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energia livre de ativação. A velocidade de uma...
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Examinar a cinética da amilase salivar.
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Vi = Volume inicial.
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= ( 0,062 × 0,0048) ÷ 0,009
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Tube H5
CE =
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BIBLIOGRAFIA
 David Plummer, An Introduction to Practical Biochemistry 3rd
Ed.1987
 David Blicq, BIOCHEMISTRY-I LABOR...
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Relatório Enzimas UEM por D.Petter.

  1. 1. 1 1.INTRODUÇÃO As enzimas são catalisadores das reações que ocorrem nos sistemas biológicos. A presença e manutenção de um conjunto completo e equilibrado sistema de enzimas é essencial para a quebra de nutrientes para fornecer energia e construção de blocos químicos como a montagem dos blocos de construção em proteínas, DNA, membranas, células e tecidos. Como a exceção de alguns RNA catalítico chamado ribozimas, a grande maioria das enzimas são proteínas. A característica que distingue uma reação catalisada enzimaticamente é a de ela ocorrer no interior dos limites de uma cavidade na enzima chamada sítio ativo. A molécula que se liga ao sítio ativo e sítio ativo e sofre a ação da enzima é chamada substrato. Deficiências nas quantidade ou atividade catalítica de enzimas como nas desordens genéticas herdadas pode resultar em deficidade nutricionais ou toxinas. As enzimas são moléculas de importância fundamental na biomédica, exemplo; a medida da atividade de enzimas no plasma sanguíneo, eritrócitos ou amostras de tecido são importantes no diagnóstico de várias doenças. Além disso muitas drogas exercem seu efeito biológico por meio de interações com as enzimas. Também na indústria química as enzima são utilizado no processamento de alimentos e na agricultura. As enzimas podem ser classificadas de acordo com vários critérios. O mais importante foi estabelecido pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular(IUBMB), e estabelece 6 classes:  OXIDORREDUTASES:As enzimas que catalisam reações de transferências de elétrons (ion hidretos ou átomos de H)  TRANSFERASES:As enzimas que catalisam reações de transferência de grupos funcionais.  HIDROLASES:As enzimas que catalisam reações de hidrolise.  LIASES:As enzimas que catalisam reações de adição de grupos às duplas ligações ou formação de duplas ligações por meio de remoção de grupos.  ISOMERASES:As enzimas que catalisam reações de transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros.  LIGASES:As enzimas que catalisam reações de formação do tipo C - C, C - S, C - O e C - N por meio de reações de condensação acopladas á quebra do ATP.
  2. 2. 2 As enzimas como catalisadores aumentam a velocidade da reação reduzindo a energia livre de ativação. A velocidade de uma reação pode aumentar na ordem de 106 a 1012 vezes mais do que a reação correspondente não-catalisada. Três propriedades distintas das enzimas permitem que elas exerçam papel na promoção e regulação dos processos celulares, caracterizando-as como componentes vitais aos sistemas vivos: 1. Elevada especificidade da reação. Como regra geral, cada reação sob condições apropriadas é catalisada por uma enzima especifica. Diante de várias rotas potencialmente possíveis, a enzima escolhe a com menor energia livre de ativação. 2. Condições reacionais mais limitada: A atividade de cada enzima é dependente do pH, da temperatura, da presença de vários cofatores e das concentrações de substratos e produtos. 3. Capacidade de regulação da concentração e da atividade: Permite o ajuste fino do metabolismo em diferentes condições fisiológicas. Ultimo, mas não menos importante as enzimas possui a propriedade distinta de não ser consumida ou alterada ao participar da catálise. Esse propriedade é muito importante para manter a composição celular no fim de cada uma reação enzimática. No corpo humano a enzima amilase saliva é a enzima que devido à sua facilidade na obtenção, é mais usado nos estudos das atividade enzimática. Por isso os objetivos deste relatório são baseados neste enzima.
  3. 3. 3 2.OBJECTIVO 2,1. GERAL. Examinar a cinética da amilase salivar. 2,2. ESPECIFICO.  Analisar as diferença das absorbâncias antes e depois de adição de amilase no amido.  Preparação da curva padrão.  Determinar com auxilo do gráfico de Lineweaver-Burk os valores Km e Vmax e explique o seu significado. 3.PRINCÍPIO DO MÉTODO. A amilase saliva digere o amido por catalisar a hidrólise, que é a divisão de molécula de amido por meio da adição de moléculas de água. A cinética da amilase salivar pode ser analisado usando espectrofotómetro na técnica de espectrofotometria. A espectrofotometria é uma técnica analítica que utiliza a luz para medir a concentração de uma solução. Esse método utiliza propriedade de absorbância da solução. Absorbância (também chamada densidade óptica ) de um material é a proporção da radiação que incide sobre um material, para a radiação transmitida através da material.Com a técnica de espectrofotometria a absorbância de uma solução pode ser calculada usando a lei de Beer que diz ''a absorbância de uma solução é diretamente proporcional à concentração da solução (A ∝ Cs )'' Portanto usando a técnica de espectrometria podemos observar as diferenças de concentrações de amido antes de e depois de adicionar a enzima amilase. Neste experiência precisamos solução de iodo que forma o complexo azul escuro com amido. É este color( azul escuro) que é detectada por o espectrofotómetro que nos dar os valores de absorbância.
