Criação da base de dados OralM associada a base OralOme
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A dissertação descreve a criação da base de dados OralM sobre o microbioma oral, associada à base de dados OralOme sobre o proteoma oral. A OralM compila dados de identificação de microrganismos a partir de 111 estudos que utilizaram sequenciamento do gene 16S rRNA. Isto permitiu adicionar evidência do microbioma à ferramenta bioinformática OralCard, integrando agora informação molecular total da cavidade oral.
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- 1. CRIAÇÃO DA BASE DE DADOS ORALM ASSOCIADA À BASE ORALOME Dissertação apresentada à Universidade Católica Portuguesa para obtenção do grau de Mestre em Medicina Dentária Orientador: Professora Doutora Maria José Correia Co-orientador: Professor Doutor Joel Arrais Carlos Eduardo Nogueira de Sá Viseu, 2014
- 2. http://www.scientificamerican.com/article/microbiome-graphic-explore-human-microbiome/ Illustration by Bryan Christie 2
- 3. O gene 16S rRNA como molécula identificadora Gene ubíquo a todos os procariotas Taxa de mutação baixa Regiões conservadas 9 regiões hipervariáveis Tamanho suficiente para fins informáticos (1500pb) Estrutura secundária gene 16S rRNA By Applied Biosiystems, Forest City, CA Nº espécies identificadas Mizrahi-Man O, Davenport ER, Gilad Y. Taxonomic Classification of Bacterial 16S rRNA Genes Using Short Sequencing Reads: Evaluation of Effective Study Designs. PLoS ONE. 2013 Jan 7;8(1):e53608. Janda JM, Abbott SL. 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Identification in the Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls. J Clin Microbiol. 2007 Sep 1;45(9):2761–4. 3
- 4. Ciências ómicas / Bioinformática 4
- 5. OralOme/OralCard Rosa N, Correia MJ, Arrais JP, Lopes P,Melo J, Oliveira JL, et al. From the salivary proteome to the OralOme: comprehensive molecular oral biology. Arch Oral Biol. 2012 Jul;57(7):853–64. 5 O OralOme é uma base de dados onde estão compilados todos os estudos de proteómica para identificação de proteínas orais.
- 6. O OralCard é uma ferramenta bioinformática dedicada à investigação científica em Saúde Oral que permite analisar e integrar os dados do OralOme. Arrais JP, Rosa N,Melo J, Coelho ED, Amaral D, Correia MJ, et al. OralCard: A bioinformatic tool for the study of oral proteome. Archives of Oral Biology. 2013 Jul;58(7):762–72. http://bioinformatics.ua.pt/OralCard/ 6
- 7. Resultados da pesquisa Arrais JP, Rosa N,Melo J, Coelho ED, Amaral D, Correia MJ, et al. OralCard: A bioinformatic tool for the study of oral proteome. Archives of Oral Biology. 2013 Jul;58(7):762–72. http://bioinformatics.ua.pt/OralCard/ 7
- 8. Proteínas já identificadas Arrais JP, Rosa N,Melo J, Coelho ED, Amaral D, Correia MJ, et al. OralCard: A bioinformatic tool for the study of oral proteome. Archives of Oral Biology. 2013 Jul;58(7):762–72. http://bioinformatics.ua.pt/OralCard/ 8
- 9. Rede de interatómica Arrais JP, Rosa N,Melo J, Coelho ED, Amaral D, Correia MJ, et al. OralCard: A bioinformatic tool for the study of oral proteome. Archives of Oral Biology. 2013 Jul;58(7):762–72. http://bioinformatics.ua.pt/OralCard/ 9
- 10. Informação individualizada de cada proteína Arrais JP, Rosa N,Melo J, Coelho ED, Amaral D, Correia MJ, et al. OralCard: A bioinformatic tool for the study of oral proteome. Archives of Oral Biology. 2013 Jul;58(7):762–72. http://bioinformatics.ua.pt/OralCard/ 10
- 11. Objetivos Estudos Microbioma Oral Compilação OralM + OralOme Associação OralCard Acessibilidade 11
- 12. Métodos Pesquisa bibliográfica • (Bacteri*) and (16S) and (oral) • (Microb*) and (16S) and (oral) • (Archaea) and (16S) and (oral) Triagem dos artigos • Pré-seleção de artigos • Análise dos artigos selecionados Construção da base de dados OralM 12
