Formation M2i - Femmes entrepreneures : soyez actrices du changement
Republique algerienne democratique populaire 1
1. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE POPULAIRE
Ministère de L'enseignement et de Recherche
Université Mohamed Khidher BISKRA
Faculté des sciences exacte et des sciences de la nature et de la vie
Département des sciences de la nature et de la vie
1ère Année Master Biochimie et Biologie Moléculaire
Module : notion de gêné génétique
groupe : 01
Présenté par:
-AOUN DALLAL
-BACHIR Besma
-Ben abbes kaltoume hanane
-BOUGHDIRI HIND
hargé de module :
BENCHARIF -Boukhalfa Achouak
-Lebbal Moufida
-OULD AMMAR Soumia
2. Espace réservé du contenu 3
Thème :
L’éléctrophorése et ses application
sur les protéines
3. Plan de travail
1/ Généralité sur l’éléctrophorése et les protéines
2/ Matériels et méthodes
3/ Les applications de l’électrophorèse sur les protéines
4. Introduction :
Comme il est possible de séparer les types cellulaires vivants
qui constituent un tissu, il est possible de séparer les organites
fonctionnels et les macromolécules d’une cellule.
Dans notre exposé, on va vous expliquer les méthodes qui permettent de
séparer et analyser biochimiquement les protéines,
alors comment réaliser la séparation des protéines ?
5. Historique:
ar S.E. Linder et H. Picton qui se sont inspirés des travaux d’Herman
, Tiselius introduit l’éléctrophorése pour séparer les protéines e
elm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l'é
•En 1959, Raymond introduit les gels de polyacrylamide
6. Définition:
•L’électrophorèse en grec => transport
me l’une des méthodes d’analyse les plus avantageuses de la chim
èse verticale le déplacement de l’ion dans un champ électrique pour séparer
7. But:
- séparer les protéines.
- déterminer les fractions protéiques.
9. Les montages:
:
en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme d
plongent dans un tampon d'électrode, créant une mince couche d'eau à sa su
t souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Du
12. Les produits chimiques et réactifs:
Solvant usuels: acide acétique, méthanol,
glycérol, isopropanol, 2-marcaptoéthanol, …etc.
Sels et tampons : glycine,trishydroxyméthyl
aminaminométhane (Tris).
Réactifs spécifiques : acrylamide, N, N'-méthylène
-bis acrylamide, N, N, N', N'-tétraméthyléthylène
-diamine (TEMED), dodécyl sulfate de sodium (SDS),
Blue de Coomassie R250…etc
13. Les gels d'electrphorese ;
Gel de polyacrélamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis):
Figure n°3 : structure de gel de polyacrélamide
16. *on prend 1ml de l ’ extrait de protéine par une pipette ,on le met dans un eppendorf
*on le placé dans un VORTEX ( 15
min).
er dans une centrifugeuse ( 10 min) a 4°C.
ait transférer le surnageant dans un nouveau tube dans lequel on ajout 0.2ml de chlorofor
*on agit c tube( 15 scd) –incuber à température ambiante( 3 min).
*une 2 eme centrifugation (15 min).
*on obtient un contenu en 3 phases (aqueuse-interphase et organique).
*le surnageant sera jeté.
*on ajout 0.3ml de l’éthanol.
*agitation (15 scd)-incubation(3min).
*3 eme centrifugation (05min).
*Le surnageant sera réparti dans 2 tubes d’une façon équivalente.
*ajouter 0.75ml de l’isopropanol dans chaque tube
17. tation (15scd)-incubation a t° ambiante (10min)-centrifugation (10min)-jeter le surnag
age par l’acétone froid (vortex 1min-centrifugation 10min –jeter l’acétone)
étition de lavage.
vrir les bouchons des tubes pour l’évaporation des résidus de l’acetone.
18. La préparation des gels :
st une matrice de séparation utilisée en électrophorèse de biomo
peuvent varier en composition.
ux types de gels : Un gel de séparation et un gel de concentration
19. 1/Un gel de séparation :
arer 10 ml (par exp) d’une solution mère à 10 % de polyacrylamide (en sépar
Composant Volume
ddH20 4,0 ml
mélange d'acrylamide 30 % 3,3 ml
1,5M Tris pH 8.8 2,5 ml
10 % SDS 0,1 ml
10 % ammonium persulfate 0,1 ml
TEMED 0,004 ml
20. 2/Un gel de concentration :
préparer 10 ml d'une solution mère à 5 % de polyacrylamide (sta
Composant Volume
ddH20 4,0 ml
mélange à 30 % d'acrylamide 3,3 ml
1,0M Tris pH 6.8 2,5 ml
10 % SDS 0,1 ml
10 % ammonium persulfate 0,1 ml
TEMED 0,004 ml
met le polyacrylamide dans la cuve.
met le peigne dans le gel délicatement pour réaliser les puits.
rès polymérisation ; l’insertion de la plaque dans l’appareil de l’électrophorè
21. Elle nécessite une cuve
à électrophorèse et
une alimentation continue
la moins coûteuse Le protocole de
gel d’agarose =de polyacrélam
Gel
la plus aisée
d’agarose
à une meilleure sensibilité peu utilisée dans
une meilleure résolution le cas des protéines
des fractions protéiques.
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22. á PH discontinu
tampon du réservoir supérieur
contient un acide faible: Glycine
pH près du PH de réservoir inférieur
gel de concentration
PH du tampon du gel de concentration
< 2
gel de séparation PH de gel de séparation
Tampon du réservoir du bas
=
tampon du gel de séparation
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25. s séparation par électrophorèse en gel, les bandes obtenues peuven
isées par différentes techniques.Les protéines sont souvent révélées
2 / C o m p t/ ig em u n o t r a n s f
3 a m
/ C o lo r a t io n
r a d i o a c «t fw e s t e r n b l o t
i
B l et u ad e
Ni r t
f lu o r e s c a m in e
c o o mg e n ti e
d’ ar as s
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26. immunotransfert « western blot »
a- Saturation de la membrane (blocage) Fixation
des protéines de façon non spécifique sur la membrane
b- Incubation avec Anticorps primaires
c- Incubation avec Anticorps secondaires
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29. En pharmacie : Permettant la découverte de nouveaux médicaments
et la validation des cibles pour la conception de médicaments.
En biochimie : pour Fournit des informations sur la structure
la taille moléculaire, le paramètre physico-chimique,
la quantité et la pureté d'un échantillon de protéine.
En biotechnologie : L'industrie des biotechnologies a connu
une croissance rapide ces dernières années en grande partie
attribuable au développement et au succès de base de protéines
thérapeutiques pour un large éventail de troubles.
Similaires aux produits pharmaceutiques traditionnels,
la caractérisation d'une protéine thérapeutique pour
ses propriétés physico-chimiques,
la surveillance du processus et l'émission de lots est essentielle.
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30. En immunologie, notamment pour confirmer
le diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire.
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31. 2- Exemple d’utilisation d’électrophorèse :
La séparation et l'identification de protéines
par électrophorèse de liquides biologiques
Des pathologies rares affectant la production
des anticorps comme l'agammaglobulinémie,
absence de sécrétion des gammaglobulines
et l'hypogamma globulinémie,
sécrétion insuffisante des gammaglobulines,
peuvent être détectées par électrophorèse
des protéines sériques.
Dans le but d'identifier la nature de leur pathologie,
on a soumis à l'électrophorèse le sérum de deux patients
atteints de dysfonctionnements du système immunitaire.
Outre le sérum des deux patients (pistes 2 et 3),
on a également soumis à l'électrophorèse deux échantillons
de sérum normal (pistes 1 et 5) ainsi qu'un échantillon
d'immunoglobulines pour servir de référence (piste 4).
Les résultats obtenus et le profil densitométrique
des pistes sont présentés ci-dessous à droite.
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32. L'examen visuel des profils électrophorétiques complété
r l'analyse densitométrique permet d'identifier certaines anomalies :
L'individu 2 présente un sérum particulièrement concentré
n immunoglobulines mais les autres protéines sériques présentent
une concentration inférieure à la normale.
ersement, le sérum de l'individu 3 est dépourvu de gamma globulines
tandis que les autres bandes sont normales.
Dans le premier cas, il s'agit d'une hypergammaglobulinémie
tandis que dans le second, il s'agit d'une agammaglobulinémie.
Cinq pistes d'électrophorèse
Profils densitométriques correspondants
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