2. Centro
Nacional de
Alimentación
Métodos de detección de alérgenos
Características y limitaciones
Posibles soluciones
Retos
Conclusiones
Índice:
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid 18 de octubre de 2016
4. Centro
Nacional de
Alimentación
Estado Actual
Limitaciones en la aplicación de la legislación UE en el
etiquetado de alérgenos
• Falta de criterios normativos para la detección (Métodos de
detección)
• Falta de umbrales de alérgenos (Límite de detección)
Involuntaria - Contaminación cruzada
Excesivo etiquetado de precaución, sin relación con el
riesgo real:
´puede contener trazas de …
‘producido en una fabrica que utiliza….…
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid 18 de octubre de 2016
5. Centro
Nacional de
Alimentación
Detección de ADN del alimento alergénico
Métodos inmunológicos
Métodos Cromatográficos
Métodos de Análisis de Alérgenos
Métodos Biología Molecular
Detección proteína o proteínas alergénicas
Detección proteína o fracciones de proteínas (péptidos)
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6. Centro
Nacional de
Alimentación
Métodos Inmunológicos: La mayoría de los kits comerciales
disponibles para el análisis en rutina de alérgenos de alimentos se
basan en métodos inmunológicos. Los Ensayos inmunoenzimático
(ELISA) son los más ampliamente utilizados debido a que son
sensibles y específicos para la detección de proteínas alergénicas y
fáciles de usar.
Sin embargo, los kits comerciales para análisis cuantitativos utilizan
diferentes tampones de extracción y diferentes calibrantes, se
diferencian en la calidad de los anticuerpos utilizados y los
resultados varían entre marcas comerciales y lotes.
Las principales limitaciones incluyen efectos de la matriz, la
extracción insuficiente de la proteína, la insuficiente especificidad
debido a reacciones cruzadas y la insuficiente reproducibilidad de
los resultados.
Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,
EFSA Journal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
7. Centro
Nacional de
Alimentación
Métodos basados en la detección de una o más proteínas
o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión
específica antígeno-anticuerpo
Métodos Inmunológicos
Enzimoinmunoensayo ELISA
TIRAS Inmunoreactivas (LFD)
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8. Centro
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Características de los sistemas Inmunológicos
• Alta sensibilidad
• Cuantitativos
• Aplicación Materias Primas y
Producto Procesado
• Equipamiento: Lector de microplacas
• Experiencia su realización
• Muy sencillos
• Cualitativos/semicuantitativos
• Rápidos ( 5-10 minutos)
• Útiles “Control de Riesgo” (APPCC)
• Materias primas
• Sensibilidad declarada
(entre 1 mg/kg - 10 mg/kg )
• Requieren confirmación
ELISA
Tiras (FDL)
• Detectan Proteínas Alergénicas
• Especificidad
• Sensibilidad
• Fácil Realización
• Gran disponibilidad en el mercado
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9. Centro
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Alimentación
Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-1
Extracción de proteínas alergénicas
Efecto de la matriz (grasas, taninos,
acidez, etc...)
