao seu crescimento. Para o teste de viabilidade biológica (teste in vivo) deste trabalho selecionou-se o isolado C17 por apresentar antagonismo a um maior número de fungos fitopatogênicos (Tabela 3). Dois isolados de leveduras e bactérias do solo foram antagônicos ao crescimento micelial de Fusarium sp., sendo eles o isolado C07 e o isolado C17, onde o isolado fitopatogênico apresentou reduzido crescimento micelial em comparação à testemunha. O agente causal de importantes doenças da batata doce (podridão negra de Java), e a seca da mangueira, o fungo Lasiodiplodia theobromae, teve seu crescimento inibido apenas pelo isolado de levedura C17, não havendo inibição micelial do agente patogênico pelos demais isolados de leveduras/bactérias do solo seu crescimento micelial. O isolado C17 que apresentou-se como antagônico ao crescimento micelial dos três isolados fitopatogênicos (L. theobromae, A. solani) e Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, mostrando-se um isolado com potencial para estudos de controle biológico de doenças e/ou promoção de crescimento. Moreira e Siqueira (2008) apontaram a importância de populações de microrganismos como pontes na mineralização e absorção de nutrientes pelas plantas. Tabela 3. Avaliação da ação antagônica entre leveduras e bactérias do solo sobre o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Alternaria solani, Fusarium sp. e Lasiodiplodia theobromae, Urutaí, GO, 2011 Isolados de leveduras e bactérias Alternaria solani Fusarium sp. Lasiodiplodia theobromae R1 R2 R1 R2 R1 R2 M05 + + - - - - M20 + + - - - - M21 + + - - - - M22 - - - - - - P01 - - - - - - P03 + + - - - - P05 + + - - - - P06 - - - - - - P08 + + - - - - P13 + + - - - - P20 - - - - - - P22 - - - - - - C01 + + - - - - C07 + + + + - - C17 + + + + + + C18 + + - - - - C19 + + - - - - C23 + + - - - - + : Houve antagonismo - : Não houve antagonismo
  9. 9. Seleção in vitro populações de... 104 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. A utilização de testes in vitro para a seleção de organismos biocontroladores representa uma importante ferramenta para a avaliação de um grande número de isolados (LINHARES et al., 1995), e ainda a realização de tratamento de sementes através da microbiolização visando crescimento, germinação e vigor de plântulas (NGHIEP; GAUR, 2005). O antagonismo in vitro é utilizado apenas para seleção de candidatos a agentes de biocontrole (BELL et al., 1982), pois, nem todos aqueles que apresentam efeitos inibitórios in vitro conseguem exercer o mecanismo de antagonismo in vivo. Reis et al. (1995) selecionaram três isolados de Trichoderma classificados como muito eficientes, no pareamento, in vitro contra Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli de feijoeiro sendo que apenas um foi eficiente no controle do patógeno, em tratamentos de sementes. Antagonismo contra a fusariose do feijoeiro em telado Para verificar o efeito da levedura sobre o patógeno (patossitema Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli - feijão) e interações de ambos, utilizou-se como instrumento de medida, as inúmeras variáveis dependentes para diferenciar os tratamentos listados na Tabela 4. No entanto, a partir da significância dos valores F da análise de variância, e da rejeição ou não da hipótele de nulidade (Tabela 4) as variáveis quantidade de sementes de feijoeiro e a massa de vagens por planta, não rejeitaram a hipótese de nulidade, ou seja, suas médias perante os tratamentos Tratamento 1- Feijão, Tratamento 2 – Feijão inoculado com Levedura (isolado C17), Tratamento 3 – Feijão inoculado com isolado fitopatogênico de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, Tratamento 4 – Feijão inoculado com Levedura (C17) e também inoculado com Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli para ambas as cultivares não diferiram. Tabela 4. Valores de F das variáveis dependentes analisando os tratamentos para um único fator em plantas de feijão colhidas Variáveis dependentes Valores de F Massa fresca da raíz (g) F7,32 = 4,47** Massa seca da raíz (g) F7,32 = 10,74** Massa fresca da parte aérea (g) F7,32 = 5,17** Massa seca da parte aérea (g) F7,32 = 2,56* Quantidade de vagens por planta F7,32 = 3,41** Quantidade de sementes por planta F7,32 = 1,32ns Massa vagens por planta (g) F7,32 = 0,27ns Massa verde raíz (g) F7,32 = 2,87* Massa verde da parte aérea (g) F7,32 = 2,99* ** - significativo ao nível de 1% de probabilidade (p < 0,01) * - significativo ao nível de 5% de probabilidade (0,01 =< p < .05) ns - não significativo (p >= 0,05) Quanto sob análise de variância separando os fatores cultivares de feijão (duas cultivares) e tratamentos (Tratamento 1- Feijão, Tratamento 2 – Feijão inoculado com Levedura (isolado C17), Tratamento 3 – Feijão inoculado com isolado fitopatogênico de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, Tratamento 4 – Feijão inoculado com Levedura (C17) e também inoculado com Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli não rejeitou-se a hipótese de nulidade (as médias das variáveis dependentes não diferiram entre si) apenas para as variáveis massa seca da parte aérea (apenas para o fator cultivar - F1,32 = 2,95ns ), quantidade de vagens por planta (apenas para o fator tratamentos - F3,32 =
  10. 10. J. M. Silva et al. 105 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. 0,57ns ), quantidade de sementes por planta (para os fatores cultivar - F1,32 = 0,04ns , e tratamentos - F3,32 = 0,197ns ), massa de vagens por planta (para os fatores cultivar - F1,32 =0,23ns , e tratamentos - F3,32 = 0,37ns ) (Tabela 5). Tabela 5. Valores de F das variáveis dependentes analisando os tratamentos para o fator cultivar e fator tratamento em plantas de feijão colhidas ** - significativo ao nível de 1% de probabilidade (p < 0,01) * - significativo ao nível de 5% de probabilidade (0,01 =< p < 0,05) ns - não significativo (p >= 0,05) 1 fato cultivar refere-se a diferenças das variáveis dependentes entre as duas cultivares de feijão testadas; fator tratamento refere-se a diferenças das variáveis dependentes entre os tratamentos de inoculação das plantas de feijão. As cultivares de feijão mediante a aplicação dos tratamentos comportaram-se diferencialmente e os tratamentos com inoculação expressaram diferenças significativas de acordo com as variáveis dependentes aplicadas. Para a massa fresca da raiz (Figura 1), os tratamentos que apresentaram melhores resultados foram os tratamentos 2 e 3 [2 – Feijão inoculado com Levedura (isolado C17), Tratamento 3 – Feijão inoculado com isolado fitopatogênico de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli], apresentando-se semelhantes á testemunha (tratamento 1) para a cultivar BRS Executivo e para os tratamentos 2 e 4 [2 – Feijão inoculado com Levedura (isolado C17), Tratamento 4 – Feijão inoculado com Levedura (C17) e também inoculado com Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli)] para a cultivar Pérola. Para a massa seca da raiz, apenas e tratamento 2 destacou-se dos demais na cultivar Executivo e Pérola, os tratamentos 2 e 3 apresentaram maior massa. Estes resultados indicam efeito na promoção de crescimento de levedura sobre as plantas de feijão Para a massa fresca da parte aérea (Figura 1), o tratamento 2 para a cultivar Executivo e tratamento 4 para a cultivar Pérola apresentaram as maiores médias, ambos assemelhando-se à testemunha (tratamento 1). Já para a massa seca da parte aérea, todos os tratamentos da cultivar Executivo e os tratamentos 2, 3 e 4 da cultivar Pérola foram iguais estatisticamente. Variáveis dependentes Valores de F1 Massa fresca da raíz (g) Fator cultivar - F1,32 = 6,46* Fator tratamentos - F3,32 = 6,53** Massa seca da raíz (g) Fator cultivar - F1,32 = 2,22ns Fator tratamentos - F3,32 = 19,04** Massa fresca da parte aérea (g) Fator cultivar - F1,32 = 8,18** Fator tratamentos - F3,32 = 7,25** Massa seca da parte aérea (g) Fator cultivar - F1,32 = 2,95ns Fator tratamentos - F3,32 = 3,61* Quantidade de vagens por planta Fator cultivar - F1,32 = 19,65** Fator tratamentos - F3,32 = 0,57ns Quantidade de sementes por planta Fator cultivar - F1,32 = 0,04 ns Fator tratamentos - F3,32 = 0,197 ns Massa vagens por planta (g) Fator cultivar - F1,32 = 0,23 ns Fator tratamentos - F3,32 = 0,37ns
