Biologia molecular

1. Cultivos celulares

2. Índice
1. Introducción.
1.1. Definición.
1.2. Historia.
2. Tipos de cultivos celulares.
3. Medios de cultivo.
4. Dificultades de la implantación de cultivos en un organismo vivo
5. Rutinas en el trabajo con cultivos celulares.
6. Técnicas.
7. Equipos.
8. Aplicaciones.
9. Ventajas y desventajas.

3. 1. Introducción

4. Definición
Es un modelo de estudio in vitro realizado con unas técnicas
que permiten mantener al máximo las propiedades
fisiológicas bioquímicas genéticas

5. Historia
El primer investigador fue Wilhelm Roux que cultivó células de
embrión de pollo en solución salina durante días.
Demostrando que las células embrionarias podían sobrevivir sin
requerir la presencia de un organismo.
Tenían una limitación inicial: Los cultivos no tenían medios nutritivos
adecuados para la propagación celular.
M. Burrows descubrió que el plasma era un nutriente esencial en los
medios de cultivo, óptimos para la propagación de células.

6. Historia
Originario del siglo XIX: Para el estudio de las
variaciones/comportamiento de las células animales libres
ocurridas dentro del organismo y bajo el estrés de un experimento.
En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio, una
amplia gama de células procedentes de diferentes
tejidos organismos

7. 2. Tipos de
cultivos
celulares

8. Tipos
-Cultivo de órganos
-Explantes primarios
-Cultivo celular primario
-Cultivos histotípicos y organotípicos

9. Cultivo de órganos
Colocamos el órgano rejilla en interfase líquido-gaseoso que
permite obtener nutrientes y liberar desechos.
Mantener la estructura característica del tejido in vivo
Diferenciación de tipos celulares
Inconveniente: Proliferación celular limitada
Se necesita nuevo explante para cada experimento
Difícil cuantificación y la cantidad de material que se puede
cultivar es reducida

11. Explantes primarios
Colocamos un fragmento de tejido/órgano interfase sólido-líquido
en soporte de vidrio/plástico.
Se adhieren a la superficie
En la periferia pueden migrar y proliferar
Útil en pequeñas cantidades de tejido. Ej.- biopsias de piel

12. Cultivo celular primario
Es el más utilizado Explantes primarios
Se obtiene a partir de Suspensiones de células disgregadas
Se pierden las uniones celulares
Las células son capaces de proliferar notablemente
Cuando ocupan toda la superficie, se inhibe la proliferación
Cultivos en suspensión
Hay dos tipos de cultivo celular primario
Cultivos en monocapa

13. Cultivo celular primario: CULTIVOS EN SUSPENSIÓN
Las células crecen en suspensión en el medio de cultivo
1. Recolectar en un tubo
2. Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación
3. Lavar con suero fisiológico antes de la extracción y
purificación

14. Cultivo celular primario: CULTIVOS EN MONOCAPA
Las células crecen en monocapa adherida a la pared del frasco de
cultivo.
Podemos utilizar el propio frasco para continuar el proceso de
extracción.
Podemos pasar la monocapa a un tubo.

15. Cultivos histotípicos y organotípicos
Cultivos histotípicos
Único tipo celular elevada densidad celular
Crean una estructura tridimensional parecida al tejido original
Cultivos organotípicos
Varios tipos celulares muy parecidos a los original
Base de la ingeniería de tejidos
Objetivo final: Crear tejidos “in vitro” completamente funcionales que
pueden utilizarse en injertos o trasplantes.

16. 3. Medios de
cultivo

17. Medios de cultivo
Medios de cultivo Condiciones necesarias para el
desarrollo de organismos
Demostrar ciertas características bioquímicas de los microorganismos
Nutrientes
Factores de crecimiento
Otros componentes

18. Composición de los medios de cultivo
● Peptonas
○ Se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales.
○ Ricas en péptidos y aa.
● Extractos, los más habituales son:
○ Extracto de carne.
○ Extracto de levadura.
● Fluidos corporales
○ Los más utilizados son la sangre y el plasma.
○ Contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos
microorganismos.
● Los Sistemas Amortiguadores se utilizan para mantener el pH del medio. Se usan sobre
todo fosfatos disódicos y dipotásicos.

19. Composición de los medios de cultivo II
● Indicadores de pH: se añaden con frecuencia a los medios de cultivo para:
○ Poner de manifiesto ciertas propiedades bioquímicas.
○ Comprobar si el microorganismos es capaz de utilizar ciertas sustancias.
● Agentes reductores (cisteína, tioglicolato y otros): Se añaden a los medios de cultivo
para crear condiciones que permitan el desarrollo de microorganismos anaerobios.
● Agentes selectivos (cristal violeta, sales biliares, determinados antibióticos…): se
usan para convertir al medio selectivo a determinados microorganismos.
● Si el medio es sólido, ágar: agente gelificante, polisacárido que se obtiene de las algas
marinas.

20. 4. Dificultades en la
implantación de cultivos
en un organismo vivo

21. ● Proliferación
● Diferenciarse en los tipos celulares deseados
● Sobrevivir en el receptor tras el implante
● Integrarse en el tejido circundante
● Funcionar apropiadamente durante toda la
vida del receptor
● No producir daño al receptor
Dificultades en la implantación de cultivos en un organismo vivo

22. 5. Rutinas en el trabajo con
cultivos celulares

23. Puntos a tener en cuenta en cultivos celulares
● No mezclar nunca dos cultivos diferentes.
● No tener mucho tiempo fuera de estufa los cultivos.
● No invadir campos.
● Tapar rápidamente los frascos.
● Agitación del cultivo sembrado de dcha/izq y de arriba/abajo. Nunca agitar en
círculo.
● Para transferir las células un pequeño número de estas a un nuevo
recipiente
Cultivarse más tiempo Si se transfiere habitualmente se evita que
envejezcan (situaciones prolongadas de alta densidad celular)
○ Cultivos adherentes (despegar y pasar)
○ Cultivos en suspensión (tomar unas pocas y resuspender en medio fresco)

24. Puntos a tener en cuenta en cultivos celulares II
● Las células están en continua división durante el
cultivo, crecen hasta ocupar todo el área
disponible. Esto puede generar varios problemas:
○ Agotamiento de los nutrientes del medio
○ Acumulación de células apoptóticas y/o
necróticas
○ Inhibición de la división celular por contacto
Evitarlo cambiar este
medio:
● Cultivos en
suspensión
(centrifugación)
● Cultivos adherentes
(aspiración)

25. 6. Técnicas

26. Técnicas
Los cultivos animales tienen aplicación en muchas
investigaciones, hasta tal punto que han sido fundamentales
para numerosos avances científicos alcanzados en distintas
ramas biomédicas.
Las técnicas de cultivo celular permiten el estudio de:
● Metabolismo celular.
● El control del ciclo celular.
● El cultivo de virus.
● La clonación.

27. Hay investigaciones, como el trabajo con animales
transgénicos, que no pueden realizarse sin el cultivo de células.
Asimismo se han desarrollado numerosas aplicaciones para
investigación en biología celular y bioquímica, en farmacología
y toxicología, en procesos industriales para la obtención de
anticuerpos u hormonas y técnicas diagnósticas para el
diagnóstico prenatal de enfermedades y para el cáncer...

28. 7. Equipos

29. Equipos
● Realización del cultivo
○ Autoclave
○ Baño termostático
○ Incubador con CO2
○ Campana de flujo laminar
● Visualización y verificación del cultivo
○ Microscopio invertido
● Mantenimiento del cultivo en un breve período
de tiempo
○ Nevera
○ Depósito de CO2
● Mantenimiento del cultivo en un período
prolongado
○ Congelador
○ Depósito de CO2

30. Autoclave
Sirve para esterilizar todo el material que
vamos a utilizar.
Es de metal y debe aguantar las elevadas
temperaturas y presiones.
Realización del cultivo celular

31. Campana de flujo laminar
Permiten obtener una zona estéril y
segura en la que trabajar.
Realización del cultivo celular

