Identificação e quantificação de cocaína em urina e sangue

SECRETARIA DA SEGURANÇA
PÚBLICA DO ESTADO DA BAHIA
Seção de
Laboratório Central DEPARTAMENTO DE POLÍCIA TÉCNICA
Análise
de Polícia Técnica Instrumental

IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE
COCAÍNA EM URINA E SANGUE
UTILIZANDO EXTRAÇÃO EM FASE
SÓLIDA E CROMATOGRAFIA
GASOSA ACOPLADA A
ESPECTROMETIA DE MASSA ( GC/MS)

Cristóvão Macedo Dantas
Químico
Perito Técnico de Polícia
Chefe da seção de Analise instrumental do L.C.P.T.

Seção de
Análise

SUMÁRIO PÁGINA

1. INTRODUÇÃO 1
2. GENERALIDADES 1
3. METABOLISMO DA COCAÍNA 3
4. ASPECTOS DE SEGURANÇA 3
5. NORMAS A CONSULTAR 3
6. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA 3
7. DEFINIÇÕES 4
8. ASPECTOS ANALITÍCOS 4
9. MATERIAL NECESSÁRIO 4
9.1 EQUIPAMENTOS E INSTRUMENTOS 4
9.2 REAGENTES E SOLUÇÕES 5
9.3 BRANCOS DE REFERÊNCIAS 5
10. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO 6
11. ANEXOS 7
1- EXTRAÇÃO E SILANIZAÇÃO DE COCAÍNA EM URINA 8
2- PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE P/ QUANTIFICAÇÃO 9
3- CONDIÇÕES CROMATOGRAFICAS 10
4- CROMATOGRAMA DE CASO POSITIVO ( AMOSTRA DE URINA) 11
5- PESQUISA DE SIMILARIDADE 12
6- CASO POSITIVO DE COCAÍNA ( AMOSTRA DE SANGUE ) 13
7- CURVA DE CALIBRAÇÃO P/ QUANTIFICAR COCAÍNA 14
8- ESPECTRO DE MASSA (CODEÍNA-TMS E BENZOILECGONINA-TMS) 15

Seção de
Análise
1

1- INTRODUÇÃO

A cocaína é um forte estimulante do sistema nervoso central que, quando utilizado
como fármaco de abuso, causa dependência física e psíquica com possibilidade de
ocorrência de intoxicação aguda e letal por overdose.
Problemas pertinentes à rápida e composta transformação, e possibilidade de hidrólise
espontânea e enzimática “in vitro”, fazem com que a quantificação da cocaína em
material biológico, represente um problema analítico aos toxicologistas.
Com a finalidade de desenvolvimento de uma metodologia para a identificação e
quantificação de cocaína nos níveis sangüíneos compatíveis com a intoxicação aguda,
foi padronizada uma técnica na qual identificamos este fármaco em urina e em sangue,
utilizando-se cromatografia em fase gasosa com o uso de detetor espectrométrico de
massa equipado com coluna capilar de polimetilsiloxano com 5% de fenil em sílica
fundida, 250 µm de diâmetro interno, 0,25µm de espessura do filme e 25m de
comprimento. A otimização da técnica de extração em fase sólida e da quantificação,
propiciou um limite de detecção em concentrações sangüíneas acima de 50ηg/mL.

2 - GENERALIDADES

Alcalóides são substâncias sintetizadas por vegetais que se caracterizam por
apresentarem intensa atividade fisiológica no organismo humano. Possuem na sua
cadeia carbônica um heteroátomo de nitrogênio e por isso tem caráter alcalino, de onde
deriva-se a palavra alcalóide. São considerados base de Lewis. Os alcalóides do grupo
tropano são ésteres de ácidos atrópicos, trópicos e benzóicos entre outros, do qual a
cocaína faz parte.
A cocaína (Éster Metílico de Benzoilecgonina), fármaco que pertence, juntamente com a
atropina e a escopolamina, à família dos alcalóides naturais tipo tropano, apresenta
fórmula empírica C17H21NO4, e estrutural descrita a seguir:

Ocorre naturalmente nas folhas provenientes de duas espécies do gênero Erythroxylon,
vulgarmente denominado de coca. A Erythroxylon coca é composta por folhas
pequenas contendo 0,5 a 2,0% de coca. A droga é extraída destas folhas, em duas
etapas: Na primeira, as folhas são prensadas juntamente com ácido sulfúrico e
querosene, originando uma pasta que contém aproximadamente 90% de sulfato de
cocaína; na segunda etapa, para remover as impurezas remanescentes, a pasta é
tratada em meio básico com éter etílico, originando um extrato que contém cocaína na
forma alcaloidal 3.

