1. USO PRACTICO
DE LA
CARGA VIRAL
Dr. Hector Marrufo Ortega
Patologia Clinica
Facultad de Medicina de Leon
Analisis Clinicos de Leon
2003

2. CARGA VIRAL
•Medición de la cantidad de virus a través de la cuantificación
de copias de su material genético.
•Puede hacerse en sangre (plasma), LCR, orina, semen,
aspirados etc.
•La muestra ideal depende de la técnica empleada para la
cuantificación.
•Reporte en copias/ml de plasma o en log correspondiente.

3. CARGA VIRAL
Utilidad:
•“Diagnostica”
• Seguimiento
“La carga viral representa la aparente correlacion
entre la cantidad de virus en la sangre y la
severidad de la enfermedad“.
•Monitoreo terapeutico
•Infecciones causadas por:
VIH VSR.
CMV Otros
Hepatitis B y C
VPH ?
Herpes (encefalitis viral)

4. CARGA VIRAL
Metodos:
PCR (convencional):
• Reacción en cadena de
la polimerasa.
• Mas utilizada
• “aprobación FDA”
• El DNA o RNA (RT-PCR) es
amplificado
• Cuantificación por ELISA.
• Uso de estandar de
cuantificación

6. Sistema COBAS
Amplicor
automatizado

7. Zona reacción
Termociclador
ELISA
Muestreador
Zona reactivos

8. CARGA VIRAL
PCR en tiempo real:
•Amplificacion del ADN o RNA con monitoreo continuo
de dicho evento
•Basada en deteccion y cuantificación de moleculas
fluorescentes (“reporteros”)
•La señal emitida por el reportero aumenta
directamente proporcional a la cantidad de producto
de PCR en la reacción
MONITOREO DE
EMISION PCR EN FASE
FLUORESCENCIA EXPONENCIAL

9. PCR TIEMPO REAL
•Monitoreo continuo
•Tiempo de ramping mas cortos (mas específica)
•Fluorescencia (reportero)
•Bromuro de etidio: se une a la cadena de ADN en
surco menor y emite una señal
•Formatos:
–Agentes intercalantes
•Sybr Green o bromuro de etidio
–Sondas de hibridación:
•Sondas de hidrolisis, molecular beacons
•Tm :temperatura fusion de fragmentos amplificados
CINETICA DE LA REACCION

11. PCR TIEMPO REAL
Curvas melting:
• Permite distinguir los
productos específicos de
los inespecíficos en la PCR
ej. “dimeros de primers”

12. Monitoreo
continuo de
la reaccion

13. CARGA VIRAL
bDNA (branched chain DNA o DNA arborizado)
•Hibridación de sondas al DNA o RNA viral
•No existe una aplificacion de la cadena (templado)
base
•Acidos nucleicos se adhieren a una placa a la cual
se le adhiere una sonda
•Uso de sonda específica en el DNA.
•Esta sonda y no los ácidos nucleicos la que realiza la
amplificación.

14. CARGA VIRAL
bDNA (branched chain DNA o DNA arborizado)
•Se basa en la hibridación y acoplamiento de sondas
moleculares a un amplificador (bDNA).
La técnica se realiza en tres pasos :
•Primera: hibridación y captura del ácido nucleico
viral.
–Uso de enzima proteolítica:
proteinasa K.
–Detergente para la lisis de
viriones y liberación de ácido
nucleico viral. RNA blanco
–Uso de buffer con dos tipos de
sondas específicas, una facilita Lisis viral, degradación y liberacion
la captura y otra amplifica la de RNA
señal.

15. Hibridación y captura RNA blanco por
sondas
Sondas de
hibridación
de DNA
Hibridación de
Amplificación
amplificadores a pre
amplificadores de
ADN
Sondas de Pared
captura
Hibridación de pre
amplificadores a
zondas de ADN
Pre Amplificacion

16. CARGA VIRAL
•Segunda: Acoplamiento de las secuencias virales al
amplificador bDNA.
•Tercera: union de fosfatasa alcalina a la molécula
de bDNA unida al ácido nucleico viral blanco.
•Dioxetano = señal luminosa amplificada por micelas
de fluoresceina en el substrato.
•El resultado final leído en un luminómetro.
•La señal absoluta de cada muestra es proporcional a
la cantidad de virus presente en la muestra

17. Sondas de marcaje (FA)
Union sondas de
marcaje a
amplificadores de Generación de señal
ADN
Adicion de
dioxetano y
generación
de señal