  11. 11. Seleção in vitro populações de... 106 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. Figura 1: Análise conjunta das médias da massa fresca (g), massa seca (g) e massa verde da raíz (g) e massa verde da parte aérea (g) das cultivares BRS Executivo (barras verdes) e Pérola (barras marrons), Urutaí, GO, 2012. [Tratamento 1- Feijão, Tratamento 2 – Feijão inoculado com Levedura (isolado C17), Tratamento 3 – Feijão inoculado com isolado fitopatogênico de Fusarium sp., Tratamento 4 – Feijão inoculado com Levedura (C17) e também inoculado com Fusarium sp.] Em relação à massa verde da raiz (Figura 1), todos os tratamentos apresentaram-se iguais estatisticamente para a cultivar Executivo e os tratamentos 2 e 4 destacaram-se para a cultivar Pérola, assemelhando-se à testemunha. Para a massa verde da parte aérea, os tratamentos 2 e 3 da cultivar Executivo foram iguais à testemunha e 2, 3 e 4 da cultivar Pérola foram iguais estatisticamente. Não se rejeitou a hipótese de nulidade para as médias dos valores de AACPD (Área abaixo da curva de progresso da doença) para todos os tratamentos estudados, ou seja, não houve diferença estatística entre os tratamentos e cultivares para esta variável dependente.
  12. 12. J. M. Silva et al. 107 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. Segundo Corrêa et al. (2008), a promoção de crescimento que os antagonistas apresentaram ou desencadeiam, em especial, acúmulo de massa foliar e radicular, este é um comportamento conhecido em diversas espécies vegetais: pepino (MELO; VALARINI, 1995), tomate (MOURA; ROMEIRO, 2000), milho (LUCON; MELO, 2000) e feijão (ZANATTA, 2004). O fato mostra-se importante quando se pensa que estas plantas poderão explorar com maior potencialidade o solo, propiciando melhores condições de fixação e absorção nutricional, e maior tolerância a condições climáticas adversas no campo (EL-ABYAD et al., 1993). Outra consequência é de que plantas de feijão com maior índice de velocidade de emergência, maior massa tanto radicular quanto foliar, consequentemente, tornam-se menos sensíveis a importantes patógenos presentes no solo como Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli e Fusarium solani, entre outros (CANTERI et al., 1999). Na cultivar Executivo, todos os tratamentos apresentaram quantidade de vagens estatisticamente iguais e superiores estatisticamente em pelo menos a um tratamento comparando com a cultivar Pérola. Na cultivar Pérola, os tratamentos 3 e 4 apresentaram-se maior número de vagens (Figura 2). Não se rejeitou a hipótese de nulidade para as variáveis massa de vagens e quantidade sementes por planta. Segundo Lobo Júnior, Geraldine e Carvalho (2009), em experimentos com doses excessivas de T. harzianum não forneceram aumento da produção, nenhuma redução do inóculo ou controle de doenças, em comparação com as testemunhas. É provável que em doses muito altas ocorra algum tipo de autoinibição ou competição afetando o desenvolvimento do antagonista. Segundo os autores, a dosagem mais eficiente para controle de um patógeno não é necessariamente a mais alta. Acima da dosagem ideal, a eficiência do controle biológico e a produtividade caem. Além disso, os custos de produção aumentam, já que o produtor está fazendo uso de mais um insumo. Por isso, testes com dosagens diferentes de esporos viáveis ao controle biológico devem ser feitos, para que a dosagem ideal seja estudada e maximize os benefícios dessa prática. Figura 2: Quantidade de vagens de feijão por planta das cultivares BRS Executivo e Pérola. Urutaí, GO, 2012. [Tratamento 1- Feijão, Tratamento 2 – Feijão inoculado com Levedura (isolado C17), Tratamento 3 – Feijão inoculado com isolado fitopatogênico de Fusarium sp., Tratamento 4 – Feijão inoculado com Levedura (C17) e também inoculado com Fusarium sp.]