Seção de
Análise
2

Este extrato reage com ácido clorídrico obtendo-se o cloridrato de cocaína, forma na qual
é comercializada. Esta mesma substância também pode ser obtida sinteticamente em
laboratório.
A “droga de rua”, obtida a partir da diluição do cloridrato de cocaína com adição de
adulterantes normalmente açúcares, talco e sais de baixo custo, como o sulfato de
magnésio. Após a adulteração a droga apresenta concentrações de cocaína entre 15 e
90%. O cloridrato de cocaína é um pó branco cristalino, que apresenta ponto de fusão de
o
aproximadamente 197 C, com decomposição. É solúvel em água, parcialmente solúvel
em éter etílico e pouco solúvel em clorofórmio.
A forma básica da coca, chamada base livre ou cocaína alcaloidal é substância cristalina,
branca ou transparente, com odor característico, levemente volátil e com ponto de fusão
entre 96 e 98oC, não se decompondo em temperaturas requeridas para a sua
vaporização. É solúvel em etanol, acetona e praticamente insolúvel em água.
Em virtude destas propriedades a coca na sua forma básica, ao contrário da forma de
cloridrato, presta-se para ser fumada e é comercializada ilicitamente em pequenos
pedaços cristalinos que recebem o nome de “Crack” (craque ou rock). O uso da coca
nesta forma é feito através de cachimbos ou em cigarros de maconha ou de tabaco. A
extensa área de superfície dos pulmões favorece a efetiva absorção. A ação rápida e
efeitos intensos, são comparáveis aos que se seguem à administração intravenosa. A
meia-vida da absorção para a coca (fumada) é muito rápida - da ordem de 1 minuto, já a
utlização de coca via intranasal (aspiração nasal) ou pela mucosa bucal tem baixa
velocidade de absorção devido às propriedades vasoconstritoras do fármaco, com meia-
vida de absorção na ordem de 30 a 90 minutos 4 .
O caráter lipofílico da cocaína faz com que atravesse prontamente as barreiras
biológicas. Dados experimentais sugerem que a coca se acumula nos tecidos adiposos e
no sistema nervoso central, resultando concentrações até quatro vezes maiores que as
plasmáticas, com posterior liberação desses sítios de armazenamento.
Em exames toxicológicos realizados em tecidos provenientes de necropsia, em casos de
overdose, as concentrações mais elevadas de coca são encontradas na urina e nos rins,
seguidas pelas concentrações no cérebro e biles.
As dificuldades para se estabelecer as doses teóricas, e mesmo letais, devem-se às
características cinéticas que variam com o tipo de eliminação, o grau de pureza da droga
e a natureza da ação dos eventuais adulterantes.
Os níveis sanguíneos determinados em amostras pós-morte, não podem ser
interpretadas como aquelas que levam ao óbito, pois a remoção espontânea ou
enzimática da coca, pré e pós-morte, servem, entretanto, como indicadores, pois não há
referência de níveis acima de 1,0µg/mL, correlacionados com efeito de euforia, ou seja,
concentrações desta ordem, constituem forte indício de que houve intoxicação por
overdose 4.
De fato, concentrações definidas como letais estão entre 1 e 25µg/mL, embora valores
tão altos quanto 211µg/mL tenham sido reportados como casos letais acidentais, devido
ao rompimento de sacos plásticos contendo cocaína em estômago de traficantes (as
chamadas mulas) 4 .

Seção de
Análise
3

3 - METABOLISMO DA COCAÍNA

No organismo a cocaína é transformada (hidrólise e conjugação), sendo eliminada
principalmente na urina em forma metabolizada e de 10 a 25% na forma inalterada.
Devido ao fato de ser rapidamente metabolizada, os efeitos da cocaína são pouco
duráveis, e a depressão crônica é uma das razões das repetidas doses em curto espaço
de tempo.

Principal Metabólito. (Benzoilecgonina - B E G )

4. ASPECTOS DE SEGURANÇA

Usar luvas cirúrgicas ao manusear as amostras, por se tratarem de potenciais fontes
de contaminação de doenças diversas. Observar, também, as recomendações de
segurança (uso de óculos e capela) relativas ao manuseio dos reagentes e soluções.

5. NORMAS A CONSULTAR

Manual de Operação do GC/MS Shimadzu (GC17A/QP-5000)

6. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA

1- CLARKE’S. Isolation and identification of drugs, second edition
2- PFLEGER, H. H. MAURER, A. WEBER. Mass Spectral and CG data of drugs,
poisons, pesticides, pollulants and their metabolites, second, revesed and
enlarged edition.
3- JOHANSON CHRIS-ELLYN. Tudo sobre Drogas- Cocaína- nova cultural 1988
4- CHASIN, ALICE A. DA MATTA. Identificação e quantificação de Cocaína
(Tese de mestrado) USP