- 13. Métodos – Triagem dos artigos Critérios de Inclusão Estudos in vivo Estudos na espécie humana Estudos de identificação genómica por sequenciação do gene 16S rRNA Amostras da cavidade oral Critérios de Exclusão Estudos in vitro Estudos de culturas bacterianas Estudos realizados em outras espécies Estudos realizados noutro local do corpo Obrigatoriedade de cumprir os 4 critérios de inclusão e nenhum de exclusão 13
- 14. Métodos – Triagem dos artigos Resultados das pesquisas Bacteri* and 16S and oral • 308 artigos Microb* and 16S and oral • 189 artigos Archaea and 16S and oral • 4 artigos Pré-seleção de artigos Bacteri* and 16S and oral • 202 artigos Microb* and 16S and oral • 141 artigos Archaea and 16S and oral • 4 artigos Total de artigos da pré-seleção 347 artigos Após remoção de duplicados 243 artigos Após análise do abstract 111 incluídos 132 excluídos 14
- 15. Métodos – Construção da base de dados OralM Microrganismos identificados TaxID NCBI Organismo Método de análise Local da amostra Método de amostragem Tipo de estudo Método de análise Dados da população Idade Género Hábitos sociais Saúde Doença (Mesh ID) Antibioterapia Campos adicionais Código PMID Observações 15
- 16. Resultados e Discussão – Base de dados OralM Microbioma oral 16
- 17. Resultados e Discussão Número de estudos de identificação de microrganismos realizados para cada localização 17 29 46 13 16 18 20 6 4 12 3 4 2 2 1 1 1 2 1 1 1 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 77 0 0 0 0 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Whole Saliva Subgengival plaque Tongue Buccal Mucosa Supragengival plaque Root canal Palatine Tonsils Hard palate Periradicular abscesses Tongue Dorsum Oral Cavity (Non … Crevicular Fluid floor of the mouth Soft palate Jaw Lateral tongue surface Keratinized gingiva Biofilm Maxillary anterior … Dentine In Vitro Parotid Parotid Exosome SM/SL Minor OralM OralOme
- 18. Resultados e Discussão Distribuição dos microrganismos encontrados por localização In Vitro 87,77% Whole Saliva 10,53% Crevicular Fluid 1,70% Tongue 0% Mucosa 0% Minor 0% SM/SL 0% Parotid Exosome 0% Whole Saliva 19,52% Subgengival plaque 17,28 % Tongue 14,02% Buccal Mucosa 10,72% Supragengival plaque 9,62% Root canal 9,03% Palatine Tonsils 6,67% Hard palate 5,94% Periradicular abscesses 2,48% Tongue Dorsum 1,34% Oral Cavity (Non specific) 0,97% Crevicular Fluid 0,63% Floor of the mouth 0,54% Soft palate 0,28% Jaw 0,27% Lateral tongue surface 0,25% Keratinized gingiva 0,19% Biofilm 0,16% Maxillary anterior vestibule 0,12% Dentine 0,07% 18
- 19. Resultados e Discussão OralM • 1399 OralOme • 262 OralM • 181 OralOme 1232 167 95 148 33 • 113063 19
- 20. Resultados e Discussão OralM • 26 OralOme 20 6 • 2216 Cárie Dentária Gengivite Periodontite Agressiva Periodontite Crónica Cancro Oral Cancro da Mama 20
- 21. Resultados e Discussão A base de dados OralM transporta a informação do microbioma da cavidade oral para a ferramenta bioinformática OralCard OralCard torna-se agora mais abrangente Microbioma OralM Proteoma OralOme Evidência molecular total 21
- 22. Potenciais aplicações 22 http://www.oraldna.com/
- 23. Conclusões Base de dados OralM - Microbioma - 16S rRNA Maioria dos estudos - Biofilme subgengival - Doença periodontal OralOme ↔ OralM - Evidência molecular total - OralCard OralCard - 1494 espécies - 284 géneros - 42 patologias 23
- 24. CRIAÇÃO DA BASE DE DADOS ORALM ASSOCIADA À BASE ORALOME Dissertação apresentada à Universidade Católica Portuguesa para obtenção do grau de Mestre em Medicina Dentária Orientador: Professora Doutora Maria José Correia Co-orientador: Professor Doutor Joel Arrais Carlos Eduardo Nogueira de Sá Viseu, 2014
