PATOLOGIA GÁSTRICA

                             METAPLASIA E CDX2




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Tipo difuso                         Tipo intestinal
      Aproximadamente 95% dos casos são
                esporádicos


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Cancro gástrico do tipo difuso –
tem tendência para se estender
      por outras regiões
Cancro gástrico do tipo intestinal
PORTUGAL

                                    80%

                                     Têm a bactéria

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H.pylori consegue desenvolver-se              A urease converte ureia em amoníaco e
         graças à enzima urease       ...
Aparecimento de células intestinais ao nível de
                tecido gástrico




Fase que antecede o cancro e resulta d...
Gene que normalmente se expressa
          apenas em células intestinais




          Factor de transcrição intestinal


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Estudo da expressão do CDX2 ao nível
           de mRNA e proteína em tecidos
          gástricos e em linhas celulares de...
Método Directo                                               Método Indirecto
                             Interacção anti...
•   Desparafinação e hidratação                                 •   Fixação

•   Recuperação antigénica

•   Bloqueio da p...
Antes de começar a técnica de RT-PCR o RNA tem que ser extraído.
As principais etapas são:
                               ...
Mostra alguma degradação
         do RNA


                           Bandas de RNA
O RT-PCR utiliza RNA que, com a ‘ajuda’ da enzima transcriptase reversa, vai originar uma
cadeia de DNA complementar, o cD...
O PCR é um método de amplificação do DNA obtido na técnica anterior, o RT-PCR.


                                         ...
Leva-se ao termociclador onde vai ser submetido a diversas temperaturas:

                                             95º...
Imunohistoquímica e Imunocitoquímica




      Imunofluorescência




         PCR




Extracção de RNA
Metaplasia Intestinal   Tecido intestinal
AGS           MKN45




      GP202           Controlo
                      Negativo
AGS




HeLa
GAPDH
CDX2

       Bandas inespecíficas
• O estudo da metaplasia é essencial para a compreensão do cancro gástrico.

• Não se pode ignorar o papel do gene CDX2 e ...
http://www.e-escola.pt/topico.asp?hid=339
http://pt.wikipedia.org
http://www.roche.pt/sites-tematicos/infocancro/index.cfm...
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Patologia GáStrica