Efecto del procesado (tratamiento
térmico, hidrólisis, fermentación etc…)
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10. Centro
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1.‐ Solución Cocktail con Etanol al 80% ‐‐ 2.‐ Solución de Guanidina / ‐mercaptoetanol /
Isopropanol ‐‐3.‐ Solución 1 con Gelatina de pescado ‐‐ 4.‐ Solución 1 con leche desnatada
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Estudio del efecto de los taninos de la fruta (CNA)
Matriz ricas en taninos
Matriz libre de taninos
mg/kg de gluten
11. Centro
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▄ Sin desengrasar
▄ Desengrasado
Efecto del pH en la detección
de huevo en salsas
▄ pH ácido
▄ pH neutro
Determinación de caseína
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12. Centro
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Diferencias de los Resultados en los distintos
sistemas ELISA
Detectan diferentes proteínas
Diferente anticuerpos
Diferentes calibrantes
Diferentes unidades de expresión de resultados
Diferencia en los límites de detección
Variación entre marcas comerciales y lotes
Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-2
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13. Centro
Nacional de
Alimentación
0
5
10
15
20
25
30
35
Cacahuete(mg/kg)
BioKits Romer Labs R-Biopharm Neogen
Resultados diferentes ELISAS
FAPAS Proficiency Test 2776C
FAPAS 2776‐ C
Cacahuete en chocolate
•Biokits 11,8 mg/kg
• Romer Labs 8,7 mg/kg
• R‐Biopharm 24,2 mg/kg
• Neogen 15,0 mg/kg
Valor asignado:
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TEPNEL
BIOKITSAgraQuant®
A B C D
Huevo 0,4 mg/kg 0,25 mg/kg 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Caseína 0,2 mg/kg 0,25 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg
Β-lactoglobulina 10 μg/kg 0,2 mg/kg 5 mg/kg 0,1 mg/kg
Soja 40 μg/kg 0,3 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg
Cacahuete 1 mg/kg 1,5 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg
Diferente LD/LC
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15. Centro
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β-lactoglobulina en un alimento :
Sistema A : < 10 µg/kg
Sistema C: < 5 mg/kg
RESULTADO :
NO DETECTADO
Cacahuete en un alimento (1,5 mg/kg) :
Sistema A (LC 1 mg/kg): 1,5 mg/kg
Sistema C (LC 2,5 mg/kg): < 2,5 mg/kg ?
DETECTADO
NO DETECTADO
ETIQUETAR
NO ETIQUETAR
Ejemplos :
Qué pasa entre 10 µg/kg y 5 mg/kg ???
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16. Centro
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Alimentación
rente expresión de resultados
función de la solución calibrante utilizada
s sistemas proponen conversiones en la expresión de resultados
HUEVO LECHE CACAHUETE
huevo entero en mg/kg proteína de leche cacahuete
proteína clara de mg/kg leche entera en
polvo
Proteína de cacahuete
ovomucoide mg/kg caseína
mg/kg β lactoglobulina
17. Centro
Nacional de
Alimentación
ción de muestras fortificadas con NIST SRM 8445
Comparativo kits ELISA Determinación de huevo
RAS
Valor Esperado
mg/kg
1 2 3 4
mg/kg (ppm) proteína
clara de huevo
mg/kg (ppm) mg/kg (ppm) mg/kg (ppm)
Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo
do 1,5 0,53 3,4 1,72 1,6
a 1,5 0, 75 2,4 1,7 1,6
do 3 1,1 5,6 3,15 4
a 3 1,21 6,8 3,05 3
do 6 3,2 9,5 6,1 5,6
18. Centro
Nacional de
Alimentación
o Comparativo kits ELISA Determinación de Avellana
1 2 3 4
LC LC LC LC
z ETIQUETADO
0,5 mg/kg de
Proteína de
avellana
1 mg/kg de
Avellana
2,5 mg/kg de
Avellana
2,5 mg/kg de
Avellana
NO ETIQUETADO > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg
inas
NO ETIQUETADO 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg
Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO
Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
Puede contener
trazas de nueces,
almendras y soja
NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
Trazas de frutos
secos
NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
19. Centro
Nacional de
Alimentación
s Indirecto : Amplificación de un fragmento del gen del alérgeno o
na secuencia genética específica presente en el Alimento o
ente
ación
ados
PCR tiempo final
odos Biología Molecular
21. Centro
Nacional de
Alimentación
os basados en la detección de ADN permiten la