  13. 13. Seleção in vitro populações de... 108 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. CONCLUSÕES Através da metodologia aplicada de cerqueamento in vitro do micélio, foi possível selecionar um isolado (C17) para estudos, verificando à sua promoção de crescimento em plantas de feijão envasadas e sua interação com a incidência da murcha-de- fusarium em cultivares de feijão. Dos fungos fitopatogênicos estudados, Alternaria solani sofreu menor inibição do crescimento em decorrência da presença dos isolados de leveduras e bactérias do solo. A levedura utilizada demonstrou através dos parâmetros estatísticos que interfere ou tem relação com acrescimentos e melhoria de rendimento. Já os valores de incidência da fusariose do feijoeiro não sofreram interferência dos tratamentos aplicados. REFERÊNCIAS AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIM FILHO, A. Manual de Fitopatologia: princípios e conceitos. 4a ed. vol.1, São Paulo: Editora Agronômica Ceres Ltda, 2011. BELL, D.K; WELLS, H.D; MARKHAM, C.R. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathology, v. 72, p. 379-382, 1982. BENÍTEZ, T., RINCÓN, A.M., LIMÓN, M.C., CODÓN. A.C. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. International Microbiology, v.7. n. 4, p. 249-260, 2004. BETTIOL, W. Conversão de sistemas de produção. In: POLTRONIERI, L.S., ISHIDA, A.K.N. (Eds.) Métodos alternativos de controle de insetos-pragas, doenças e plantas daninhas: Panoramas atuais e perspectivas. Belém: Embrapa Amazônia Oriental, 2008. BETTIOL, W., GHINI, R., Proteção de plantas em sitemas agrícolas alternativos. In: CAMPANHOLA, C., BETTIOL, W. (Eds.) Métodos alternativos de controle fitossanitário. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2003, p. 79-95. CANTERI, M. G.; PRIA, M. D.; SILVA, O. C. Principais doenças fúngicas para manejo econômico e ecológico. Ponta Grossa: UEPG, 1999. 178p. CORRÊA, B.O. Influência da microbiolização de sementes de feijão sobre a transmissão de Colletotrichum lindemuthianum (Saac e Magn.). Revista Brasileira de Sementes, vol. 30, n. 2, p.156- 163, 2008. EL-ABYAD, M; EL-SAYED, M. A.; EL- SHANSHOURY, A. R.; EL-SABBAGH, S. H. Towards the biological control of fungal and bacterial diseases of tomato using antagonistic Streptomyces spp. Plant and Soil, v. 149, n. 2, p. 185-195, 1993. ISAAC, S. Fungal life-style. In: CHAPMAN, S. e HALL, J. Fungal-Plant interactions. London: Routledge. 418p., 1992. ITO, M.A. Patogenicidade de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, adubação nitrogenada e produtividade de feijão. 2004. 80p.Dissertação (Mestrado em Fitopatologia) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), Piracicaba, 2004. KENNEDY, A.C. Bacterial diversity in agroecosystems. Agriculture, Ecosystems and Environment, v. 74, n.1, p. 65-76, 1999. LINHARES, A.I.; MATSUMURA, A.T. S; LUZ, V.C. Avaliação da amplitude de ação antagonística de microrganismos epífitas do trigo sobre o crescimento radial de Drechslera tritici-repentis. Revista Brasileira de Agrociência, v.1, n.3, p.119- 126, 1995. LOBO JÚNIOR, M.; GERALDINE, A.M.; CARVALHO, D.D.C. Controle biológico de patógenos habitantes do solo com
