Identificação de Carboxi-THC em Usuários de Maconha

SECRETARIA DA SEGURANÇA
PÚBLICA DO ESTADO DA BAHIA
Seção de Análise
Laboratório Central de DEPARTAMENTO DE POLÍCIA TÉCNICA Instrumental
Polícia Técnica

IDENTIFICAÇÃO DE

CARBOXI-THC

EM USUÁRIOS DE MACONHA

Cristóvão Macedo Dantas
Químico
Perito Técnico de Polícia Civil
Chefe da Seção de Análise Instrumental do L.C.P.T.

Seção de Análise
Polícia Técnica

SUMÁRIO PÁGINA

1. OBJETIVO 1
2. INTRODUÇÃO 1
3. CAMPO DE APLICAÇÃO 1
4. NORMAS A CONSULTAR 1
5. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA 1
6. DEFINIÇÕES 1
7. DESENVOLVIMENTO 2
7.1 PRINCIPIO BÁSICO E RESUMO DO PROCEDIMENTO 2
7.2. APLICAÇÃO 2
7.3. RESPONSABILIDADE 2
7.4. MATERIAIS NECESSÁRIOS 2
7.4.1. EQUIPAMENTOS E INSTRUMENTOS 2
7.4.2. REAGENTES 2
7.5. ASPECTOS DE SEGURANÇA 3
7.6. PROCEDIMENTOS 3
7.6.1. PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS DE URINA 3
7.6.2. EXTRAÇÃO DO THC-COOH 3
7.6.3. DERIVATIZAÇÃO 3
7.7. DIAGRAMA DE BLOCO 4
8. LAUDO 5
9. CONCLUSÃO 6
10. ANEXOS 7
10.1 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS - 1 8
10.2 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS - 2 9
10.2 ESPECTRO DE MASSA 10
10.3 CROMATOGRAMA DE CASO POSITIVIVO 11
10.4 PESQUISA DE SIMILARIDADE 12
10.5 ESTRUTURA DO CARBOXI-THC BIPENTAFLUORPROPIONILADO 13
10.6 FRAGMENTAÇÃO - 1 14

10.7 FRAGMENTAÇÃO - 2 15

Seção de Análise
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1. OBJETIVO

Confirmação do uso de maconha, através da detecção de seu principal metabólito e agente
psicoativo, o Carboxi-THC.

2.INTRODUÇÃO

As dificuldades técnico-analíticas aliadas a não existência de metodologias que forneçam
resultados confirmatórios posítivos ou negativos para Cannabis sativa (maconha), nos levou ao
desenvolvimento de uma metodologia pela qual o carboxi-THC glicuro conjugado, principal
metabolito eliminado pela urina dos usuários de maconha, sofre hidrólise alcalina, extração em
fase sólida e derivatização, seguida de analise por Cromatografia gasosa acoplada a
Espectrometria de Massa (GC/MS-EI), para detecção do derivado bi-pentafluorpropionilado do
Carboxi-THC, que é uma molécula de boa volatilidade e alta relação m/z (622 u.), ideal para este
tipo de analise.
Desta maneira, conseguimos confirmar com excelente confiabilidade o uso ou não de Cannabis,
por indivíduos suspeitos de utilização de drogas.

3. CAMPO DE APLICAÇÃO

Este documento é utilizado na Seção de Análise Instrumental, como protocolo para determinação
de maconha em urina de pacientes e cadáveres oriundos do I.M.L.

4. NORMAS A CONSULTAR

Manual de Operação do GC/MS Shimadzu (GC17A/QP-5000)

5. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA

- CLARKE’S. Isolation and identification of drugs, second edition
- PFLEGER, H. H. MAURER, A. WEBER. Mass Spectral and CG data of drugs, poisons,
pesticides, pollulants and their metabolites, second, revesed and enlarged edition.
- KARL BLAUN, GRAHAM S. KING. Handbook of derivatives for chromatograph
- SPINELLI, ELIANE. Identificação de usuários de Cannabis por cromatografia em
camada delgada de alta eficiência. (Tese de mestrado) USP

6. DEFINIÇÕES

GC/MS - cromatografia a gás/espectrometria de massa
IE - impacto de elétrons
P.A. - para análise
SPE - extração em fase sólida
THC - tetrahidrocanabinol
THC-COOH - carboxi tetrahidrocanabinol
THC-2PFP - carboxi-THC, bi-pentafluorpropionilado
PFP-OH - álcool pentafluorpropílico
PFPA - anidrido pentafluorpropiônico

Hexano:acetato de etila (80/20) v/v - solvente de canabinóides
m/z - relação massa carga

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7. DESENVOLVIMENTO

7.1. PRINCÍPIO BÁSICO E RESUMO DO PROCEDIMENTO
A amostra a ser analisada sofre hidrólise alcalina com solução metanólica de KOH 12 M
seguida de neutralização com ácido acético P.A. e extração em fase sólida (SPE), produzindo
um analito com matriz bastante limpa, ideal para que seja efetuada a derivatização com álcool
pentafluorpropílico e anidrido pentafluorpropiônico e análises por GC/MS, para identificação
do derivado bi-pentafluropropiônilado do Carboxi-THC.