18. CARGA VIRAL

19. CARGA VIRAL
NASBA
(Ampliación secuencial de Ac Nucleicos )
•Amplificación basada en la transcripción.
•Accion de 3 enzimas:
–Transcriptasa inversa: sintesis de DNA en RNA o DNA plantilla
–RNasa H : Degradacion de RNA en DNA (RNA hibrido)
– RNA polimerasa: sintesis de RNA a partir del DNA plantilla
•Aislamiento del RNA o DNA problema del plasma.
•RNA se convierte en DNA (transcriptasa reversa)
•DNA se convierte nuevamente a múltiples copias de
RNA

20. Transcriptasa
Primer 2
Extension del Primer
Transcriptasa
RNAsa
RNAsa Transcriptasa
Primer 2

21. RNAsa
Transcriptasa
Primer 2
Primer 1
Transcriptasa: sintesis de DNA antisentido
Transcriptasa
P2
DNA
3’
3’ P1

22. Transcripción y sintesis de RNA Transcriptasa
DNA
RNA polimerasa
P2
P1
Transcripción y sintesis de RNA Transcriptasa
RNA polimerasa
P2
RNA
P1

23. Transcripción y sintesis de RNA
RNA
P2
RNA polimerasa
P1
Transcriptasa
•Producción de RNA de cada copia de DNA (proceso de amplificación
isotermica)
•Detección basada en un método de electroquimioluminiscencia.
–Emisión de luz por parte de átomos de rutenio unidos al RNA
amplificado.
–Se cuantifica y extrapola sobre una recta obtenida a partir de la
emisión de los calibradores.

24. USOS CARGA VIRAL
•Uso masivo en VIH, hepatitis B, C y CMV
•“Diagnostica”
•Monitoreo terapeutico
–Inicio.
–Respuesta
–Cambio o falla
•Pronóstico
–Progresion de la enfermedad
–Sobrevida
•Transmisión vertical.
•Identificación de pacientes con riesgo de infección

25. CARGA VIRAL
Para el monitoreo de la infección virales se requiere
de metodologías que tengan :
1. Alta sensibilidad: permite detectar individuos
tempranamente con riesgo de enfermedad
2. Potencial para detectar los casos positivos y medir
la carga viral durante tratamiento.
3. Rapidez para permitir inicio y/o cambio de Tx.
4. Reproducibilidad.
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, July 1998, p. 533–554

26. CARGA VIRAL EN
INFECCION POR VIH
•Indicador directo del total de virus producidos en la
células de los pacientes infectados.
Science 1996;271:1582-5
•Viremia en infección por VIH: 0.4 a 3.2 x 10 10 viriones
por dia. Nature 1995;373:117-126
“Pacientes con carga viral alta desarrollan SIDA en un
corto tiempo por la gran producción de virus y
destrucción células que sobrepasa la capacidad de
produción y sustitucion de células CD4.”

27. INFECCION MUERTE
seroconversion
asintomatico sintomático SIDA
1000
Linfocitos CD4
500 cel/mm3
0
109
107
105
CARGA VIRAL
(copias/ml)
103
101
4-8 sem mas de 12 años . 2-3 años

28. Indicación Clínica Información Uso
Establece Dx cuando
Síndrome HIV
prueba de Ac es Diagnostico
agudo
indeterminada
Evaluación inicial “Línea Base” Inicio o no terapia
Cada 3-4 meses
Cambios en carga
en pacientes sin Inicio de Tx
viral
Tx
4-8 sem. post. a Continuar o
Eficacia terapéutica
inicio de Tx cambiar Tx
Máximo efecto Continuar o
3-4 meses post.
terapéutico cambiar Tx
Cuadro clínico o Asociación con Continuar, iniciar o
disminución CD4 cambios en CV cambio de Tx

29. Correlación entre la cantidad de
Sasksela y col.
RNAm HIV en células mononucleres
Ann Intern. Med.
periféricas y progresión a SIDA con CD4
1995;123:641-644
>600 mm3.
Carga Viral fue el mejor indicador de
Mellor JW y cols. progresión a SIDA. “El peso de la
Science1996;272: cuenta de CD4 como indicador para
1167-1170 progresión de la enfermedad depende
de la carga viral del paciente”.
Dickover RE y col En mujeres embarazadas, el
JAMA 1996; 275:599-605 conocimiento de carga viral ayuda a
Volberding PA. predecir el riesgo de transmisión
Lancet 1996;347:71-3 transplacentaria del VIH.