32. Baño termostático
Son recipientes que contienen agua y un
sistema de regulación de la temperatura.
Se utilizan para atemperar medios de
cultivo o incluso para incubar cultivos de
microorganismos.
Realización del cultivo celular

33. Incubador con CO2
Es un dispositivo que sirve para
mantener y hacer crecer cultivos
microbiológicos o cultivos celulares.
Mantiene la temperatura, la humedad
y otras condiciones en grado óptimo,
tales como el contenido de dióxido de
carbono (CO2
) y de oxígeno en su
atmósfera interior.
Realización del cultivo celular

34. Microscopio invertido
En este microscopio, los cultivos o muestras se
pueden colocar en diferentes recipientes con
espesores y características ópticas variables, lo
cual permite observar organismos o tejidos en
cultivo sin una preparación previa.
Además, se pueden observar grandes cultivos o
muestras bajo estados muy naturales, lo cual
permite disminuir las condiciones de estrés
Visualización y verificación del cultivo

35. Nevera y sistema de CO2
La nevera sirve para mantener los cultivos
entre 2-4 ºC.
El sistema de CO2
sirve para mantener las
condiciones adecuadas.
Mantenimiento del cultivo celular (breve período de tiempo)

36. Congelador y CO2
Mantienen los cultivos celulares a
temperaturas inferiores a -20ºC
Nos permiten conservar los cultivos
durante mucho más tiempo,
comparándolo con la conservación en
nevera.
Mantenimiento del cultivo celular (período de tiempo prolongado)

37. 8. Aplicaciones

38. Con los cultivos celulares podemos estudiar distintas
actividades de las células, como por ejemplo:
● Actividad intracelular.
● Movimiento intracelular de moléculas.
● Interacción célula-célula.
● Interacción con el medio extracelular.
● Genética.
● Productos celulares y tisulares.
Aplicaciones

39. Cultivo celular de las células “in vitro”.
Sirve para trabajar:
● En estudios contra el cáncer
Reproducción asistida
● En reproducción y diferenciación celular
Clonación
● Medicina regenerativa de tejidos (total o parcial)
Principales usos

40. Ramas en las que se utilizan los cultivos
Algunas de las áreas que más trabajan con
cultivos son:
● Oncología
● Virología
● Inmunología
● Odontología
● Otras ramas: transplantes, reproducción
asistida...

41. 9. Ventajas y desventajas

42. ● Control fino y preciso del medio. Se pueden controlar
factores:
○ Físico-químicos: pH, Ta
, presión osmótica, niveles de O2
/CO2
…
○ Fisiológicos: Hormonas, nutrientes, factores de crecimiento
Ventajas

43. ● Caracterización y homogeneidad de la muestra. Todas
las células son homogéneas, lo que supera el problema de
la heterogeneidad.

44. ● Economía. Al realizarse en volúmenes reducidos, se
requieren menos cantidad de reactivos o drogas.

45. ● Técnica sensible. El crecimiento celular es muy lento y se
necesita un medio muy complejo similar al plasma o líquido
intersticial. Por ello se necesitan unas continuas condiciones
de asepsia.
Desventajas

46. ● Cantidad y coste. Producir 1g de tejido en cultivo cuesta 10
veces más que obtener tejido animal. Además, se obtienen
cantidades muy pequeñas (para tener 100g requerimos
instalaciones industriales).

47. ● Inestabilidad. Muchas líneas celulares son inestables
debido a aneuploidías. Para evitarlo, se resiembra cada
cierto tiempo con líneas estables a partir de un stock.

48. ● Difícil relación células cultivadas-células derivadas del
tejido, debido a sus diferentes propiedades.
● Problemas de inestabilidad genética al realizar varios
pases de cultivos de células no transformadas.

49. ● Sacrificio de miles de animales de experimentación.

50. Alicia Costa Carrera
Claudia Lamela Oujo
Carolina Pérez Barreiro
Aarón Vicente Pintos
1º de Anatomía Patológica y
Citodiagnóstico
2015/16