UNIVERSIDADE EDUARDO MONDLANE
FACULDADE DE AGRONOMIA E ENGENHARIA FLORESTAL
CURSO DE ENGENHARIA FLORESTAL

RELATÓRIO DE FI...
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1. Introdução
A enzima Nitrato Reductase é a principal enzima responsável pela assimilação de
nitrogénio pelas plantas e t...
2. Objectivos
2.1. Objectivo geral
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Estudar a actividade da enzima Nitrato Reductase nas folhas das plantas

2.2. Object...
O mais alto a NRa in vitro, mais nitrato está disponível para as plantas nas condições
naturais. Então, este teste dá uma ...
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2 Provetas de 150 ml

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Cronómetro (até 60 minutos)

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Médio de Incubação básico (preparado)

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Reagen...
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Levou-se as amostras de 0.5ml novamente (em duplicado) de cada tubo de ensaio

depois de exactamente 45 minutos.
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7. Resultados
Tabela 1. Absorvância à 540 nm
Tempo
Tubo A1
15 minutos 0.046 0.057
45 minutos 0.01 0.015
Depois dos 0.048 0...
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A planta que tem mais Nitrato Reductase actual é o feijão nhemba (Vigna unguiculata)

em relação ao amendoim (Arachis h...
10. Bibliográfia

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Salisbury, F.B. e C. W. Ross (1991). Plant Physiology. 4a edição. 682pp. Wadsworth