ón del alimento alergénico, en lugar de la proteína
nica y son complementarios a ensayos inmunológicos. ADN
eralmente más estables que las proteínas y por lo tanto
do para el análisis de alimentos procesados. Los
imientos de extracción y amplificación están bien
cidos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tanto a
final como en tiempo real permiten el análisis que varios
nos a la vez. El análisis del ADN se convierte en el método de
n siempre que no están disponibles kits de ELISA o no sean
icos para el análisis de un alimento alergénico/ingrediente
ico (por ejemplo el apio). PCR en tiempo real puede
cionar resultados cuantitativos y permite el análisis de
Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,
nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf
22. Centro
Nacional de
Alimentación
blemas en la extracción (presencia de inhibición en
mentos procesados)
ultados cualitativos / semicuantitativos
• Cuantificación ng ADN (número de copias)
unos alérgenos no pueden diferenciarse por PCR
Carne vacuno /leche
aves /huevo
rente distribución entre ADN y proteína
ADN en baja concentración, leche, proteína de clara de huevo,
ciones analíticas de los métodos biológicos:
25. Centro
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Alimentación
ación ELISA/PCR sobre muestras reales (Detección de Avellana)
MUESTRAS ELISA (mg/kg) PCR
Bollo 8 DETECTADO
Galleta de chocolate > 20 DETECTADO
Galletas < 2,5 NO DETECTADO
Bombón > 20 DETECTADO
Turrón de cacahuete < 2,5 DETECTADO
Cereales de trigo y chocolate > 20 DETECTADO
Barrita de cereales > 20 DETECTADO
Muesli > 20 DETECTADO
Barrita de trigo y chocolate > 20 DETECTADO
Cereales Fruta y fibra > 20 DETECTADO
Barquillo relleno de cacao > 20 DETECTADO
Bizcocho cubierto de chocolate < 2,5 NO DETECTADO
Copos de maíz < 2,5 NO DETECTADO
Desayuno a la taza < 2,5 NO DETECTADO
RAS DUDOSAS
ontener trazas
avellana)
UESTRAS
VAS (No figura
RAS POSITIVAS
avellana como
rediente)
27. Centro
Nacional de
Alimentación
Qué queremos detectar ?
• Detección del ingrediente:
Alimento
• Detección del alérgeno:
Proteína alergénica
ción de un Método de análisis
do analizar?
cto final: Cumplir la Legislación
- Suficiente para cumplir
la legislación
-Más información para
el paciente
28. Centro
Nacional de
Alimentación
o de matriz
- Matriz grasa ADN X ELISA
- Productos hidrolizados ADN ELISA X
uraleza del alérgeno buscado
Apio
vamos a analizar?
ADN
30. Centro
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SPONIBILIDAD MATERIALES DE REFERENCIA
: MR disponibles
Alérgeno MATERIAL PROCEDENCIA CERTIFICACION
Huevo RM 8445 ( Whole egg powder) NIST
Contenido
proteico (ELISA)
mina/Gluten PWG standar Prolamin Group Alérgeno
Leche BCR-638 IRMM
Contenido
proteico
31. Centro
Nacional de
Alimentación
al de Referencia
ncipal problema para la cuantificación de alérgenos por
os inmunológicos, espectrometría de masas o los métodos
s en ADN es la falta de disponibilidad de materiales de
cia certificados (MRC).
les de referencia (no certificados) desarrollados por diferentes
tores están disponibles comercialmente para los alérgenos
tarios más importantes, pero los resultados obtenidos pueden
comparables.
equiere la disponibilidad de MRC para la
ificación de alérgenos alimentarios.
Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,
nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf
32. Centro
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les soluciones
Muestras Fortificadas: muestra preparada por adición de una
determinada cantidad de alérgeno
obrantes de ensayos de intercomparación
Valor de Referencia : Valor Asignado en el ensayo
(Con cada Kit ???)
tilización de reactivos químicos (cuando el alérgeno exista
reactivo, Proteína purificada ej. caseína, β-lactoglobulina, etc…)
tilización del alimento alergénico
reparación de muestras control: Valor teórico
“Incurred”: muestra adicionada y sometida
33. Centro
Nacional de
Alimentación
QUETADO PRECAUTORIO
aración voluntaria que usan los fabricantes en las
etas de los alimentos que indica la presencia
ncial y no intencionada de un alérgeno
77 % ‐ Puede contener trazas de…….
6 % ‐ Puede contener indicios de….
13 % ‐ Elaborado en fábrica que utiliza……
3 % ‐ Aroma de …..
uestras analizadas con etiquetado precautorio: