O documento descreve a história, técnica e aplicações da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A PCR foi descrita por Kary Mullis em 1983 e patenteada em 1989, permitindo a replicação in vitro de DNA e ampliação de sequências específicas através de ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. A técnica é sensível, rápida e barata, mas requer conhecimento prévio da sequência-alvo e é susceptível a contaminação.
1. HISTÓRIA
Em 1983, o processo de Reação em Cadeia de Polimerase foi descrito por Kary Mullis e em 1989
patenteado pela Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation. K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da
Química após 10 anos de sua descoberta.
O QUE É A PCR?
A técnica de biologia molecular por PCR promove, in vitro, a duplicação de cadeias de DNA, envolvendo
nucleotídeos, sequências iniciadoras (primers) e enzimas polimerases (enzima que catalisam a reação de
polimerização de ácidos nucléicos a partir dos seus monômeros).
É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde,
ou seja, consiste na produção de DNA, in vitro.
A TÉCNICA
A Reação em Cadeia da Polimerase é feita do seguinte modo: primeiro, extrai-se o material a ser
estudado: DNA, vestígios de crimes, etc. Na segunda etapa o DNA é colocado em microtubo de ensaio
juntamente com a enzima taq polimerase, nucleotídeos, os primers complementares a sequência de DNA,
Mg ²+ e solução tampão. Todos os “ingredientes” são colocados em uma máquina termocicladora, nas
condições ideais, semelhantes às do nosso organismo, onde ocorrerão cerca de 60 ciclos, cada um deles
divido em 3 etapas, sendo estas: desnaturação, anelamento e extensão.
A desnaturação é uma etapa com duração entre 30s e 1min a temperatura de 92-96ºC, onde ocorre a
separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da quebra das pontes de hidrogênio.
Durante o anelamento, com duração de 30s a 1min a temperatura entre 58 e 65ºC, os primers se anelam
as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. E, é nesta etapa que se tem o
seqüenciamento de DNA pelo Método de Sanger. O sequenciamento de DNA faz parte da etapa de
extenção - uma etapa com duração entre 45s e 1min, a 72ºc - pois é nesta etapa que se criam condições
ideais para a atividade enzimática da taq polimerase (temperatura ótima), que estimulada pela presença
de magnésio, irá “completar” o seqüenciamento iniciado pelos primers, que se incorporaram nas
extremidades da fita simples de DNA.
Estas 3 etapas acontecem repetidas vezes até a formação de milhares de novas fitas de DNA. Após cada
ciclo, o número de fragmentos se duplica, o que pode ser resumido pela fórmula matemática N = No x 2n.
A leitura dos resultados é feita através da eletroforese em gel de agarose um gel que se dissolve em água
fervente e geleifica quando esfria. O gel de agarose é a “Fase Estacionária”, que possui pequenos poços
onde a amostra a ser analisada será colocada. Por este gel, aplica-se uma corrente elétrica e como o
DNA é negativamente carregado, ele será atraído pelo pólo eletrodo positivo, migrando através do gel. O
tamanho exato de um fragmento pode ser obtido através da razão de migração. Após a eletroforese em
gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de etídeo, que possui afinidade pelo
DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta (procedimento realizado em
câmera escura). Dessa forma podem-se localizar as bandas que correspondem ao DNA e, através de
comparação, descobrir se o resultado foi positivo ou negativo.
VANTAGENS
As vangagens de se utilizar este método são: não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar,
mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que os primers definirão a
especificidade; a capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA; a elevada sensibilidade e
especificidade; ser uma técnica rápida, barata e segura.
LIMITAÇÕES
As limitações são: a necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizar primers
específicos; a relativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho; a limitada extensão
da sequência; a incorporação errônea de bases durante a replicação; substâncias que conhecidamente
inibem a reação, como é o caso da hemoglobina.