  4. 4. 4 4.MATERIAS E REAGENTES. 1% solução de amido. Água destilada. Banho - maria. Espectrofotómetro. Solução de iodo. Solução de saliva. Gelo. 5.PROCEDIMENTOS. EXPERIENÇIA 1. Pegou-se 6 tubos e marcou-se P1 a P6. Em cada tubo colocou-se 2 gotas de solução de iodo e adicionou-se soluções de amido e água destilada em acordo com a tabela a baixo. Passou-se as misturas pelo o centrífugo e mediu-se as absorbências no espectrofotómetro. Tubos P1 P2 P3 P4 P5 P6 Solução de amido(ml) 0 1,6 3,2 4,8 6,4 8 Água destilada(ml) 9 7,4 5,8 4,2 2,6 1 Absorbência 0 0,531 0,841 0,717 1,428 0,737 EXPERIENÇIA 2. Preparou-se cerca de 10ml de solução aquosa de saliva bochechando intensamente durante 2 minutos, e de seguida filtrou-se a solução com gaze. Numa série H1 a H6 de tubos contendo solução de amido e água com volumes idênticos aos da tabela anterior, adicionou-se 1ml da solução de saliva em cada tubo. Incubou-se cada amostra @ 35°C. Apos a incubação adicionou-se a 2
  5. 5. 5 gotas da solução de iodo. Depois colocou-se imediatamente os tubos num copo com gelo. Depois disso leu-se absorbência de cada tubo no espectrómetro: Tubos H1 H2 H3 H4 H5 H6 Absorbâncias 0 0,053 0,210 0,267 0,290 0,310 6.CALCULOS E RESULTADOS. Dados: 1.Concentração inicial de amido = 1% Significa que 1 grama de amido foi dissolvido em 100 ml de agua. ∴Concentração padrão(g/litre) =10g /L Molaridade inicial = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑖𝑑𝑜 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑖𝑑𝑜 = 10𝑔/𝐿 162,16𝑔/𝑚𝑜𝑙 = 0,062 mol/L 2.Volume final de solução de amido = 9 ml = 0,009 L calculando concentração final do amido na experiencia 1. Usando a Lei de diluição: Numero de moles antes de diluição = Numero de moles pois diluição. Concentração(molaridade) = 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑒 𝑣𝑜𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜 daí Numero de moles = molaridade × volume da solução (M × V) Portanto a lei de diluição Mi Vi = Mf Vf
  6. 6. 6 ∴Mf = (Mi Vi)÷ Vf Mi = Molaridade inicial Vi = Volume inicial. Mf = Molaridade final Vf = Volume final Usaremos a equação acima para calcular as contrações final do amido nos tubos PS.: Tubo P1 Concentração em % =0 Tubo P2 Mf = (Mi Vi)÷ Vf = (0,062× 0,0016) ÷ 0,009 = 0,011 mol/L ∴ Concentração padrao = 1,78 g/L Concentração em % = 0,178% Tubo P3 Mf = (Mi Vi)÷ Vf = ( 0,062 × 0,0032) ÷ 0,009 = 0,022 mol/L Concentração padrão = 3,57 g/L Contração em % = 0,357% Tubo P4 Mf = (Mi Vi)÷ Vf
  7. 7. 7 = ( 0,062 × 0,0048) ÷ 0,009 = 0,033 mol/L Concentração padrão = 5,35 g/L Concentração em % = 0,535% Tubo P5 Mf = (Mi Vi)÷ Vf = (0,062 × 0,0064) ÷ 0,009 = 0,044 mol/L Concentração padrão = 7,14 g/L Concentração em % = 0,714% Tubo P6 Mf = (Mi Vi)÷ Vf = (0,062 × 0,008) ÷ 0,009 = 0,055 mol/L Concentração padrão = 8,92 g/L Concentração em % = 0,82% TABELA DE ABSORBÂNCIA E CONCENTRAÇÕES Tubos P1 P2 P3 P4 P5 P6 Absorbânçia 0 0,455 0,788 1,003 1,040 1,282 Concentrações do amido % 0 0,178 0,357 0,535 0,714 0,82
  8. 8. 8 Como vimos no principio do método que, a espectrofotometria segue a lei de Beer, analisando a relação do lei concluirmos que o nosso deve ter a linha estreita como a curva padrão: Absorbência ∝ Concentração A ∝ Conc Introduzindo a sinal de igualdade em acordo de Beer A = 𝜀bConc Em que 𝜀 = absortividade molar (uma propriedade inerente de uma substância) b = Comprimento de caminho cuveta ( sempre 1cm ) Portanto: 𝜀b = constante (m) ∴ A = m Conc Como podemos ver a equação a cima é equação linear análogo ao y = mx. Daí provamos que a nossa curva padrão é linha estreita. A inclinação de gráfico é a constante (m) que é propriedade inerente de amido(absortividade molar de amido). A partir do gráfico: Inclinação (m) = 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎çã𝑜 𝑒𝑚 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎çã𝑜 𝑒𝑚 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑢𝑎𝑙 = 1,2−0,8 0,0,72−0,48 =0,67
