Este documento evalúa la capacidad de tres cepas de hongos ascomicetos (Scopulariopsis Sp, Coelomycetes y Ascomycetes 45ch) para degradar la lignina del bagazo de caña de azúcar. Ascomycetes 45ch mostró la mayor actividad de la enzima lacasa, alcanzando 2800 unidades enzimáticas por litro a los 37 días utilizando un 1,5% de concentración de sustrato. Esta cepa también logró la mayor tasa de degradación de lignina en las fibras de bagazo,

1. DEGRADACIÓN DE LIGNINA DEL BAGAZO DE CAÑA (Saccharum
officinarum) UTILIZANDO HONGOS ASCOMICETOS.
LIGNIN DEGRADATION OF THE CANE BAGASSE (Saccharum
officinarum) USING ASCOMICETES FUNGI.
Jácome, E.A. Asanza, H.F. * Carrión, F.H
Centro de Biología Celular y Molecular. Universidad Técnica Particular de Loja. Loja –
Ecuador. 11-01-608. fhcarrion@utpl.edu.ec
Se evaluó la actividad enzimática para establecer el potencial de degradación de
lignina del bagazo de caña de varias cepas de hongos colectados en el Parque Nacional
Podocarpus, en la Provincia de Loja al Sur del Ecuador. De un total de 100 cultivos
disponibles en el cepario micológico del Centro de Biología Celular y Molecular
(CBCM), a los cuales se los sometió a un ensayo preliminar para determinar la
capacidad cualitativa de degradación enzimática, se tomó las tres cepas que
presentaban mejor actividad (Scopulariopsis Sp., A. coelomycetes y Ascomycetes 45ch.).
Para determinar la actividad ligninolítica cualitativa de las especies en estudio se
empleó ABTS como revelador a una concentración de 10 mM. Las cepas que mostraron
actividad positiva fueron sometidas a fermentación sumergida en medios de cultivo
alimentados con bagazo de caña de azúcar como sustrato. Los productos obtenidos se
sometieron a pruebas espectrofotométricas para medir la actividad cuantitativa de la
Lignina peroxidasa y Lacasa. La mayor actividad Lacasa fue de 2800 unidades
enzimáticas por litro (U/L), producida por Ascomycetes 45ch a los 37 días de cultivo, a
una concentración de sustrato del 1,5%. La tasa máxima de degradación de lignina en
las fibras de bagazo alcanzada por la misma cepa, después de la etapa de fermentación,
fue del 44% respecto a su contenido inicial. En ninguno de los casos se detectó
actividad Lignina peroxidasa.
Palabras Clave: Scopulariopsis, Coelomycetes, Ascomycetes, lignina peroxidasa, lacasa.
Keywords: Scopulariopsis, Coelomycetes, Ascomycetes, lignin peroxidase, laccase.
1. Introducción encadenan las moléculas de celulosa
(Rowell, R. 1991).
Las fibras naturales contienen El impacto ambiental que causa el
elevadas cantidades de celulosa la tratamiento de las fibras en las etapas
misma que es un compuesto de especial de pulpaje y blanqueo es muy severo.
interés en la industria para la El pulpaje Kraft es el proceso más
producción de pulpa y papel, pero para empleado en el mundo, su objetivo es
llegar a este valioso recurso se debe remover la lignina para liberar la fibra
penetrar una gran barrera formada por de celulosa pero la utilización de
hemicelulosa y lignina, que son diversos químicos genera la emisión de
polímeros muy complejos que gases sulfurados denominados TRS ó
azufre total reducido (Fuentes, J. 1991).