30. Cuenta de CD4 y niveles de RNA HIV como
O’Brien WA y cols.
indicadores de progresión a SIDA y muerte. Ambos
N Engl J Med
pueden usarse para clasificación clínica y decidir
1996;334:426-431
tratamiento.
CV fue el mejor indicador de progresión de la
Mellors JW y cols. Ann
enfermedad seguido (en orden de valor predictivo)
Intern Med 1997;126:946-
de cuenta de CD4, niveles de neopterina, beta 2
54
microglobulina, fiebre etc.
Hughes MD. Y cols.
Ann Intern Med
Concluyeron que la combinación de medición de
1997;126:929-38
carga viral y CD4 proveen mejor información para
O’Brien WA y cols
el pronostico que cualquier factor solo.
Ann Intern Med
1997;126:939-45
Cada disminución de 0.5 log en CV se asocia con un 30% de reducción en el
riesgo o progresión clínica. Un incremento en el 10% en CD4 se asocia en 15%
de reducción en el riesgo.

31. CARGA VIRAL EN VIH
INICIO DE TRATAMIENTO:
Sociedad Internacional de SIDA (2000)
CV>30,000 copias/ml o CD4 < 350 por mm3 (0.35 x 109 /L).
Carpenter et al JAMA 2000;283:381-90
Asociacion VIH Britanica (BHIVA):
CV>30,000 copias/ml y una cantidad de CD4 < 350/ul.
Guidelines for the treatment of HIV infected adults with antiretroviral
therapy of British HIV association.Junio 2000
Www.adismap.com/bhiv,
Departamento de Salud EU/Fundación Henry Kaiser.
CV>10,000-20,000 copias/ml mas CD4 <500 por mm3 (0.50 x 109 /L).
Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV infected
adults and adolescents (August 13,2001)
www.hivatis.org/guidelines

32. CARGA VIRAL EN VIH
MONITOREO:
CV al tiempo del diagnostico y cada 3-4 meses en
pacientes no tratados.
CV debe medirse antes y 2-8 sem de inicio de
tratamiento
Objetivo del Tratamiento: Menor cantidad de copias
de RNA viral por el mayor tiempo posible.
Reducción inicial a 2- 8 sem.
Por debajo de los niveles detectables (<50
copias/ml) 16-20 sem.

33. CARGA VIRAL VIH
PRONOSTICO:
La CV se relación a con progresion de la
infección y supervivencia.
CV>40,000 copias/ml : 62% de pog. a SIDA en 5
años y una supervivencia a 5 años del 51%.
CV<5,000 copias/ml : 8% de prog. a SIDA en 5
años y supervivencia de 95% a 5 años
SIDA/ETS 1997;1:27-30

34. CARGA VIRAL EN VIH
Cambios en la carga viral:
Cambio significativo entre una y otra : 0.5
log10
Existen variaciones relacionadas al
procedimiento (menos de 0.3 log)
Puede haber discordancia entre los niveles
de carga viral y la cuenta de CD4

35. CARGA VIRAL EN VIH
• “Debido a la dinámica de la replicación viral in
vivo, pacientes que han suspendido algunas dosis
del Tx previas a la medición de la CV,
experimentan un incremento transitorio que puede
ser considerado como falla al tratamiento”.
Ann Intern Med 1997;126:983-85
• Ninguna decisión deberá tomarse solamente con
un solo resultado de CV.

36. CARGA VIRAL EN VIH
Factores que afectan la medición de la
carga viral:
Tipo de anticoagulante (depende del
método utilizado). Para PCR- EDTA o
ACD.
Tiempo de proceso
Presencia de eventos agudos e
inmunizaciones aumentan la carga viral.