Notas do Editor
- Bom dia, desde ja agradeço aos elementos do ilustre juri, à president Prof. Doutora Marlene Barros, ao arguente Prof. Doutor Ricardo Correia e à orientadora Prof. Doutora Maria José Correia. Estendo tambem os meus cumprimentos à assistência aqui presente… Vou entao iniciar a minha apresentação cujo título é… “Criação da base de dados OralM associada à base OralOme” em como o próprio nome diz, que o trabalho realizado foi a criação de uma base de dados ( o OralM) com o microbioma da cavidade oral e a sua associação à base OralOme já existente com o proteoma da cavidade oral
- O corpo humano contem 10x mais bactérias, fungos e outros microrganismos do que células humanas. A cavidade oral é a maior porta de entrada dos microrganismos do corpo humano. Anatomicamente é constituída por estruturas dinâmicas que lhe conferem propriedades distintas de outras estruturas do corpo, existindo assim uma variedade de micro-habitats com características próprias ( diferentes) , que abrigam um dos microbiomas mais complexos do corpo humano. A maioria das espécies do ecossistema oral é inofensiva e co-habita em equilíbrio dinâmico, baseando esta estabilidade na homeostasia, porem quando este equilíbrio é quebrado, ocorre descompensação da flora comensal, levando a alterações patológicas infeciosas como é a cárie dentária e as doenças periodontais.
- O conhecimento dos microbiomas complexos descritos beneficiou bastante quando começaram a ser sequenciados os genomas dos diferentes organismos e começaram a ser usadas as técnicas de biologia molecular. A utilização do gene 16S rRNA permitiu a identificação molecular, revelando espécies que até agora se desconheciam por não serem cultiváveis Sendo que estudos sugerem que menos de 1% dos microrganismos podem ser cultivados devido à grande dificuldade de reproduzir as condições da cavidade oral em laboratório. O gene 16S rRNA é utilizado como referencia porque é : Gene ubíquo a todos os procariotas Taxa de mutação baixa por ter uma função essencial a célula – síntese proteica Tem regiões conservadas que podem ser utilizadas para desenhar primers de amplificação Regiões hipervariaveis que permitem a distinção entre taxas Tamanho suficiente para ter relevância estatística
- Este tipo de abordagem global aos sistemas biológicos tem gerado quantidades massivas de dados, daí a sua direta ligação ao desenvolvimento da bioinformática e da biologia computacional que permite o armazenamento , gestão e analise da quantidade massiva de dados gerada. Como é o caso da ferramenta OralCard que integra os dados da base de dados OralOme, que vai ser falada em seguida
- O OralOme surgiu da falta de uma ferramenta que reunisse as informações dos estudos de proteómica, sendo que o OralOme é uma base de dados onde estão compilados todos os estudos de proteómica de identificação de proteínas orais Fornece assim aos investigadores da biologia oral mais uma ferramenta de estudo da cavidade oral, mostrando-se como uma ferramenta útil para a pesquisa e desenvolvimento de -marcadores moleculares específicos de determinada patologia -testes de diagnostico -e contribuindo para a descoberta de novos agentes terapêuticos
- E Para colocar a informação do OralOma acessível foi criado O OralCard que é uma ferramenta bioinformática dedicada à investigação cientifica em Saúde Oral, que compila toda a informação sobre o proteoma oral, permitindo analisar e integrar os dados do OralOma. Funcionam assim como um importante recurso para os pesquisadores da área a compreender a fundação molecular implicada na biologia dos mecanismos das diversas patologias da cavidade oral.
