8. 服从或近似服从正态分布。因此认为某一个 MHC-肽复合体与整个人
体的全部 TCR 的亲和力呈正态分布。
在携带有抗原表位肽的 MHC-Ⅰ分子与 CTL 的 TCR 的衔接中,CD8
的衔接被认为在幼稚 T 细胞的活化中是非常关键的因素, kerry SE
但
等(8)发现即使是没有 CD8 分子的参与,只要通过改变肽-MHC
(pMHC)/TCR 复合体中短肽而获得足够的亲和力,幼稚的 T 细胞也同
样能被活化,在早期的信号传导和晚期的功能活性方面都和有 CD8 是
一样。由此可见亲和力的介导并不要求严格的结构特异性。
对于两个细胞之间的亲和力与它们之间表面的分子结构有关外,
还与它们的表达量有关。当细胞表面的 TCR-肽-MHC 分子数量太少时,
细胞也会表现不活化。同时介导亲和力的分子一般由多种共刺激分子
组成,当它们之间的相对和绝对数量不同时可形成不同的亲和力。所
以这就决定了细胞间活化具有特异性和非特异性。它们之间这种由介
导分子的数量和结构决定的亲和力有一个活化域值。假设细胞表面特
异性结合分子的总亲和力为 q,双方 q1 与 q2 的乘积称为亲和积。那
么它们之间的亲和积有个平衡改造域值:q1×q2=K(K 为个体亲和
积,又称个体平衡改造平衡常数,与物种、遗传、年龄、体温、营养
状况等有关)。当 q1×q2>K 时,对结构的改造加剧,结构明显改变。
如果某一个 DC 与 Th 的相互作用时 q1×q2>K,那么 Th 活化,或者 DC
和 Th 同时活化;如果 DC 与 Th 的相互作用时 q1×q2≤K,那么 DC 和
Th 都不活化,但并不是它们的结构不发生改变,只是改变不明显罢
了。tetramer 能对 T 细胞 TCR 或 TCR-CD3、CD4 或 CD8 复合型表现出
9. 亲和力,但它们缺少与 T 细胞之间结合后的互动,不能像真正的 APC
一样分泌细胞因子和表达更多的共刺激分子,进一步对 T 细胞进行结
构改造。但这也有优点,它们可以用来检测实时体内和体外 T 细胞的
亲和力状况,可以标准化。假设 tetramer 的亲和力是 q,只要 T 细
胞的亲和力大于 k/q,那么这样的 T 细胞就能被检测得到。ELISPOT
涉及细胞培养,细胞在体外的亲和力会发生改变,主要是升高。而
tetramer、ELISPOT、细胞内细胞因子染色示三种检测有一致性的结
果(9),说明亲和力的大小与功能是一致的,同时也说明 T 细胞的特
异性亲和力大小的细胞频率呈正态分布。体外的 ELISPOT 如果不考虑
取血、细胞分离和体内体外微环境改变对细胞的影响,不考虑 K 值的
改变,ELISPOT 技术检测到的 T 细胞频率从理论上包括三部分组成,
一部分是在体内活化的 T 细胞,一部分是体内成熟的,另一部分是体
内不成熟的体外培养成熟的,这都取决于 T 细胞 TCR 及其它黏附分子
的表达变化。所以从亲和力理论上来说,tetramer 和 ELISPOT 能检
测到体内亲和力已经成熟的和还没有成熟的,但成熟了的 T 细胞在体
内不一定在行使功能,还必须对方也有足够亲和力,并且有相互作用
的机会。同时亲和力是相对作用双方的,同一个 APC 在与抗原的双向
选择中表现出来的亲和力与其与 Th 细胞作用是不一样的。
同时,在抗原刺激 APC 细胞的过程中,可能它们之间的亲和积低
于活化域值,细胞并不出现较大的结构改变而走向成熟,但可能某个
刺激分子配体和受体之间所引起的信号传导已经发生,使细胞内部结
构发生改变。双方亲和积在个体平衡改造平衡常数之上时,结构明显
10. 改变;在平衡常数之下时,结构轻微改变。结构明显改变包括成熟、
活化、抑制、死亡和细胞分裂等。
体系中的免疫双向选择
在 ELISPOT 试验中如果 T 细胞的阳性细胞频率太少,可以适当增