2. Por otra parte en el blanqueo se Varias especies de Ascomicetos y hongos
emplean productos clorados que imperfectos causantes de la pudrición
permiten la eliminación de la lignina suave de la madera están involucrados
residual pero son productores directos en la degradación de lignina, lo que
de diotoxinas (Fuentes, J. 1991), por tal hace que estos microorganismos
motivo la aplicación de sistemas jueguen un papel importante en
biológicos para la remoción de lignina diversos sistemas biológicos.
es una alternativa a este problema.
Se considera que la mayoría de los 2. Materiales y Métodos
hongos del suelo únicamente
descomponen la celulosa; sin embargo Microorganismos. Sé utilizó tres
los hongos que descomponen la especies de Ascomicetos (Scopulariopsis
madera, tales como los hongos de Sp, Coelomycetes y Ascomycetes 45ch),
pudrición blanca Basidiomicetos y pertenecientes al cepario micológico del
Ascomicetos, han sido reconocidos CBCM. Estos fueron mantenidos en
como los más eficientes degradadores medio MYP a temperatura ambiente.
de lignina. (Martin, J. P., and Haider, K. Ensayo cualitativo. En cajas petri se
1971). colocó 10 ml de medio MYP, medio
Algunas de las cepas estudiadas, bajo basal (MgSO4. 7H2O, 0.5 g; HK2PO4, 0.6
las condiciones adecuadas, podrían ser g; H2KPO4, 0.5 g; CuSO4.5H2O, 0.4 mg;
herramientas potenciales para la MnCl2.H2O, 0.09 mg; H3BO3, 0.07 mg;
deslignificación de las fibras naturales, NaMoO4.2H2O, 0.02 mg; FeCl3, 1 mg;
aunque aún no se conoce a ZnCl2, 2.5 mg.) y ABTS (2,2’ - azinobis
profundidad cual es el conjunto de (3-etilbenzotiazoline-6-sulfonato)
enzimas involucradas en la (SIGMA) como inductor y revelador a
deslignificación por hongos (Broda, P. una concentración de 10mM. Se coloca
et al. 1996). un disco (ø 5 mm) con cultivo crecido,
Las enzimas ligninolíticas que son en el centro de la placa y se incuba a
responsables de la degradación de la temperatura ambiente.
lignina de los materiales Fermentación. En matraces de
lignocelulósicos son fundamentalmente 125 ml, se colocó 30ml de medio GA
Lignina peroxidasa (Lip), Lacasa (Lac) (GA. Glucosa, 1%; Asparagina, 0,4%;
y Manganeso peroxidasa (MnP), la SIGMA) suplementado con bagazo de
mismas que actúan liberando caña (fibras de ø 1mm) en
moléculas de celulosa, a partir de las concentraciones de 0.5%; 1.0% y 1.5%.
cuales se pueden obtener unidades de Se reguló el pH a 5,5 con HCl 0,1 N y se
glucosa que son de gran interés en la esterilizó a 121 oC por 20 minutos.
industria alimentaria para la En los medios estériles se inoculó un
elaboración de jarabes y etanol disco de agar con micelio fúngico (ø 1
(Forchiassin et al, 1999). Así mismo el cm), se incubó a temperatura ambiente
sistema ligninolítico tiene aplicaciones con agitación constante de 120 rpm.
biotecnológicas muy prometedoras, Actividad enzimática. Se tomaron
tanto en el desarrollo de métodos periódicamente, tres muestras
alternativos de deslignificación de la semanales, de los sobrenadantes para la
madera, pulpeo o blanqueo, como para cuantificación enzimática.
el tratamiento de efluentes o la Lacasa: Se usó como sustrato
biorrecuperación de suelos y aguas ABTS 0.5 mM en buffer acetato de
subterráneas contaminadas. (Gonzales sodio 0.1 M, pH 5, a 30 ˚C. (“420 36000
et al. 2002). M-1cm-1).
ii

3. Lignina Peroxidasa. Se utilizó
como sustrato alcohol veratrílico 2 mM, Enzimas Ligninolíticas
H2O2 0.4 mM, buffer tartrato 50 mM y 3000
la muestra de la enzima. El H2O2 inicia 2500
la reacción (“310 9333 M-1cm-1).
Actividad Enzimática, U/ml
2000
Determinación de glucosa. Se 0,5%
realizó con el método enzimático 1500 1%
1,5%
(Randox) a 505 nm. Solución estándar: 1000
glucosa, 1 g/L; Reactivo de trabajo: 500
glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa 0
(POD), 4-aminofenazona (4- AF) y 2 5 7 9 12 14 16 19 21 23
T, días
26 28 30 33 35 37 40 42 44
ácido salicílico pH: 7,4. Gráfico 2. Producción de Lacasa por Ascomycetes
Cuantificación de lignina. Las 45ch a diferentes concentraciones
fibras sometidas a la fermentación se
separaron mediante filtración se Ascomycetes 45ch presentó una elevada
lavaron con agua destilada a 90ºC, actividad Lac, alcanzando valores
luego se solubilizó la celulosa y superiores a 2800 U/L, a una
hemicelulosa por medio de una concentración de 1,5% de sustrato en
hidrólisis con ácido sulfúrico al 72%, un periodo de 37 días (Gráfico 2).
permaneciendo la lignina como resto
insoluble (Papinuttti et al, 2003). El Enzimas Ligninolíticas
peso de la fracción insoluble
250,00
corresponde a la lignina. 200,00
Actividad Enzimática, U/ml
3. Resultados y discusión. 150,00
0,5%
1%
1,5%
Actividad Enzimática
100,00
50,00
Enzimas Ligninolíticas
25 0,00
2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 26 28 30 33 35 37 40 42 44
T, días
Gráfico 3. Producción de Lacasa por Scopulariopsis
20
Sp. a diferentes concentraciones
Actividad Enzimática, U/ml
15
0,5%
1%
10
1,5% Con Scapulariopsis Sp. a una
concentración de 0,5% de sustrato se
5
llegó a obtener valores máximos de 213
U/L de actividad Lac en el día 37 de
fermentación (Gráfico 3).
0
2 5 7 9 12 14 16 19 21 23
T, días
El ensayo cuantitativo detectó
Gráfico 1. Producción de Lacasa por Coelomycetes
(Ascomycetes) a diferentes concentraciones únicamente actividad Lac. Ninguna de
las tres especies involucradas en esta
Coelomycetes (Ascomycetes) presentó su investigación presentó actividad Lip,
mayor expresión enzimática en el aunque cabe destacar que esta enzima
quinto día de cultivo, alcanzando una no se ha encontrado en la mayoría de
producción de actividad Lac de 17,5 y los hongos de pudrición blanca
20 Unidades/Litro (U/L) para las estudiados (Pelaez, F., et al. 1995).
concentraciones de sustrato de 1% y El patrón de expresión de las
0,5% respectivamente (Gráfico 1). actividades enzimáticas depende de los
iii