- E Para colocar a informação do OralOma acessível foi criado O OralCard que é uma ferramenta bioinformática dedicada à investigação cientifica em Saúde Oral, que compila toda a informação sobre o proteoma oral, permitindo analisar e integrar os dados do OralOma. Funcionam assim como um importante recurso para os pesquisadores da área a compreender a fundação molecular implicada na biologia dos mecanismos das diversas patologias da cavidade oral.
- E Para colocar a informação do OralOma acessível foi criado O OralCard que é uma ferramenta bioinformática dedicada à investigação cientifica em Saúde Oral, que compila toda a informação sobre o proteoma oral, permitindo analisar e integrar os dados do OralOma. Funcionam assim como um importante recurso para os pesquisadores da área a compreender a fundação molecular implicada na biologia dos mecanismos das diversas patologias da cavidade oral.
- E Para colocar a informação do OralOma acessível foi criado O OralCard que é uma ferramenta bioinformática dedicada à investigação cientifica em Saúde Oral, que compila toda a informação sobre o proteoma oral, permitindo analisar e integrar os dados do OralOma. Funcionam assim como um importante recurso para os pesquisadores da área a compreender a fundação molecular implicada na biologia dos mecanismos das diversas patologias da cavidade oral.
- E Para colocar a informação do OralOma acessível foi criado O OralCard que é uma ferramenta bioinformática dedicada à investigação cientifica em Saúde Oral, que compila toda a informação sobre o proteoma oral, permitindo analisar e integrar os dados do OralOma. Funcionam assim como um importante recurso para os pesquisadores da área a compreender a fundação molecular implicada na biologia dos mecanismos das diversas patologias da cavidade oral.
- Atualmente existem numerosos estudos de genómica de identificação de microrganismos na cavidade oral, porem os resultados dos estudos estão dispersos pela literatura cientifica e a complexidade do sistema oral torna a sua recolha, comparação e interpretação uma tarefa morosa e que nem sempre concretizável -> Surge esta tese com o objetivo de Compilar os estudos do microbioma oral numa base de dados – a OralM -> que posteriormente será associada a base à base existente, o OralOma Com a associação feita, temos a informação reunida e que será posta à disposição através do OralCard.
- O primeiro passo foi através de uma pesquisa no PUBMED reunir todos os estudos de genómica de sequenciação do gene 16S rRNA de identificação bacteriana na cavidade oral Com os resultados da pesquisa era feita uma pré-seleção em que se eliminavam os artigos que não correspondiam aos critérios de inclusão. Os restantes artigos eram analisados e a sua informação era recolhida, anotando as bactérias encontradas em cada amostra e as condições experimentais da recolha da amostra o que iria constituir a base de dados OralM
- Para ser aceite o artigo tinha de cumprir todos os critérios de inclusão e não podia cumprir nenhum dos critérios de exclusão. Então para estar incluído os estudos tinham de ser realizados in vivo /na espécie humana /através de estudos de sequenciação do gene 16S r RNA / de amostras da cavidade oral Eram excluídos estudos in vitro / estudos de culturas bacterianas / estudos de outras espécies ou que fossem de outras localizações que não a cavidade oral.
- Resultados das pesquisas A primeira fase foi fazer uma pré-seleção dos artigos resultantes da pesquisa. Esta seleção grosseira dos artigos que não cumpriam os critérios de inclusão. Obteve-se assim um total de 347 artigos, porque tinham alguns resultados duplicados. Após a remoção de duplicados tínhamos 243 artigos Com estes 243 artigos foi feita uma segunda seleção em que se tinha em conta o artigo por completo dos quais 111 foram incluídos no estudo e 132 foram excluídos.
- A base de dados Oral M foi construída com diversa informação retirada dos artigos- microrganismos identificados métodos de analise dados da população campos adicionais Por questões de nomenclatura e de maneira a uniformizar a linguagem, para as patologias encontradas foi anotado o termo MeSH ID e para o nome dos microrganismos foi feita a sua correspondência ao Taxonomy ID que servira de ponto comum as duas bases de dados permitindo relaciona-las entre si .