  1. 1. PATOLOGIA GÁSTRICA METAPLASIA E CDX2 Ana Mariz 27 Julho – 7 Agosto 2009 Cláudia Correia
  2. 2. Tipo difuso Tipo intestinal Aproximadamente 95% dos casos são esporádicos «Já estávamos contentíssimos com a repercussão do trabalho e tivemos agora a cereja em cima do bolo.»
  3. 3. Cancro gástrico do tipo difuso – tem tendência para se estender por outras regiões
  4. 4. Cancro gástrico do tipo intestinal
  5. 5. PORTUGAL 80% Têm a bactéria 30% Robin Warren e Barry Marshall Apresenta metaplasia intestinal 7% Desenvolve cancro gástrico
  6. 6. H.pylori consegue desenvolver-se A urease converte ureia em amoníaco e graças à enzima urease dióxido de carbono Do amoníaco resulta um género de auréola que cria um micro ambiente favorável à bactéria http://www.sumanasinc.com/scienceinfocus/helicobacter/helicobacter_fla.html A bactéria desloca-se com a ajuda da sua “cauda” Liberta compostos que causam a Propulsiona-se através do muco que protege as célulasdeteorização das células epiteliais do estômago Agrega-se às células epiteliais e usa a urease para desacidificar o micro ambiente destas
  7. 7. Aparecimento de células intestinais ao nível de tecido gástrico Fase que antecede o cancro e resulta da inflamação das células devido à presença de H.pylori
  8. 8. Gene que normalmente se expressa apenas em células intestinais Factor de transcrição intestinal Expressão anormal no estômago - metaplasia intestinal
  9. 9. Estudo da expressão do CDX2 ao nível de mRNA e proteína em tecidos gástricos e em linhas celulares de carcinoma Técnicas utilizadas Imunohistoquímica RT-PCR Imunofluorescência
  10. 10. Método Directo Método Indirecto Interacção anticorpo antigénio Utilização de anticorpo Utilização de um só primário e anticorpo anticorpo secundário Permite determinar a presença de proteínas Maior Amplificação do sinal
  11. 11. • Desparafinação e hidratação • Fixação • Recuperação antigénica • Bloqueio da peroxidase endógena • Soro Normal • Anticorpo primário • Anticorpo secundário biotinilado • Anticorpo Secundário conjugado com FITC • Sistema de Amplificação ABC • Substracto cromogénico • Contraste nuclear • Desidratação • Montagem Vectashield • Montagem Entellan Resultados
  12. 12. Antes de começar a técnica de RT-PCR o RNA tem que ser extraído. As principais etapas são: Centrifugação • Provoca a lise Clorofórmio • Usado para celular e é inibidor precipitar o RNA de RNAses • Separa as 3 fases: aquosa – RNA; interfase – DNA; orgânica - proteínas TRI reagent Isopropanol Deixa-se secar para completa evaporação de resíduos indesejáveis e, após a resuspensão, congela-se para depois ser usado para a técnica de RT-PCR.
  13. 13. Mostra alguma degradação do RNA Bandas de RNA
  14. 14. O RT-PCR utiliza RNA que, com a ‘ajuda’ da enzima transcriptase reversa, vai originar uma cadeia de DNA complementar, o cDNA. Esta técnica baseia-se nos seguintes passos: 1. Num eppendorf junta-se: RNA RH Água RT Buffer – solução “tampão” RNAse out DTT 2. Vai para o termociclador onde a enzima vai originar cDNA a partir do RNA.
  15. 15. O PCR é um método de amplificação do DNA obtido na técnica anterior, o RT-PCR. Buffer “solução tampão” Cloreto de cDNA magnésio MgCl2 Eppendorf Enzima Taq dNTPs polimerase Primer Primer reverse forward
  16. 16. Leva-se ao termociclador onde vai ser submetido a diversas temperaturas: 95ºC Desnaturação e separação da molécula de DNA em duas cadeias simples 52ºC Cada primer liga-se a uma das cadeias, um no inicio (primer forward) e o outro no final (primer reverse) 72ºC Temperatura óptima para a enzima actuar e sintetizar as cadeias complementares das duas simples existentes Ao fim de 25/35 ciclos obteve-se uma replicação exponencial das cadeias de DNA. O produto foi visto após realizar a técnica de electroforese em gel de agarose.
  17. 17. Imunohistoquímica e Imunocitoquímica Imunofluorescência PCR Extracção de RNA
  18. 18. Metaplasia Intestinal Tecido intestinal
  19. 19. AGS MKN45 GP202 Controlo Negativo
  20. 20. AGS HeLa
  21. 21. GAPDH CDX2 Bandas inespecíficas
  22. 22. • O estudo da metaplasia é essencial para a compreensão do cancro gástrico. • Não se pode ignorar o papel do gene CDX2 e da sua proteína como localizadores de metaplasia. • Utilizando técnicas como a imunohistoquímica, a imunofluorescência e o RT-PCR/PCR é possível detectar a existência ou não de metaplasia num determinado tecido. Esta experiência foi bastante enriquecedora uma vez que contribuiu para a nossa cultura cientifica e fez-nos despertar para a importância da investigação.
  23. 23. http://www.e-escola.pt/topico.asp?hid=339 http://pt.wikipedia.org http://www.roche.pt/sites-tematicos/infocancro/index.cfm/tipos/cancro-do-estomago/ http://www.sumanasinc.com/scienceinfocus/helicobacter/helicobacter_fla.html http://www.gastroalgarve.com/doencasdotd/estomago/helicobacterpylori.htm

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