加 DC 的浓度或者在一定范围内增加抗原的量增加抗原浓度来达到提
高阳性频率的目的。在人体的疫苗注射中,同等剂量的疫苗注射在淋
巴结内、皮下会比静脉效果好,这是为什么?因为在个体的静息活化
域值的限制下,由于二者必须有亲密接触的机会,这是一个概率问题,
与双方的浓度有关。在同等计量的用量时,血液给药,很快被稀释;
而淋巴结引流区前体 DC 丰富,浓度也较高,在亲和力不变的情况下,
抗原和前体 DC 细胞结合的几率最高;即使在浓度相同时,由于 DC 在
淋巴结引流区中浓度高,这种概率也更高,所以淋巴结引流区较高,
而血液小。在一个细胞群体中,一方的亲和力往往也不全相同。也认
为群体的亲和力符合正态分布。设一方个体浓度为 L,单个个体的亲
和力为 q,具有相同亲和力的个体数量为 a,那么一方的浓度亲和力
为 L = ( a1q1+a2q2+…………anqn ) /V; 平 均 个 体 亲 和 力 为 : q =
(a1q1+a2q2+…………anqn)/(a1+a2+…………an)
。在个体亲和积的基
础上,体系中双方达稳定平衡时,由概率决定的群体有此时有
L1q1×L2q2=K (K 为群体亲和积,为群体平衡改造常数,与物种、遗
传、年龄、营养状况等有关),称为群体平衡改造平衡常数,类似溶
解沉淀平衡常数。当双方的浓度亲和积>K 时,双方的数量和结构都
11. 将明显改变,直到浓度亲和积≤K。群体平衡改造平衡常数在不同的
双向选择双方中由于发生结合后的效应不同而有不同的名称:在抗原
和 DC 的活化作用时称为静息活化平衡常数。
免疫双向选择的选择速度和排斥速度
选择速度是指双方从游离到结合的浓度/数量的改变快慢;排
斥速度是指使对方结构发生改变的快慢。
选择的浓度(L),单位:个;选择速度(S)是指一方对另一方
选择作用后,另一方的单位时间内的浓度消耗,单位:个/毫升·秒。
在人体中,很多分子、细胞等结构的数量处在一个动态平衡之中,不
只是有消耗量,还会有新生量。设新生浓度速度为 N。
这样在人体一个反应体液容积一定的双向选择体系中,设定反应
双方 A 和 B,其反应产物为 C(或者还有另外的产物 D)
,例如以 A 表
示新生的 DC 前体细胞,以 B 表示抗原,C 表示负载有这种抗原的成
熟 DC,那么在人体中这就是一个单向的反应。
A + B C
如果 Sa=Na 时,称为单极免疫双向选择平衡;如果 Sa=Na,且
Sb=Nb 时,称为双极免疫双向选择平衡。双极免疫双向选择平衡为
稳定的平衡。选择速度与亲和力、体流速度等有关。选择速度与选择
双方的浓度亲和积的乘积正相关,S=k·L1q1×L2q2,类似化学反应速
a b
度方程式 V=kA B ,实际上它们是同一个问题,都有被概率决定的因
素。当双向选择双方处于 L1q1×L2q2>K(K 为平衡改造平衡常数)的情
况,此时单位时间双方出现结合的概率增加,发生改造的次数增加,
18. 体慢性病毒感染的高发器官的原因。最近有人报告活化的 CD8+T 细
胞在到达肝脏后 18 小时发生调亡,另有有学者估计在慢性 HCV 感染,
每天在肝脏要损失约 2 亿个 T 细胞,占全身淋巴细胞地 0.1%(22)
。
这样 E 的数量和补给速度于 F 的数量和补给速度对于乙肝病毒和宿主
之间的相互的双向选择的结果是起到决定性的作用。
在乙肝病毒进入人体几个月大量复制后,人体才产生特异性细胞
免疫反应。在黑猩猩实验中特异性细胞免疫反应 7 周左右才启动。这
可能与病毒抗原与人体 DC 细胞亲和积低有关。在 A 与 B 的双向选择
中,要使 A 和 B 的浓度亲和积大于平衡改造平衡常数,需要 A 的浓度
超过一定的限度。而 A 的浓度又与 F 的数量和感染程度正相关。如果
在感染人群中,达到平衡改造平衡常数时的 HBV-DNA 越高,C 的出现