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Nitrato Reductase

  1. 1. UNIVERSIDADE EDUARDO MONDLANE FACULDADE DE AGRONOMIA E ENGENHARIA FLORESTAL CURSO DE ENGENHARIA FLORESTAL RELATÓRIO DE FISIOLOGIA VEGETAL Tema: NiTraTo reduTase iN vivo Nas folhas das plaNTas G4 – 1o Grupo Docente: Prof. Dr. Orlando Quilambo Discentes: Chaúque, Milton Domingos Dra. Célia Martins Juízo, Cláudio Gumane Monitora: Abdula, Cházia Gulamo Mamugy, Faruk P. Semedo Reis, Sérgio Joaquim Cinco . Maputo, Maio de 2007
  2. 2. 2
  3. 3. 1. Introdução A enzima Nitrato Reductase é a principal enzima responsável pela assimilação de nitrogénio pelas plantas e tem a actividade fortemente afectada pela disponibilidade de água no solo, por isso é usada como variável na avaliação das plantas em diferentes condições ambientais (http://www.cpa.unicamp.br/sbfv/journal/pdfs/v4n1/v4n1p55.pdf). Nitrato Reductase é a enzima que reduz o nitrato (NO3-) para nitrito (NO2-). Catalisa o primeiro passo pelo qual o absorvido pelas raízes é assimilado na forma orgânica (Taiz e Ziger, 2004). Segundo Salisbury & Ross, (1992), o caminho bioquímico do nitrato para os aminoácidos é regulado por uma variedade de factores internos e externos, como a concentração de nitrato, a composição de aminoácidos, a luz, o CO 2 e as hormonas da planta. Segundo Oaks (1994) citado por Taiz e Ziger (2004), as plantas assimilam a maioria do nitrato absorvido por suas raízes em compostos orgânicos nitrogenados. A primeira etapa do processo é a redução do nitrito no citoplasma. A Nitrato Reductase cataliza esta reacção: NO3- + NAD(P)H + H+ NR NO2- + NAD(P)+ + H2O As nitratos redutases das plantas superiores são formadas por duas subunidades idênticas com três grupos prostécticos cada: FAD (Flavina Adenina Dinucleotídeo), heme e um complexo formado entre o molibdénio e uma molécula orgânica denominada pterina (Mendel e Stalmeyer, 1995; Campbell, 1999 Citados por Taiz e Ziger, 2004). A actividade da enzima Nitrato Redutase é afectada por vários factores. Nas folhas e caules, a luz aumenta a actividade da enzima Nitrato Redutase quando NO3- está disponível. A luz actuando através da fotossíntese promove a actividade da enzima Nitrato Redutase porque aumenta o suprimento de carbohidratos e o NAD(P)H necessário para a redução de nitrato é produzido através destes carbohidratos (Salisbury & Ross, 1992). 3
  4. 4. 2. Objectivos 2.1. Objectivo geral • Estudar a actividade da enzima Nitrato Reductase nas folhas das plantas 2.2. Objectivo específico • Medir a actividade da enzima Nitrato Reductase nas folhas de feijão nhemba (Vigna unguiculata) e Amendoim (Arachis hipogea); • Verificar qual planta tem mais Nitrato Reductase actual e qual tem mais Nitrato Reductase Potencial; • Determinar a diferença entre o Nitrato Reductase actual e o Nitrato Reductase Potencial. 3. Método / Princípio Nesta experiência nós mediremos a actividade da Nitrato Reductase de algumas plantas com o método in vivo. Nós adicionaremos nitrato (substrato) para as partes verdes em uma solução tampão. A nitrato entrará nas células da folha pelas margens cortadas em uma difusão simples. Para facilitar este processo de difusão, é adicionado n-propanol que faz as membranas mais permeáveis para o substrato e o produto (nitrito). O nitrato será reduzido nas células pela enzima de NRa, usando o NADH disponível nas células. As células serão mantidas no escuro, enquanto prevenindo a formação de ferredoxina reduzida, e o nitrito produzido difundirá em parte fora das células no meio, onde pode ser medido com uma técnica colorimétrica simples. Usando uma linha de calibração para absorvancia a 540 nm de várias quantidades de nitrito, nós podemos determinar a quantidade de nitrito produzidas pelas células de planta em nmol ou µmol NO 2- por hora por grama de peso fresco de folhas. Normalmente esta é uma expressão muito boa da actividade de NRa actual nas folhas. 4
  5. 5. O mais alto a NRa in vitro, mais nitrato está disponível para as plantas nas condições naturais. Então, este teste dá uma indicação boa do nitrato disponível na terra, mas também da capacidade da planta para absorver nitrato e usa isto como uma fonte de nitrogénio. Plantas com um NRa alto normalmente são plantas nitrófilas para qual a maioria de nossas plantas de colheita pertence. 4. Materiais e Métodos 4.1. Equipamento e material experimental • Folhas verde fresco e maduro de algumas plantas herbáceas (2 espécies diferentes) • Balança electrónica • Banho-maria a 30 º C • Banho-maria a 100º C • Espectofotómetro a 540 nm • Cuvetas • Medidor de pH • Tesouras ou facas afiadas • Placas de Petri com tampas (uma por espécie) • Papel absorvente • 40 Tubos de ensaio limpos e secos • 4 Rolhas de borracha de tubo de ensaio • Prateleira de tubos de ensaio, para 24 tubos de ensaio em banho-maria • Chapa de alumínio • Pipetas automáticas (10 ml e 1ml) com gorjetas • Papel milimétrico • 2 Balões volumétricos de 100 ml • Proveta medindo 100 ml 5