4. diferentes organismos, es decir, productos de degradación a los ciclos
mientras unos secretan Lip y MnP (no metabólicos del organismo que como
producen Lac), otros secretan MnP y producto final dan CO2 (Kirk, T. Farell,
Lac (no producen Lip) (Martín, C., et al. R. 1987).
2004). Es interesante conocer esto
debido a que en esta investigación solo 4. Conclusiones.
se consideró el estudio de las enzimas
Lip y Lac, pero al tener los organismos Las tres especies fúngicas
este patrón de comportamiento es muy mostraron únicamente actividad
probable que alguna de las tres especies Lacasa. La actividad Lignina
investigadas haya producido peroxidasa fue nula.
conjuntamente Lac y MnP. Se determinó que Ascomycetes
La concentración del sustrato 45ch es la cepa más productiva,
tiene una relación directamente reportando una importante actividad
proporcional con la producción Lacasa (2800 U/L) a los 37 días de la
enzimática del género Ascomycetes 45ch, etapa fermentativa.
es decir, a mayor concentración de fibra El bagazo de caña de azúcar
(1,5%), mayor actividad enzimática demostró ser un excelente sustrato para
2800 U/L, que se logró usando la producción de enzimas
únicamente bagazo de caña como extracelulares.
sustrato; esto contrasta con otros La tasa máxima de degradación
reportes en los que se usa cofactores de lignina fue del 44% alcanzada con
(Fenol 10 mg/L)y se obtiene menores Ascomycetes 45ch a una concentración
cantidades enzimáticas (Lac 2575 U/L) de 1,5% de sustrato.
(Nurdan Kasıkara. 2004), esto sugiere La producción enzimática
que posiblemente esta cepa posea una comienza cuando la concentración de
capacidad mayor de producir glucosa en el medio de cultivo empieza
biocatalizadores. a disminuir.
Consumo de glucosa. El género
Ascomycetes 45ch, mostró un acelerado Referencias
consumo de glucosa, agotando
completamente este monosacárido en el ALEXOPOULOS, C., MIMS, C
día 7 de cultivo, lo que implicaría una and BLACKWELL, M. (1996).
activación de su metabolismo Introductory Mycology. Fourth Edition.
secundario para producir enzimas John Wiley & Sons, Inc. United States of
extracelulares (Lac), las cuales son America.
oxidasas que en determinadas CURTIS, Helena y BARNES,
condiciones contribuyen a Sue. (1993). Biología. Quinta Edición.
despolimerizar la compleja estructura Editorial Médica Panamericana S. A.
de lignina (Cullen, D. 1997). Buenos Aires. Argentina.1999 pág.
Degradación de lignina. FORCHIASSIN, Flavia.
Ascomycetes 45ch mostró la tasa máxima MAGNELLI, Paula. DIORIO, Luis
de degradación de lignina (44% Alberto y MERCURI, Oscar Alberto
respecto al contenido inicial), (1999). Manual de Procedimientos.
ratificando la eficiente acción de la Lac, Segunda Edición. Laboratorio de
que al catalizar las primeras reacciones Micología Experimental. Universidad
rompen uniones dentro de la molécula de Buenos Aires. Argentina.
de lignina, generando moléculas más MENDOZA, Laura.
pequeñas e incorporando estos (2004).Producción de enzimas de
iv

5. interés para biotecnología por hongos
del cepario del instituto de
investigación fármaco BIOQUÍMICA
(IIFB).
PAPINUTTI, V., et al. (2003).
Degradación de madera de álamo por
Fomes sclerodermeus: producción de
enzimas ligninolíticas en aserrín de
álamo y cedro. Laboratorio de
Micología Experimental. Departamento
de Biodiversidad y Biología
Experimental. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. Universidad de
Buenos Aires. Argentina.
UHLIG, Helmut. (1998),
Industrial Enzymes and their
Applications. New York, USA.
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