越晚,此时肝细胞被感染的程度也越高,在进一步的 HBV-DNA 攀高的
过程中,相同的 HBV-DNA 水平下,活化势越低,C 的流量也越低,如
果 C 的流量与 E 的流量正相关的话,乙肝病毒的感染结果可能出项以
下三种比较典型的情况:①在乙肝病毒逐步扩大感染肝细胞数量时,
在肝细胞感染数量少的情况下,免疫系统的效应细胞流量达高峰且流
量大,出现无症状清除;②在肝细胞感染数量大的情况下,免疫系统
的效应细胞流量达高峰且流量大,则发生急性肝炎或者爆发性肝炎;
③在肝细胞几乎完全感染,而免疫系统的效应细胞流量迟迟未达高峰
而流量较低,则出现一过性转氨酶升高后,进入长达十年二十年的低
效应细胞流量的免疫耐受期。
在慢性乙肝免疫耐受的病人中,组织学检查示(12)肝内浸润的
19. CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞数明显多于正常肝组织(t=4.504,
8.272,4.742,P 均<0.01),但明显少于免疫活动期患者(t=7.079,
6.866,6.316,P 均<0.01). 免疫耐受期患者肝内 CD4+主要分布在
汇管区,肝小叶内仅零星分布几个,均稍多于正常肝组织(P<0.05),
但明显少于免疫活动期患者(P<0.01)免疫耐受期患者肝小叶内及汇
管区 CD8+细胞明显少于免疫活动期患者(P<0.01),但明显多于正
常肝组织(P<0.01)。这说明慢性乙肝耐受期的病人肝内少量的高亲
和力 E 的流量,它们也能低水平发挥像急性肝炎中第一阶段作用,但
引起的第二阶段的作用和第一阶段无明显增强。这说明 C 也处于一个
低流量,间接的认为 B 处于一个低的生理补给流量。但由于 F 的数量
和高的补给速度(10),使得 E 的流量对完全清除病毒无能为力,此
时 E 的流量等于 G 的流量。慢性乙肝患者肝脏内的淋巴细胞浸润,出
现虽然不成功,但持续进行着试图清除感染的炎症反应,从而出现持
续的免疫介导的肝脏疾病。并最终耗竭肝脏的再生能力。星形细胞转
化为分泌胞外基质的细胞,并发展为肝纤维化和肝硬化。
乙肝病毒颗粒可以引起单核细胞来源的 DC 产生 IL-2,TNF-α、
IFN-γ(23),其核衣壳可通过巨噬细胞表面的膜硫酸乙酰肝素,还
有 TLR2 的介导,使其强烈产生多种细胞因子(24)。但在慢性乙肝病
人外周血中,髓样 DC(DC1)和浆细胞样 DC(DC2)的数量和功能都
有不同程度的改变,与正常人相比,DC1 前体细胞的共刺激分子表达
降 低 ( 25 ) 削 弱 自 身 混 合 淋 巴 细 胞 反 应 (autologous mixed
,
lymphocyte reaction, AMLR)能力,同时降低 DC2 前体细胞的数量和
20. 功能。但(26) DC2 在 HBV-DNA<106 的病人比在 HBV-DNA>106 的病
人的百分比要显着升高。从单核细胞来源的 DC(MDDC)像被 HBV 感
染,与正常人相比,在 HBsAg 刺激时,细胞表面表达 HLA-DR 和 CD40
减少,IL-12P70 的分泌减少,但对 LPS 的反应跟正常人无明显差别
(27)。MDDC 与 T 细胞的相互作用减弱,在活跃复制的病人中更为明
显,表现在 DC 没有增加 HLA-Ⅱ、B7 分子的表达和 IL-12 的分泌,用
HBsAg 刺激时,诱导 T 细胞对 HBsAg 的增值、产生细胞因子和毒性 T
细胞产生均失败( 28)。这说明病人体内的 DC 的数量和结构都出现了
不同程度的改变,对乙肝抗原的亲和力选择性减低。但是在细胞因子
诱导成熟后(27),表位肽长时间刺激后(29),加用 Poly(I:C)后
(30),病人的 DC 并没有明显的缺陷。这说明在体外能诱导 DC 细胞成