  9. 9. 9 Calculando a concentração do amido para cada amostra após a hidrólise (CE) usando a curva padrão: Considerando que a inclinação de gráfico é a propriedade constante de amido, podemos calcular a concentração do amido para cada amostra após a hidrólise. Desde que Absorbência = 𝑚 × 𝐶𝑜𝑛𝑐 ∴ CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 Tube H1 CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 = 0% Tube H2 CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 = 0,0531 1,67 = 0,032% Tube H3 CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 = 0,210 1,67 = 0,13% Tube H4 CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 = 0,267 1,67 = 0,16%
  10. 10. 10 Tube H5 CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 = 0,290 1,67 = 0,17% Tube H6 CE = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑒 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 = 0,31 1,67 = 0,19% Calculando velocidade da reação para cada amostra: Usando a formula v = ∆𝐶 ∆𝑡 = CO – Ce 10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 V1 v = ∆𝐶 ∆𝑡 = CO – Ce 10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0−0% 10𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0 V2 v = ∆𝐶 ∆𝑡 = CO – Ce 10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,18%−0,032% 10𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,0148 V3 v = ∆𝐶 ∆𝑡 = CO – Ce 10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,4%−𝑜,13% 10𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,027 V4 v = ∆𝐶 ∆𝑡 = CO – Ce 10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,54%−0,16% 10𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,038 V5 v = ∆𝐶 ∆𝑡 = CO – Ce 10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,71%−0,17% 10𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,054
  11. 11. 11 V6 v = ∆𝐶 ∆𝑡 = CO – Ce 10 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,82%−0,19% 10𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑒𝑠 = 0,063 TABELA DE VELOCIDADE E CONCENTRAÇÃO Tubos H1 H2 H3 H4 H5 H6 Velocidade (V) 0 0,0148 0,027 0,038 0,054 0,063 Concentrações (Ce%) 0 0,032 0,13 0,16 0,17 0,19 1 𝑉⁄ 0 67,6 37 26,31 18,5 15,9 1 Ce⁄ % 0 31,3 7,7 6,3 5,9 5,3 7.DISCUSSÃO E CONCLUSÃO. A partir do gráfico ӀӀ, o gráfico obedece a equação linear 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑐. Além disso o gráfico obedece a equação de lineweaver-Burk, 1 𝑉𝑜 = 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 1 [𝑠] + 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 . Portanto a equação de lineweaver-Burk e a equação linear são análogo. Usando a equação de lineweaver-Burk , 1 𝑉𝑜 = 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 1 [𝐶𝑒] + 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 1.A inclinação = 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 = ∆ 1 𝑉 ∆ 1 𝐶𝑒 = 56−36 24−12 = 1,67 2.Em , 1 𝑉𝑜 – intercepto, 1 𝐶𝑒 = 0 ; Daí , 1 𝑉𝑜 – intercepto = 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 16 ∴ Vmax = 16-1 = 0,63. Este é velocidade atingida quando todas as moléculas da enzimas estiverem na forma do complexo ES e a concentração da enzima livre E for pequena. Nessa condições, a enzima está “saturada” com seu substrato e a velocidade da reação não aumenta mais com novos aumentos da [S]. 3.Em 1 [𝐶𝑒] – intercepto, 1 𝑉𝑜 = 0 ;
  12. 12. 12 Daí 0 = 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 1 [𝐶𝑒] + 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 − 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 1 [𝐶𝑒] 1 [𝐶𝑒] – intercepto = − 1 𝐾𝑚 = − 9,6 ∴Km = 9,6-1 = 0,104. Este é a concentração de amido quando a velocidade máxima de reação é metade.
  13. 13. 13 BIBLIOGRAFIA  David Plummer, An Introduction to Practical Biochemistry 3rd Ed.1987  David Blicq, BIOCHEMISTRY-I LABORATORY MANUAL TO7-A115  Bruening, Criddle, Preiss & Rudert, Biochemistry Experiments-John Wiley & Sons 1970  Motta. Bioquímica básica.2005.  Murray, R. K, Granner, D. K., Mayes, P. A.,& Rodwell, V. W.(2003). Harper's Illustrated Biochemistry(26th ed.):Lange Medical Books/McGraw- Hill.  Voet, D. Voet, G, J. Biochemistry(4th ed). NewYork: John Wiley & Sons, INC.  Nelson, D. L., & Cox, M. M (2005). Lehninger Principle of Biochemistry ( 4th ed.). New York: Worth Publisher.  Devlin, T. (1998).Text book of Biochemistry with clinical correlations (6th ed). John Wiley & Sons, INC., PUBLICATION

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