- A base de dados oralM construída reúne a informação sobre o microbioma humano da cavidade oral. Da analise de 111 artigos obteve-se 8181 entradas –com 1399 espécies diferentes e correspondentes a 181 géneros. Dentro dos microrganismos encontrados, apresenta 166 estirpes/clones específicos da cavidade oral A construção da base de dados OralM foi projetada de maneira a ser possível associar à base de dados OralOma, para disponibilizar toda a informação contida em cada uma das bases de dados. (Dai a importância de se ter obtido o Mesh ID para as doenças e o código Taxon ID)
- Aqui podemos observar que existem uma grande discrepância entre o numero de estudos dos vários locais da cavidade oral, e que existem locais mais estudados em detrimento de outros, principalmente amostras de saliva e do biofilme subgengival nos estudos de genómica e in vitro nos estudos de proteómica Os estudos de genómica para identificação de microrganismos orais tem-se dedicado ao estudo da placa subgengival, e fazendo a analise conjunta por patologia conseguimos detetar que a maior parte dos estudos estão associados a definição do microbioma relacionado com as doenças periodontais devido a alta prevalência desta patologia na população
- Aqui verificamos que é na saliva que encontramos a maioria dos microrganismos uma vez que faz sentido considerar que a saliva reúne microrganismos das varias localizações e a maioria dos estudos incluídos nesta categoria usa amostras de saliva total. E em segundo lugar a placa subgengival uma vez que é a localização mais estudada até à data Por outro lado, é notório que no que se que se refere ao OralOme a maioria dos estudos provem dos estudos in vitro pois a maioria dos estudos de proteómica identifica sobretudo proteínas humanas e não microbianas. Isto porque a abundancia relativa destas moléculas (proteínas humanas) existirem em muito maior concentração na cavidade oral e se não forem usadas técnicas de enriquecimento da amostra num tratamento prévio sera difícil encontrar as proteínas microbianas na analisa e consequentemente identificar os microrganismos associados.
- Como é possível verificar , a OralM tem mais 1232 espécies correspondentes a 148 novos géneros identificados Isto deve se ao grande desenvolvimento das técnicas de genómica nos últimos anos que tem permitido identificar microrganismos através de técnicas independentes de cultura, o que não acontecia no passado dai a utilização dos métodos de genómica para a criação da OralM
- Observamos que em comum existem as patologias com maior prevalência da cavidade oral, e ainda o cancro da mama que indirectamente influencia a cavidade oral (pelo tratamento que é utilizado)
- A relação de complementação entre as duas bases de dados aumenta assim a informação disponível e facilita a sua acessibilidade, uma vez que reúne toda a informação encontrada ate a data do microbioma e do proteoma da cavidade oral humana. A abordagem da proteómica tem a vantagem de mostrar o real impacto do microrganismo no sistema, enquanto que a abordagem genómica revela apenas o potencial impacto uma vez que indica a presença da espécie e não a expressão do gene No entanto as dificuldade técnicas associadas a abordagem proteómica são maiores para estudos de amostras complexas que as abordagens genómicas, assim e dado que não conhecemos atualmente o sistema na sua totalidade será sempre útil e essencial reunir informações das duas abordagens para conhecer o máximo de informação que caracteriza o sistema da cavidade oral
- Este tipo de investigação permite o desenvolvimento de aplicações que ajudam os clínicos a melhorar o diagnóstico e prescrever uma terapêutica individualizada e especifica em vez da terapêutica empírica geralmente utilizada, evitando o desenvolvimento de bactérias resistentes a antibióticos
- Criação da base de dados OralM com a informação do microbioma da cavidade oral identificado até à data por técnicas de genómica de sequenciação do gene 16S rRNA. A comunidade cientifica da enfase aos estudos do biofilme subgengival devido À alta prevalência da doença periodontal na população mundial A associação da base de dados OralM com a base de dados OralOma completa e consolida a ferramenta bioinformática OralCard que passa a dispor da “evidência molecular total” da cavidade oral.
- Obrigado pela vossa atenção….