熟,能表达足够的 HLA-Ⅱ、B7 分子以增加亲和力来行使其功能。但
也有报道(31),慢性乙肝患者 DC1 成熟时表达 CD80 和 CD86 的阳性
百分率比正常人显着减低,共刺激能力低下,但 DC2 没有差别。这说
明慢性乙肝病毒对 DC 的结构影响是普遍的和深远的。在高浓度的
HBV-DNA 作用下,同一体系内的 DC 的数量和结构的改变是不可避免
的。
临床中可以通过两类药物的对双向选择方程进行影响,它们是核
苷类似物和免疫抑制剂。在核苷类似物中,拉米夫定是较为常用的,
拉米夫定通过影响 F 和间接影响 A 起作用。因为 A 与 B 以及 E 与 F 之
间存在平衡改造平衡常数,所以 B 和 E 的数量和结构也会随 A 和 F 的
数量和结构改变而改变。病人在使用拉米夫定后,乙肝病毒复制得到
21. 了抑制,外周血中乙肝病毒滴度(A)下降,被感染的肝细胞(F)及
其感染程度降低,E 的数量和亲和力增加(32),ELISPOT 检测特异性
T 细胞活性增强(33),但 E 和 F 之间的活化势降低,G 和 H 的流量减
少,患者谷丙转氨酶(ALT)恢复正常。由于伴随 A 下降,B 的数量
和群体亲和力增加(23),但 A 和 B 之间的活化势减小,C 的流量减
小,从而使 E 最终减小,ELISPOT 检测特异性 T 细胞活性减低,在使
用至 6 个月的时候,部分患者出现病毒开始变异,外周血中病毒滴度
增加(34)。但患者停药后,F 和 A 同时增大,而 B 处于一个相对较大
的群体亲和积,C 的流量猛然增大,E 的流量继发增大,最后与处于
一个峰值的 F 相遇,二者处于一个高的活化势,导致大量的被感染肝
细胞被破坏,所以拉米夫定停药后也容易复发,甚至病情更加严重,
出现肝功能失代偿而导致死亡(35)。所以也有报道部分研究人员使
用拉米夫定,中断 2 周后,再继续服用,疗效有一定改进(36),还
有报道短期使用拉米夫定(37),然后停用,大部分病人转氨酶升高,
也取得了 HBeAg 转阴、HBV-DNA 显着降低的较好的疗效。这种现象称
为拉米夫定效应。
免疫抑制剂可通过激活诱导细胞凋亡(AICD)等途径作用于 B
和 E,使得它们的群体亲和积减小,而使 A 和 F 的群体亲和积增大,
使用糖皮质激素后,HBV-DNA 升高(38)。当停药后,B 和 E 的补给流
量增大,使得活化势增大,C 的流量增大,进一步增大 E 的流量,最
后与处于一个峰值的 F 相遇,二者处于一个高的活化势,导致大量的
被感染肝细胞被破坏。所以有乙肝病毒感染的病人使用 OKT3、 ATG
26. 法,并且在使用免疫治疗前优先使用拉米夫定等核苷类似物抑制病毒
复制,预先降低病人血液中病毒抗原的含量,能增强慢性乙肝治疗的
疗效。这一策略已取得国内外大多数同行的一致认同,最近的动物和
临床试验都已经证明其与实践的相互吻合(60-62)
。
持续存在的乙肝病毒抗原对对其敏感的前体 DC 持续的反向选择,
使得这些前体 DC 不能在同一段时间内积累,继而使得二者相互作用
后产生的成熟的活化的 DC 不能在同一段时间内积累,以致不能同时
产生足够的 CTL 细胞进行有效的控制被感染的肝细胞的作用。所以有
必要提前降低病人细胞外液中慢性乙肝抗原的含量,以减小它们的反
向选择作用。自然界中生物对有限的资源同样存在着相互的竞争。各
种免疫细胞以及它们的亚群之间均存在着相互的竞争和抑制作用,如
T 细胞、NK 和 NKT 细胞之间以及它们亚群之间的相互竞争(63)。人体
各种前体 DC 细胞亚群之间也同样可能存在不同种群之间的相互竞
争。乙肝病毒抗原系统对对其敏感的前体 DC 持续的反向选择,使得
这些敏感的前体 DC 减少,进而使得它对其它前体 DC 细胞的抑制作用
减弱,其它的前体 DC 细胞数量就会增加,进而增强了它们对对乙肝