7.2. APLICAÇÃO

Aplica-se a amostras de urina humana, com o objetivo de confirmar o uso de maconha, sendo
detectado o derivatizado do 11-nor-∆9-tetrahidrocanabinol-9-ácido carboxílico (THC-COOH),
que é o principal componente psicoativo eliminado por quem usa a referida droga.

7.3. RESPONSABILIDADE

O perito é responsável pela execução da análise, conferência, assinatura e emissão dos laudos.

7.4. MATERIAIS NECESSÁRIOS

7.4.1. Equipamentos e instrumentos

a) banho com controle de temperatura;
b) tubo de centrífuga cônico com tampa rosqueável;
c) cartucho de extração SPE Spe-ed THC da Applied Separation
d) sistema de eluição a vácuo (Vacuum Elution Speed-Mate 10);
e) agitador de tubos;
f) frasco de derivatização de 4mL com tampa rosqueável;
g) cromatógrafo a gás com detetor de massa Shimadzu GC17A/QP-5000;
h) coluna capilar em sílica fundida com 320 µm de diâmetro interno e 30m de comprimento SE-30
(com 1µm de espessura do filme)
i) micro seringa;
j) cilindro de Helio de alta pureza;
k) cilindro de nitrogênio comercial.

7.4.2. Reagentes

a) acetonitrila P.A.;
b) metanol P.A.;
c) hexano P.A.;
d) acetato de etila P.A.;
e) hidróxido de potássio P.A.;
f) álcool pentafluorpropílico;
g) anidrido pentafluorpropiônico;
h) ácido acético P.A. (99,5%);
i) ácido clorídrico P.A.;
j) solução de ácido clorídrico 0,1M;
• transferir 8,5mL para um balão volumétrico de 1000mL;
• completar o volume com água destilada.

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a) solução metanólica de hidróxido de potássio 12M
• dissolver 70,86g de KOH em 40 mL de água destilada;
• transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com metanol P.A.
b) água destilada;

7.5. ASPECTOS DE SEGURANÇA

Usar luvas cirúrgicas ao manusear as amostras, por se tratarem de potenciais fontes de
contaminação de doenças diversas. Observar, também, as recomendações de segurança
(uso de óculos e capela) relativas ao manuseio dos reagentes e soluções.

7.6. PROCEDIMENTOS

7.6.1 Preparação da amostra de urina (identificação)

a) transferir 10mL de urina para tubo de centrífuga (cônico) de 50mL com tampa;
b) adicionar 1mL de solução metanólica de KOH 12M (pH ≅14);
c) agitar em vortex;
d) deixar 4 minutos em temperatura ambiente;
e) adicionar 3 mL de ácido acético P.A. (pH ≅ 3,5).

7.6.2 Extração do THC-COOH (utilizando o cartucho especifico para o THC da Applied
Separation)

a) condicionar o cartucho adicionando 3mL de metanol seguido de 3mL de água e 1mL de HCl
0,1M

Nota: Não deixar o cartucho secar

b) adicionar a amostra, preparada conforme o item 7.6.1, ao cartucho e aspirá-la lentamente
utilizando manifolde para extração a vácuo;
c) lavar o cartucho adicionando 2mL de água, seguidos por 2mL de (acetonitrila : HCl) 40/60
e secar sob vácuo de 15in.Hg, por 5 minutos;
d) fazer a eluição do analito, em frasco de derivatização, adicionando 3mL de ( Hexano :
Acetato de Etila ) - 80/20;
o
e) evaporar o eluído em N2, até a secura, sob temperatura de aproximadamente 50 C.

7.6.3 Derivatização (Pentafluorpropionilação)

a) adicionar 50µL de solvente de canabinoide , 50µL de PFP-OH e 50µL de PFPA (agente
de derivatização) ao frasco contendo o material seco, obtido conforme o item 6.6.2, sub-
item “e”;
b) selar o frasco com N2, agitar em seguida, utilizando o agitador de tubos, e aquecer a 84oC,
durante 15 minutos;
c) esfriar e em seguida evaporar sob N2 o liquido remanescente;
d) adicionar 50µL de acetato de etila, e injetar 1µL no GC/MS QP-5000 no modo SCAN,
utilizando o método de nome THCURSCA.MET;
e) pesquisar no MIC (cromatograma de multi-íon) os fragmentos m/z 607, 474, 459, 445 e o
622 u.m.a. , que é o íon molecular do THC-2PFP;
f) imprimir o espectro e a pesquisa de similaridade resultante, que deverão ser anexados à
cópia do laudo a ser arquivada na seção.