Seção de
Análise
4
7. DEFINIÇÕES
GC/MS - cromatografia a gás/espectrometria de massa
IE - impacto de elétrons
P.A. - para análise
SPE - extração em fase sólida
m/z - relação massa carga
+
M - ion molecular
BEG -TMS - benzoilecgonina trimetilsilanizado
ABN - cartucho de extração em fase sólida
(BSTFA+1% TMCS) - reagente derivatizante

8 - ASPECTOS ANALÍTICOS
Para triagem da presença de cocaína no organismo, a urina é muito importante, pois
neste material há uma concentração elevada da referida droga em forma inalterada
(cocaína), bem como seu principal produto de biotransformação, a benzoilecgonina
(BEG). Após a triagem e constatação positiva, procede-se a extração e quantificação do
fármaco no sangue.
O armazenamento de amostras de urina deve ser feito sob baixa temperatua para evitar
a hidrólise. Já as amostras de sangue, além da recomendação relativa à urina, deve-se
acondiciona-las em recipientes contendo fluoreto de sódio, para minimizar a hidrólise
química espontânea e enzimática, além de atuar como anticoagulante.
Para a quantificação, a codeína (metilmorfina), que é um alcalóide natural extraído do
ópio ou obtido por metilação da morfina, foi escolhida como padrão interno, o qual sofre
processo de silanização gerando o ion quantificador M+ = 371u.m.a., que é bastante
estavel, e de ótima abundancia relativa. o limite de quantificação obtida no método foi
acima de 50ηg/mL para a cocaína, prestando-se portanto às análises nos níveis
sanguineos típicos dos casos de óbito por overdose.

9 - MATERIAIS NECESSÁRIOS:
9.1 - Equipamentos e Instrumentos
a) balança;
b) centrífuga Fanem 215;
c) banho com controle de temperatura;
d) tubo de centrífuga cônico com tampa rosqueável;
e) cartucho SPE Speed ABN da Applied Separation;
f) sistema de eluição a vácuo (Vacuum Elution Speed-Mate 10);
g) agitador de tubos;
h) frasco de derivatização de 4mL com tampa rosqueável;
i) cromatógrafo a gás com detetor de massa Shimadzu GC17A/QP-5000;
j) coluna capilar em sílica fundida com 250 µm de diâmetro interno e 25m de
comprimento SE-30 (com 0,25µm de espessura do filme)
k) micro seringa;
l) cilindro de Helio de alta pureza;
m) cilindro de nitrogênio comercial.
n) fôrno de microondas Brastemp.

Seção de
Análise
5

9.2 - Reagentes e Soluções

a) fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) P.A.;
b) fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) P.A.;
c) tampão fosfato pH 6;
• 9,073g de fosfato de sódio dibásico em 1 litro de água destilada - Solução A
• 9,485g de fosfato de potássio monobásico em 1 litro de água destilada -
Solução B
• adicionar 80mL da Solução A a 20mL da Solução B e ajustar o pH para 6
através de gotejamento de ac. acético1M em béquer submetido a agitação
magnética e monitorando com potenciômetro;
d) solução de sulfato de zinco 1N;
e) hidróxido de amônio P.A.;
f) solução de diclorometano/isopropanol 80/20(v/V);
g) solução de hidróxido de amônio 2% em diclorometano/isopropanol 80/20 (preparar
no dia da análise);
h) metanol P.A.;
i) ácido acético P.A. (99,5%);
j) solução de ácido acético 1N;
• transferir 57mL para um balão volumétrico de 1000mL;
• completar o volume com água destilada.
k) acetato de etila P.A.;
l) água destilada;
m) BSTFA + 1% de TMS (bistrimetilsililtrifluoracetamida com 1% de trimetilclorosilano);
n) solução etanólica de codeína 0,26%P.
o) solução de codeína 270,4ng/µL;
• transferir 2,6mL da solução de codeína 0,26% para um balão volumétrico de
25mL;
• completar o volume com metanol P.A.
p) solução de ácido fosfo-tungstico 0,03 M;
• dissolver 25g do Ácido fosfotungstico em 250mL de água destilada, aquecida

9.3 - Brancos de Referência

• amostras de urina;
• amostras de sangue provenientes de cadáveres humanos sem histórico de uso
de drogas;
• às amostras de sangue foram adicionado fluoreto de sódio de maneira a se
obter uma concentração final de 5g/L.

Seção de
Análise
6

10 - DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

Sendo ínfimos os niveis de cocaína e seus produtos de biotransformação em materiais
biológicos, devido as concentrações que causam intoxicação letal por over-dose serem
baixas e a rapidez na eliminação da droga pelo organismo humano, dificuldades para
sua detecção são gerados. Estes motivos nos levaram ao desenvolvimento de uma
metodologia, utilizando extração em fase sólida a qual reduz o consumo de reagentes e
produz uma matriz bastante limpa ideal para analises por cromatografia gasosa com
detector de massa (GC/MS).
A cocaína uma substância orgânica de baixa polaridade, presta-se para ser analisada
por comatografia em fase gasosa, o que não acontece com o seu principal produto de
biotransformação a benzoilecgonina ( BEG ), que quando encontrada na urina fornece
indicios de que o individuo utilizou coca (paciente) ou morreu por over-dose. Por este
motivo lançamos mão de técnicas de derivatizacões “Silanização”, usando o N,O-
bistrimetilsililtrifluoracetamida (BSTFA+1%TMS), obtendo-se a BEG-TMS, derivado
silanizado da benzoilecgonina, que é facilmente detectada por GC/MS.
Após esta etapa, no caso de cadáveres, procede-se a quantificação da cocaína
remanescente no sangue, usando a codeína no padrão interno e obtendo-se valores de
concentrações que nos indicam a posivel dose letal.
Como o processo analítico de identificação do fármaco é a GC/MS, que gera o especto
de massa da substância questionada, e esta técnica é considerado a impressão digital
da substância, comparações do espectro obtido com os presentes nas três bibliotecas
do equipamento (QP-5000), as quais perfazem cerca de oitenta e cinco mil, fornecen
índices de similaridades superiores a 90%, logo indicam de maneira segura e inequívoca
a presença da droga no material periciado.

Seção de
Análise
7

ANEXOS

Seção de
Análise
8

1- EXTRAÇÃO E SILANIZAÇÃO DE COCAÍNA EM URINA.
5mL de urina

4,0mL de Tampão Fosfato
pH da amostra ≅ 6,0

Agitar em vortex

Condicionar
cartucho (ABN)
2,0mL de Metanol
2,0 mL de H2O
2,0mL Tampão Fosfato Aspirar amostra
no cartucho
2,0 mL de H2O
1,0mL de Ac. Acético 1,0N
2,0mL de Metanol Secar Cartucho
sob vácuo

Eluir c/ 3mL de
solvente de coca

Evaporar o
Solvente sob N2
µ
50µL de Acetato de etila
µ
50µL de Ag. Derivatizante
Obs.
Solvente de Coca 5 min. µW
Hidróxido de Amônia 2,0% em Potencia = 3 Fragmentos Pesquisados:
Dicloro Metano : Isopropanol
(80:20) M+ = 303 - Cocaína
µW=Microondas
m/z 317 - Coca etileno
Ag. Derivatizante
( BSTFA + 1% de TMCS ) Injetar 1 µL no m/z 361 - BEG-TMS
(ABN) =Cartucho de Extração GC/MS (FULL SCAN)

Seção de
Análise
9
2- Preparação das Amostras de Sangue p/ Quantificação
Tubo de
centrifuga (A)
5,0mL de Sulfato de zinco
µ
500µL de ac. Fosfotungístico

Tubo de
centrifuga (B) 5,0mL de Sangue
µ
20µL de Pad. Codeína
4,0mL de Tampão Fosfato
Juntar conteudo
de B em A
4,0mL Tampão Fosfato

Repousar por
5 minutos

Centrifugar por
20 min a 2800
rpm
2,0mL de Metanol
2,0 mL de H2O
2,0mL Tampão Fosfato Aspirar amostra
no cartucho
2,0 mL de H2O
1,0mL de Ac. Acético 1,0N
2,0mL de Metanol Secar Cartucho
sob vácuo

Eluir c/ 3mL de
solvente de coca

Evaporar o
Solvente sob N2
Obs.
µ
50µL Acetato de etila
µ
50µL Ag. Derivatrizante
5 min. µW
Potencia = 3 Fragmentos quantificadores:
Solvente de Coca
Hidróxido de Amônian 2,0% em M/Z=182 Cocaína
Dicloro Metano : Isopropanol (80:20) Injetar 1 µL no M/Z=371 COD-TMS
GC/MS (MODO SIM)

Seção de
Análise
10

3- CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS

Seção de
Análise
11

4- CROMATOGRAMA DE CASO POSITIVO
(AMOSTRA DE URINA)

Seção de
Análise
12

5- PESQUISA DE ÍNDICE DE SIMILADADE

Seção de
Análise
13

6- CASO POSITIVO DE COCAÍNA
(AMOSTRA DE SANGUE)

Seção de
Análise
14

7- CURVA DE CALIBRAÇÃO P/ QUANTIFICAR COCAÍNA

Seção de
Análise
15

8- ESPECTRO DE MASSA
(CODEÍNA-TMS E BENZOILECGONINA-TMS)

Identificação e quantificação de cocaína em urina e sangue

Recomendados

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Mais procurados

Mais procurados (20)

Mais de cmdantasba

Mais de cmdantasba (20)

Identificação e quantificação de cocaína em urina e sangue