37. CARGA VIRAL EN CMV
Citomegalovirus:
• Causa infeccionsa importante de morbi/mortalidad
post transplante
– Primaria: receptor seronegativo
– Secundaria: receptor seropositivo (reactivación endogena o
exogena (injerto)
• Enfermedad por CMV (ECMV) post transplate:
inespecifica, neumonitis, encefalitis, enterocolitis,
rinitis etc.
• RECHAZO
• Capacidad inmunodepresora: infeccion por
oportunistas
“PROFILAXIS”

38. TABLA 1. Enfermedad por CMV en receptores de órganos
Frecuencia de Organo
Organo
enfermedad por predispuesto a la
transplantado
CMV(%) infección
Riñón 8–32
Hígado Hígado
22–29
Corazón 9–35
Riñón - Pancreas
50 Pancreas
Intestino delgado 22
Intestino
corazón-pulmón 39–41
Pulmones

39. CARGA VIRAL EN CMV
El estudio virológico tiene como objetivos:
a) Conocer el estado inmune frente al CMV del donante
y receptor, previo al trasplante, para valorar el riesgo
de infección o de ECMV,
b) Diagnosticar precozmente la infección o la ECMV,
c) Guiar el inicio del tratamiento específico,
d) Monitorizar la respuesta a dicho tratamiento.
e) Detectar la aparición de cepas resistentes.

40. CARGA VIRAL EN CMV
¿Porque hacer carga?:
• Variedad de presentación de ECMV.
• Diferenciarlo de infecciones por oportunistas, efecto
tóxico de drogas o rechazo de transplante.
• Viremia asintomatica puede alterar curso post
transplante
• Asociación con rechazo (renal) o disfunción
organica (corazón)
• Dsiminución de la sobrevida
• Recurrencia de infección por CMV (25-36%
higado,6-31% riñon, 12% corazón)
• D+/R-, D-/R+
Clin. Microbio. Rev. Jan 2000:83-121

41. CARGA VIRAL EN CMV
“Diseminación de CMV en la sangre es un factor de
riesgo para progresión a la enfermedad por CMV”.
• Pacientes tranplantados MO
N. Engl. J. Med 1995. 324:1005–1111.
J. Infect. Dis 1990. 162:373–380.
• Transplantes organos solidos y pacientes con HIV
(menor valor predictivo)
Clin. Infect. dis 1997. 24:824-829
J. Infect. Dis. 1997. 176:1146–1155.
• Identificación de pacientes para profilaxis
(gangciclovir, valaciclovir etc)
J .Clin Microbil. 2000,38: 563-569,

42. Probabilidad de adquirir enf por CMV con carga viral
aumentada (Transpl. renal)
[Aitken, et al.; 1999. JCM. 37: 2804]

43. CARGA VIRAL EN CMV
• Altos niveles de DNA viral se asocian con el
desarrollo de sintomatologia en receptores
• Carga elevada = desarrollo de infección por CMV
en 2 meses
• Inicio de Tx = disminución carga
“Predice ECMV”
• Carga viral plasmática de 1,000-5,000 copias/ml en
receptores de órgano sólido
• Carga de 400 copias/ml en receptores de médula

44. Tabla: PCR cuantitativo: limites y presentaciones en diferentes pacientes
Transplante Referencia No Pac. Limites Presentación
Renal Fox et al 103 >106 copias/ml Alta
orina asociacion
con ECMV
Kuhn et al 58 >1,000 copias por Valo
cada 106 copias de predictivo
DNA cel. alto para
ECMV
Cope et al 196 Por cada 0.25 log 2.8%
de aumento carga incremento
CMV de riesgo de
ECMV
Toyoda et al 25 >500 copias por Aumenta
1ug del total de riesgo de
DNA ECMV
Hígado Cope et al 162 Por cada aumento 2.87%
de 0.25 log incremento
de riesgo de
ECMV

45. Tabla: PCR cuantitativo: limites y presentaciones en diferentes pacientes
Transplante Referencia No Pac. Limites Presentación
Corazón Toyoda et al 95 > 500 copias de Aumenta
DNA riesgo de
ECMV
Medula Zaia et al 117 >104 copias/ml Aumenta
Osea plasma riesgo de
ECMV 100
dias post
Gor et al 110 >104 copias/ml Aumnento de
plasma riesgo 6-10%
VIH Shinkai et al 94 >100 copias/ml Valor
plasma predictivo
alto para
ECMV
Rasmussen 75 >320 copias por ug Asociacion
et al de DNA con retinitis
Bowen et al 97 Cada 0.254 los de 1.37%
aumento aumento
reisgo

46. CARGA VIRAL EN CMV
Recomendaciones (WORKSHOP)
• Serologia (serostatus)
• CV en plasma, leucocitos u organos.
• CV una sem antes de Tx
• CV durante Tx para documentar resistencia
• Post Tx, continuarlo 1 semana con CV negativa

47. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
Virus hepatitis C:
•Virus RNA , flavovirus, existen 6 genotipos con casi 100
quasiespecies
•Genotipo 1menor respuesta a interferon.
•Genotipo 2 y 3 mejor respuesta a interferon.
•50-80% evolucionan a cronicidad
•En méxico 60% genotipo 1b
•Regiones para genotipificación: NS5B o E1

48. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
•Cantidad de virus específicos en un volumen dado de
sangre (1ml=1cc)
•Incidencia en el curso clínico= carga viral y genotipo
•Estandarización para reporte (OMS)
•Uso de UI = cantidad de RNA
•Carga viral:
–Establece pronóstico
–Indica y valora eficacia al tratamiento
•Genotipo:
–Marcador de predicción de respuesta a Tx
–Duración de Tx
–Seguimiento epidemiológico.

49. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
•Carga viral de base
•Pacientes genotipo 1 CV a las 12 sem de Tx = valora
respuesta virologica temprana (disminucion 2
logaritmos de carga o idetectable)
•Genotipo 2 y 3 no requiere (buena respuesta)
•CVa los 6 meses post a Tx valora respuesta virologica
sostenida:
–24 sem al genotipo 2 y 3
–48 sem al genotipo 1

50. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
•Objetivos Tx:
–Erradicar la infección viral,
–Evitar la progresión
–Eliminar el riesgo de contagio
•Indicación Tx:
– Menores de 60-65 años.
– Elevación persistente de ALT.
– Virémicos (necesaria carga viral)
– Datos de hepatitis crónica y fibrosis en la biopsia hepática.
Tx para todos = Idealmente SI

51. Razones a favor Razones en contra
Prevalencia del 1-3 % en la población En algunos pacientes, la progresión es
general. lenta.
Causa frecuente de hepatitis. Tasas variables de progresión a
fibrosis
Indicación frecuente de trasplante Se trata de un tratamiento caro, y sólo
hepático (50% en nuestro medio). eficaz en el 50%.
Evolución progresiva con aparición Los efectos colaterales de la
de complicaciones. medicación, son importantes y
limitantes de la dosis.
Beneficios del tratamiento en un plazo Administración parenteral (interferón)
corto.
Beneficios del tratamiento a largo Tratamiento prolongado (hasta 12
plazo meses).
Mejoría de la calidad de vida en los
que responden el tratamiento
Tratamiento con una buena relación
coste-beneficio

52. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
Conclusiones Grupos de trabajo (Criterios):
•Niveles de ALT elevados, al menos desde los seis
meses anteriores.
•Detección de RNA del VHC en suero.
•Enfermedad hepática compensada
•Paciente capaz de seguir el tratamiento y los controles.
•Seguridad de una abstinencia en el consumo de alcohol
y drogas.
•Biopsia hepática con fibrosis.
•Ausencia de contraindicaciones.

53. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
Factores pronósticos de una buena respuesta al Tx
•Edad menor de 40 años.
•Sexo femenino.
•Estadío de fibrosis grados 0-1, frente a grados 3-4.
•Viremia <2 x 106 copias/ml. (Carga Viral necesaria)
•Genotipos diferentes del 1, 4 y 5.
Duracion del Tx:
•Genotipo 2 y 3 seis meses.
•Genotipos 1, 4 ó 5: 12 meses,
“Excepto si la carga víral basal es <800.000 UI/ml”.
Carga viral necesaria

54. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
Carga viral: valoracion de respuesta terapeutica
•Post al Tx curación = respuesta
•Respuesta bioquímica, virológica e histológica,
– ALT normal.
– Negativización del RNA
– Disminución del índice de actividad histológica.
•Final del tratamiento respuesta primaria.
•Respuesta mantenida: RNA viral negativo 6 meses post
a fin del tx
•Carga negativizada a los 3 meses de TX = buen
pronóstico

55. "NO ES POBRE EL QUE TIENE MENOS,
SINO EL QUE DESEA MÁS. NI RICO EL
QUE MÁS TIENE, SINO EL QUE MENOS
AMBICIONA. EL QUE VIVE CONFORME
A LA NATURALEZA, NUNCA SERÁ
POBRE; EL QUE VIVE ATENTO AL QUE
DIRÁN, JAMÁS SERÁ RICO. LA
NATURALEZA EXIGE MUY POCO, LA
OPINIÓN DEL MUNDO MUCHÍSIMO"
Lucio Anneo SÉNECA (c. 5-65) Epistolae, 16