病毒抗原系统敏感的前体 DC 细胞的抑制作用,使其恢复感染前的速
度减小和能恢复的数量减少。同样,被感染的肝细胞也会持续的反向
选择对其敏感的 CTL 细胞而使其数量减少,其它 CTL 细胞的数量将会
增加,它们的抑制作用也会抑制乙肝病毒特异性 CTL 的恢复。为了增
加对乙肝病毒敏感的前体 DC 的恢复速度,增大其能恢复的数量;同
样也为了特异性抗乙肝病毒的前途 CTL 细胞的恢复,有必要解除这种
27. 持续的抑制作用。另外,外周血中被感染的 DC 细胞低水平表达 MHC
和共刺激分子(64),使得它们在与乙肝病毒特异性的 T 细胞群作用
时,诱导活化的 T 细胞的比例将下降,而耐受和调节性 T 细胞产生的
比例将升高。要解决这些错综复杂的局面,必须对免疫系统重新进行
一次格式化。
所以作者认为慢性乙肝的治疗可以分为两个阶段,如下:
第一阶段:免疫系统重新格式化阶段
在有效抑制病毒复制,有效降低血液病毒抗原的基础上,使用糖
皮质激素等免疫抑制剂,非特异杀死或者非特异诱导免疫细胞调亡之
后,对患者加以营养或者血液、免疫系统兴奋剂后使免疫系统重新恢
复,完成免疫系统的重新格式化。
第二阶段:免疫治疗阶段
在免疫系统完成重新格式化后,继续有效抑制病毒的复制,使用
乙肝病毒特异性免疫治疗性疫苗,激活特异性体液免疫和细胞免疫,
清除和治愈被感染的肝细胞,实现免疫系统主导的双向选择平衡。
具体方案
具体实施计划图(横坐标:weeks)
:
28. 1~10 周为免疫系统重新格式化阶段, 周起为免疫治疗阶段。
11
①基因重组表面抗原抗体或者 RNA 干扰类药物(目前还没有上市
的药物)或者有抑制病毒抗原表达的中草药(苦味叶下珠等)降低病
人外周血中的蛋白类抗原的水平。人源表面抗原抗体的制备可通过基
因重组技术和杂交瘤技术制备,并且目前两种技术均较为成熟。
②第 5 周开始使用糖皮质激素类药物。糖皮质激素通过淋巴细胞
表面的糖皮质激素受体,诱导 T 细胞和 B 细胞等免疫细胞调亡。它还
能抑制 DC 分化发育,增加 DC 内吞活性,抑制 DC 呈递抗原,降低共
刺激分子表达和减少脾脏中 DC 数量,从而降低了 DC 刺激 T 细胞的活
性。糖皮质激素与 DC 的调亡呈时间效应关系和剂量效应关系,但没
有诱导巨噬细胞调亡的现象(65)
。糖皮质激素能截断负载有乙肝病
29. 毒抗原的 DC 对乙肝病毒特异性的幼稚 T 细胞持续的选择作用。
③在免疫系统恢复期和免疫治疗期间,都必须充分保证营养的供
给,使患者的体液免疫和细胞免疫处于一个较好的水平,如果经口和
胃肠道吸收不良或者不便时,应考虑静脉营养等方式,但应减少促进
纤维化的营养、氨基酸的供给(66)
。
④特异性免疫治疗药物,使用免疫治疗的疫苗类药物必须大剂量
和皮下多点给药.目前的治疗性乙肝疫苗多种多样,蛋白类、多肽类、
HBV DNA 类、腺病毒载体类等等。但作者认为,HepG2 细胞产生的 Dane
颗粒和核衣壳是理想的特异性免疫成分,将其灭活或部分灭活等处理
制成疫苗,很可能要优于目前的种种设计方式。人体的 DC 能摄取病
毒抗原,不支持乙肝病毒的复制和感染,乙肝病毒主要存在内含体中,
在细胞质中无核细胞质转运,细胞浆内无复制(67),所以部分灭活的
乙肝病毒很可能不会给病人带来严重的后果。DC 能通过交叉递呈的
作用激活 CD8+和 CD4+的细胞免疫,所以并不需要采用 DNA 在人体
肌肉细胞表达后,才能引起特异性的 CD8+的 T 细胞反应。并且作者
对 DNA 疫苗诱导的特异性 T 细胞的流量水平是怀疑的,在慢性乙肝的
治疗中,过低的特异性 T 细胞生成流量有时是无效的,甚至是有害的。
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