Aplicação de RNA seq em biologia molecular

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Aplicação de RNA seq em biologia molecular

  1. 1. Universidade Federal do ParáMestrado em Genética e Biologia Molecular Karina Melo Talita Fernanda Belém-PA 2012
  2. 2. RNA seq Uma abordagem desenvolvida para transcriptoma usando tecnologias de sequenciamento “next generation” Permite Determinar aMedição dos níveis estrutura funcional de transcritos dos genes
  3. 3. RNA seq O termo RNA-seq tem sido usado para representar o transciptoma revelado por sequenciamento de cDNA por NGS (sequenciadorres de segunda geração); Permite a quantificação dos níveis de expressão gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis mais baixos de expressão devido a sua alta sensibilidade; Útil para descobrir novas transcrições, identificação de mutaçoes, indels, splicing alternativos;
  4. 4. RNA seq Metodologia Fonte: Snyder et al, 2009.
  5. 5. RNA seq Sequenciamento: Ilumina IG. Applied Biosystems SOLiD. Roche 454 Life Science systemsBiosystems HeliScope™ Single MoleculeSequencer. Pacific Biosystems PACBIO RS.
  6. 6.  Tabela 1: Principais características técnicas das plataformas 454 GS-FLX, ILLUMINA E SOLID Fonte: Adaptado de: Metzker 2010; Carvalho & Silva 2010.
  7. 7. RNA seq Após o sequenciamento os resultados são alinhados num genoma de referência ou montados de novo. Genoma de referência “Ab initio” Montados de novo
  8. 8.  Preferencialmente o método “Ab initio”; Quando não se possui genoma de referência pode ser utilizado na montagem o genoma de um organismo filogenéticamente próximo; Combinando as duas estratégias: mesmo que se possua o genoma de referência, é recomendado alinhar novamente usando o alinhamento gerado “de novo”; Método “de novo” é mais efetivo quando utilizado em genomas de procariontes; pois esta abordagem está mais suscetível a erros de sequenciamento, gera transcritos mais fragmentados, além de um volume de dados computacionais muito maior.
  9. 9. Análise dos dados após o Sequenciamento: Quantificação do nível de expressão gênicaFonte: Marthin & Whang 2011
  10. 10. RNA seq Aplicação RNAseq. CDS 1 CDS 2 Ambiente Normal CDS 1 CDS 2 Estresse térmico CDS 1 CDS 2 Estresse osmótico
  11. 11. RNA seq Vantagens.- Permite detectar transcritos mesmo sem a presença de um genoma de referência;- Pode detectar variações nas sequencias genômicas;- Possuem pouco ruído de fundo, podendo ser mapeado sem ambiguidade em regiões distintas do genoma;- Requer uma quantidade muito menor de amostras de RNA;- Já revelou várias regiões de transcrição e isoformas de splicing novas de genes conhecidos;- Capaz de rastrear com acurácia as mudanças na expressão gênica durante diferentes estágios da diferenciação de células e do desenvolvimento de alguns organismos.
  12. 12. Fonte: Wang et al. 2009
  13. 13. RNA seq Desvantagens.- Moléculas de RNA necessitam ser fragmentadas para que possam se adequar às tecnologias de sequenciamento de nova geração, podendo em cada processo de fragmentação influenciar no resultado produzido;- Por usar sequenciamento de larga escala, enfrenta desafios durante o armazenamento, recuperação e processamento das grandes quantidades de dados gerados;- Permite maior cobertura e por isso requer mais sequenciamento que, por sua vez, aumenta o custo;- Para sua validação é exigido o uso de triplicatas para cada experimento;- Sujeito a erros de sequenciamento devido ao grande volume de dados gerados, sendo necessário dedicar maior tempo na análise pós-montagem para resolvê-los
  14. 14.  Perspectivas RNA seq Embora o RNA-seq ainda seja um método pouco utilizado devido a seu recente desenvolvimento, ele possui muitas vantagens em relação a outros métodos, como o microarray podendo vir a substitui-lo; Os próximos desafios a esta metodologia é ser amplamente utilizada em genomas mais complexos para identificar níveis de expressão de transcritos raros; O uso de novas tecnologias (sequenciamento pair-end e strand specif) podem vir a facilitar esta meta permitindo uma maior cobertura genômica com o uso de sequencias longas (reads);
  15. 15. RNA seq Ampla utilização em mais organismos, como plantas poliplóides, comunidades de microorganismos (metatranscriptômica); Avanços nos sistemas computacionais e nos próprios computadores, permitindo um maior rapidez na análise dos dados; Futuro da “montagem” transcriptômica: “Não será necessário montar” (Martin & Wang 2009).
  16. 16. RNA seq Aplicações no estudo de doenças genéticas.
  17. 17. RNA seq Aplicações no estudo de doenças genéticas.- Detecta alterações na molécula de RNA em células cancerosas;- Permite identificar níveis de expressão e de novos transcritos;- Identifica mecanismos de splicing alternativo e fusões gênicas;- Detecta mutações, entre elas rearranjos cromossômicos, que levam a transcritos quiméricos;
  18. 18. Obrigada!!

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