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7.7 DIAGRAMA DE BLOCO

Extração de THC-COOH em urina

10mL de
urina
1,0mL de kOH 12,0 Molar
pH da amostra ≅ 14

Agitar em vortex

Deixar 4 min a
temp. ambiente
3,0mL ac. Acético Glacial
(pH ≅ 3,5)
Passar a amostra
no cartucho (SPE)

2,0mL de H2O 2,0mL de Acetonitrila : HCL
Eluir c/ 3mL de
solvente de (40 : 60)
canabinoides

Secar sob N2
50OC
50µL PFPA

100µL (Solvente de canabinoides)
50µL PFP-OL Selar c/ N2
80oC 15 minutos

Obs.
Solvente de Canabinóides Evaporar
Hexano : acetato de Etila sob N2
(80:20)
PFPA = Anidrido Pentaflúor Propiônico
PFP-OL= Álcool Pentaflúor Propílico
SPE = Extração em fase sólida (50µL acetato de etila)
GC/MS=(Cromatografia Gasosa acoplada
a espectrometria de massa)
Injetar 1 µL no
GC/MS modo SCAN Fragmentos típicos:
M/Z= 622,6 u.m.a.
M/Z= 607,6 u.m.a.

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8. LAUDO

No laudo de análise deve constar um resumo da metodologia utilizada e o resultado obtido (se
Positivo ou Negativo para maconha).

LAUDO DE EXAME PERICIAL 00000/98

AUTORIDADE REQUISITANTE

Dr. José Américo Seixas Silva, Perito Médico Legal do I.M.L. Nina Rodrigues/Ba, solicita perícia
através da Req. s/n de 29/03/98.

OBJETO DA PERÍCIA
Urina, segundo a Autoridade Requisitante, coletado da paciente ANTONIO DE TAL, Reg.
10000/98

EXPOSIÇÃO

Os peritos signatários, designados pelo Sr. Diretor deste Laboratório para a realização da perícia
acima mencionada, apresentam a seguir o resultado de seus trabalhos.

EXAME

Identificação de Carboxi-THC em urina.

MÉTODO UTILIZADO

Extração em fase sólida, seguida de cromatografia gasosa acoplada a detetor espectrométrico de
massa Shimadzu GC17A/QP5000, equipado com coluna capilar em sílica fundida com 320µm de
diâmetro interno, 1µm de espessura de filme, 30m de comprimento, fase estacionária SE-30 e fase
móvel Hélio com velocidade linear 45cm/seg.

RESULTADO

POSITIVO para Carboxi-THC, que é o principal metabólito eliminado pela urina dos usuários de
maconha.

Salvador, 06 de maio de 1998.

Perito Relator Perito Revisor

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9. Conclusão

Devido à proibição da compra de padrões dos derivados do THC, pelas autoridades
americanas, visto que a síntese e comercialização são feitas por empresas daquele
país, utilizamos urinas de usuários de Cannabis como referência. As urinas eram
submetidas a triagem por enzima-imunoensaio (E.L.I.S.A.) e cromatografia em
camada delgada de alta eficiência (C.C.D.A.E.). Os casos positivos sofreram
tratamento através da metodologia supracitada, seguida de análise por cromatografia
gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS-EI), modo full-scan, com
obtenção de espectro de massa característico e criação de biblioteca particular
contendo os dados do composto sintetizado (Carboxi-THC bipentafluorpropionilado),
considerando que as bibliotecas existentes (NIST-12, NIST-62 e PW-TOX), as quais
perfazem cerca de oitenta e cinco mil espectros de drogas e substâncias em geral,
não possuem o espectro de massa da droga em questão.
Desta maneira, após exaustivos ensaios analíticos, a metodologia proposta foi
validada e colocada em rotina de trabalho no Laboratório Central de Polícia Técnica
da Bahia, servindo como parâmetro de confirmação dos casos positivos, alcançando
índice de similaridade (S.I.) de até 95%.

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10. ANEXOS

Seção de Análise
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CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS - 1

Seção de Análise
Polícia Técnica 9

CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS - 2

Seção de Análise
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ESPECTRO DE MASSA

Seção de Análise

CROMATOGRAMA DE CASO POSITIVO

Seção de Análise

PESQUISA DE ÍNDICE DE SIMILARIDADE

Seção de Análise

Fórmula estrutural do 11- nor-9-carboxi- ∆9-THC-bipentafluorpionilado

Obs:
Reação de derivatização.

O álcool pentafluorpropílico reage com a (COOH) do Carboxi-THC, onde ocorre a
primeira pentafluorpropionilação (esterificação), em seguida após a liberação da
molécula de água pela reação anterior o anidrido pentafluorpropiônico se transforma
em ácido, que esterifica a hidroxila fenólica (OH) da mesma molécula, ocorrendo
assim a formação do Carboxi-THC bi-Pentafluorpropionilado.

Seção de Análise

Fragmentação do 11- nor-9-carboxi- ∆9-THC- bipentafluorpionilado

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