  14. 14. J. M. Silva et al. 109 Gl. Sci Technol, Rio Verde, v. 08, n. 01, p.96 – 109, jan/abr. 2015. Trichoderma spp., na cultura do feijoeiro comum. Comunicado Técnico 85, Santo Antônio de Goiás: Embrapa Arroz e Feijão, 2009. 4 p. LOPES, E.A.G.L. Controle biológico de Botrytis cinerea in vitro em mudas de Eucalyptus sp. 2001. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2001. LOUZADA, G.A.S., CARVALHO, D.D.C., MELLO, S.C.M., LOBO JÚNIOR, M., MARTINS, I.; BRAÚNA, L.M. Antagonist potential of Trichoderma spp. from distinct agricultural ecosystems against Sclerotinia sclerotiorum and Fusarium solani. Biotaneotropica, v. 9, n.3, p.145-149, 2009. LUCON, C.M. M.; MELO, I.S. Efeito da bacterização de sementes no desenvolvimento de plantas de milho e no controle de Fusarium moniliforme. Fitopatologia Brasileira, v. 25, n. 4, p. 529- 537, 2000. LUMSDEN, R. D. Development of Gliocladium virens for damping-off disease control. Canadian Journal of Plant Pathology. v.18, p.463-468, 1996. LUZ, W.C. Controle Biológico das doenças foliares de trigo. In: BETTIOL, W. Controle Biológico de doenças de plantas. Jaguariúna: EMBRAPA-CNPDA, 1991, p.383-8, MANFIO, G.P. Avaliação do estado atual do conhecimento sobre a diversidade microbiana no Brasil. Brasília: SBF/Ministério do Meio Ambiente, 128p, 2000. MARIANO, R. L. R. Métodos de seleção in vitro para controle microbiológico. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 1, p. 369–409, 1993. MELO I. S.; VALARINI, P.J. Potencial de rizobactérias no controle de Fusarium solani (Mart.) Sacc. em pepino (Cucumis sativum L.). Scientia Agrícola, v. 52, n. 2, p. 326- 330, 1991. MOREIRA, F.M.S.; SIQUEIRA, J.O. Microbiologia e bioquímica do solo. Lavras: Editora UFLA, 729p. 2008. MOURA, A.B.; ROMEIRO, R. da S. Actinomicetos pré selecionados para controle de Ralstonia solanacearum, como promotores de crescimento em tomateiro. Revista Ceres, v.47, n. 247, p.613-626, 2000. MOURA, R.D. Produtos biológicos e alternativos no controle de doenças pós- colheita em melão Cantaloupe. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, 2007. NGHIEP, H. V.; GAUR, A. Efficacy of seed treatment in improving seed quality in rice (Oryza sativa L.). Omonrice, n. 13, p.42-51, 2005. RAVA, C.A.; SARTORATO, A.; COSTA, J.G.C. Reação de genótipos de feijoeiro comum ao Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli em casa de vegetação. Fitopatologia Brasileira, v. 21, n. 2, p. 296- 300, 1996. REIS, A., OLIVEIRA, S.M.A. de, MENEZES, M. et al. Potencial de isolados de Trichoderma para biocontrole da murcha-de- Fusarium do feijoeiro. Summa Phytopathologica, v.21, p.16-20, 1995. ZILLI, J.E., RUMJANECK, N.G., XAVIER, G.R., COUTINHO, H.L.C., NEVES, M.C.P. Diversidade microbiana como indicador de qualidade do solo. Cadernos de Ciência & Tecnologia, v. 20, n.3, p. 391-411, 2003.

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