  6. 6. • 2 Provetas de 150 ml • Cronómetro (até 60 minutos) 4.2. Soluções • Médio de Incubação básico (preparado) • Reagente 1 • Reagente 2 • Médio de incubação A • Médio de incubação B • Solução de Nitrato padrão 5. Procedimentos • Levou-se algumas folhas verdes frescas e maduras de duas espécies diferentes, de ervas e enxaguou-se na água da torneira. • Secou-se, removeu-se as nervuras grandes e cortou-se as folhas em pedaços pequenos de cerca de 0.5 x 0.5 cm. Manteve-se os pedaços de folha até o seu uso em uma placa de Petri com papel absorvente humedecido de modo a impedir que secassem. • Pôs-se aproximadamente 0.2 g (previamente pesados) de pedaços de folha misturados de espécies 1 (Feijão) em tubos de ensaio A1 e B1. Fez-se o mesmo para as espécies 2 (Amendoim) em tubos de A2 e B2. • Embrulhou-se o quarto tubos de ensaio em papel de alumínio de modo a impedir que a luz entrasse. Adicionou-se aos tubos A1 e A2, 5 ml de Meio de Incubação A e no tubo B1 e B2, 5 ml de Meio de Incubação B. Fechou-se os tubos com rolhas de borracha e colocou-se em banho-maria à 30ºC. • Depois de exactamente 15 minutos abriram-se os tubos, tirou-se duas amostras de 0.5 ml de cada tubo de ensaio e fechou-se novamente. Deixou-se no banho-maria. 6
  7. 7. • Levou-se as amostras de 0.5ml novamente (em duplicado) de cada tubo de ensaio depois de exactamente 45 minutos. • Depois de levar-se as últimas amostras, pôs-se os tubos, sem rolhas em um banho- maria fervente durante 2 minutos, removeu-se e levou-se as amostras finais de 0.5 ml (duplicada). • Todas as amostras foram postas em tubos de ensaio limpos e secos. Depois de todas as amostras terem sido coleccionadas e postas nos tubos de ensaio, procedeu-se da seguinte maneira: • Acrescentou-se primeiro a cada uma das amostras de 0.5 ml 1.5 ml de água destilada. • Adicionou-se 1.0 ml de reagente 1 (sulfanilamide) e misturou-se bem. • Adicionou-se 1.0 ml de reagente 2 (NED) e misturou-se bem novamente. • Deixou-se durante 15 minutos a temperatura ambiental. • Mediu-se a absorvência a 540 nm em espectofotómetro. Usou-se como branco 0.5 ml de meio A ou B (dependendo do tratamento da amostra) com 1.5 ml de água destilada e 1ml de reagente 1 e 1ml de reagente 2. 6. Linha de calibração • Pipetou-se 10.0 ml da solução de nitrito padrão para um balão volumétrico de 100 ml e encheu-se a marca com água destilada. • Pipetou-se da solução de nitrito padrão diluída as quantidades seguintes em tubos de ensaio limpos e secos (tudo em duplicado): 0.0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 e 1.0 ml. Acrescentou-se água destilada a estes tubos para compor um volume de exactamente 2.0 ml. • Adicionou-se 1.0 ml do reagente 1 (sulfanilamide) e misturou-se bem. • Adicionou-se 1.0 ml do reagente 2 (NED) e misturou-se bem novamente. • Deixou-se durante 15 minutos a temperatura ambiente e mediu-se a absorvência a 540 nm em spectofotómetro. 7
  8. 8. 7. Resultados Tabela 1. Absorvância à 540 nm Tempo Tubo A1 15 minutos 0.046 0.057 45 minutos 0.01 0.015 Depois dos 0.048 0.051 Média 0.0515 0.0125 0.0495 Absorvância a 540 nm Tubo A2 Média Tubo B1 Média Tubo B2 Média 0.049 -0.008 0.0205 0.05 0.045 0.0475 0.015 0.02 0.0175 0.003 0.009 0.006 0.082 0.287 0.1845 0.000 0.048 0.024 0,074 -0,004 0.035 0.040 0,032 0.036 0,018 0,042 0.03 100ºC Tabela 2: Linha de calibração Volume de Nitrito (ml) 0,0 0,2 -6 Concentração de Nitrito (x 10 M) 0,0 1,0 -0.205 -0.214 Absorvância 0,4 2,0 0.006 0,6 3,0 -0.201 0,8 4,0 -0.152 1,0 5,0 -0.181 8. Discussão A planta que tem o NRa actual mais alto é a Vigna unguiculata. A planta que tem o NRa potencial mais alto é também a Vigna unguiculata. Segundo Sivasancar e Oaks (1996) citados por Taiz e Zeiger (2004), o nitrato, a luz e os carbohidratos interferem no nitrato redutase em nível de transcrição e tradução. A luz e os níveis de carbohidratos, alem de outros factores ambientais, estimulam a proteína fosfatase, que desfosforila vários resíduos de serina na proteína nitrato redutase, promovendo a activação da enzima (Taiz e Zeiger, 2004). Segundo Kaiser e Colls (1999) citados por Taiz e Zeiger (2004), agindo na direcção inversa, o escuro e o Mg + estimulam a proteína quinase, a qual fosforila os mesmos resíduos de serina, interagindo com a proteína inibidora 14-3-3 e inactivando a nitrato redutase. Depois de ferver a amostra final, embora haja algumas variações, a tendência é de aumentar a absorvância provavelmente porque com o aumento da temperatura haverá um aumento de citocromo que aumenta a síntese de várias proteínas, incluindo NRa através dos ribossomas (Salisbury & Ross,1992). 9. Conclusão 8
  9. 9. • A planta que tem mais Nitrato Reductase actual é o feijão nhemba (Vigna unguiculata) em relação ao amendoim (Arachis hipogea). • A planta que tem mais tem mais Nitrato Reductase Potencial é o feijão nhemba (Vigna unguiculata) em relação ao amendoim (Arachis hipogea). • A diferença entre o Nitrato Reductase actual e o potencial esta na acção da enzima reductase durante a transformação de nitrato em nitrito. 9
  10. 10. 10. Bibliográfia • Salisbury, F.B. e C. W. Ross (1991). Plant Physiology. 4a edição. 682pp. Wadsworth Publishing Company, Belmont, California – EUA • Taiz, L. e E. Zeiger (2004). Fisiologia Vegetal. 3a edição. Artmad Editora, Califórnia. 719pp. • http://www.cpa.unicamp.br/sbfv/journal/pdfs/v4n1/v4n1p55.pdf, 04/05/2007; 11:22 h 10

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