DELI-test pour l'évaluation de la chimiosensibilité in vitro de Plasmodium falciparum - Présentation de la 4e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Valérie ANDRIANTSOANIRINA - Etudiant/Chercheur - Institut Pasteur de Madagascar - landyvalerie@yahoo.fr

1. DELIDELI--test pourtest pour
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Valérie ANDRIANTSOANIRINA – Atelier paludisme 2006 - IPM
EVALUATION
par les FACILITATEURS
EVALUATION
par les FACILITATEURS
EVALUATION
par les FACILITATEURS

2. Plan
Introduction
Test in vitro : DELI test
Comparaison de microtest isotopique avec
DELI test
Etude faite au Sénégal et Burkina Faso en 1997-1998
Avantages et limites
Conclusion

3. Introduction
3 méthodes d’évaluation de la chimiosensibilité :
-Tests In vivo : technique de base pour déceler la résistance, test simplifié de 14j,
recherche de la pharmacorésistance
-Test In vitro : incubation des parasites dans un milieu réparti dans des puits
contenant une gamme de concentrations de médicaments.
-Marqueurs moléculaires (SNPs) : nouvelles technologies
Définition chimiorésistance des parasites : « l'aptitude d'une souche de
parasites du paludisme à survivre ou à se reproduire malgré l'administration et
l'absorption d'un médicament employé à des doses égales ou supérieures aux
doses ordinairement recommandées mais comprises dans les limites de
tolérance du sujet » (OMS)

4. Test in vitro
Test de chimiosensibilité :
phénotypage
Détection des marqueurs génétiques
de résistance : génotypage
Microscopie
Isotopique (Hypoxanthine tritiée)
Colorimétrique : pLDH, HRP II
Cytométrie en flux
Microfluorimétrique (Sybrgreen)
PCR/séquençage
PCR/sonde (Dot blot)
RT-PCR
Puces à ADN (Microarrays)
PCR/RFLP

5. Test in vitro : DELI test
Méthode colorimétrique : Double-Site Enzyme Linked LDH
Immunodetection (DELI test)
Principe : méthode basée sur la détection de la lactate
déshydrogénase spécifique de Plasmodium falciparum
Reconnaissance de 2 sites différents de l’enzyme par 2 Ac
monoclonaux spécifiques : Mab17E4 et Mab19G7
Coorélation entre densités optiques obtenues et les densités
parasitaires

6. Test DELI, principe de l’ELISA « double sandwich » pLDH
Microplaque
ELISA
Coating Mab 17
40°C
Dépôt des parasites
après congélation
1h/37°C
2ème Ac Mab
biotinylé 1h 37°C
Streptavidine
Pod 30min TA
Substrat 5-10 min
TA obscurité
Arrêt Ac
phosphorique
Les résultats sont exprimés en CI50 : concentration d’antimalarique inhibant 50% de la quantité de
pLDH libérée par rapport au témoin sans antimalarique.
Ac spécifique
pLDH de P. falc

8. Etude comparative de DELI test et
microtest isotopique
Moreno et al. Evaluation under field conditions of the colourimetric DELI-microtest for the assessment of
Plasmodium fakiparum drug resistance. Trans R Soc Trop Med H. 2001; 95, 100- 103
67/85 (79%) : asymptomatiques
Lame positive
Parasitémie : 0.005 – 1% (0.1%)
51/124 (41%) : fièvre, autres signes
Lame positive
Parasitémie : 0.01 - 5% (1%)
Burkina Faso (1998)Sénégal (1997)
Sensibilité des isolats : chloroquine sulfate, quinine hydrochloride, mefloquine
hydrochloride, amodiaquine
Pour les isolats, les microtests : faits sur des plaques dupliquées
• Pour mesurer la croissance des parasites par méthode
isotopique
• Pour la méthode DELI

10. Avantages
DELI test
Grande sensibilité, faibles parasitémies
Différenciation des isolats sensibles et
résistants/intensité coloration, diminution pLDH libéré
Calcul valeur CI50
Lecture sans compteur à scintillation mais
spectrophotomètre
Pas de composé radioactif
Utilisation pour enquêtes sur terrain/techniciens de
santé
Facile et rapide
Brasseur P et al. Évaluation de la sensibilité in vitro de Plasmodium falciparum aux antimalariques par un test colorimétrique
(DELI-microtest). Med. Trop. 2001; 61 : 545-547.

11. Limites
DELI test
Disponibilité des anticorps monoclonaux
Temps : pour la recherche de la bonne dilution

12. Conclusion
Enzyme pLDH et antigène HRPII (Double enzyme-
linked immunoassay)
Coût/disponibilité de Mab ou microplaques
Corrélation (pas de concordance) avec test isotopique
Hautement précis/très sensible (0.01% parasitémie)
Kits pour standardisation simple et reproductibilité des essais
Microtest isotopique: problème de budget, difficile sur terrain
Technique syberGreen (immunofluorescence) peut permettre de combler la
défaillance de ces techniques

13. Conclusion (2)
Le test in vitro est-il suffisant pour évaluer la
chimiosensibilité?
Test in vitro résultat quantitatif
en dehors contextes pathologiques et immunologiques
le phénotype déterminé par le test in vitro : objectif, plus fiable, plus
reproductible, plus utilisé
Test in vivo mise en œuvre facile
suivi des malades, intervention rapide
recueil des données cliniques et épidémiologiques
Tous ces données sont importants pour guider la politique nationale de la lutte
contre le paludisme de chaque pays

14. Références
Brasseur P et al. Évaluation de la sensibilité in vitro de Plasmodium falciparum aux
antimalariques par un test colorimétrique (DELI-microtest). Med. Trop. 2001; 61 : 545-
547
Basco L. et al. Chimiorésistance du paludisme : problèmes de la définition et de
l'approche technique. Cahiers d'études et de recherches francophones / Santé. Vol. 10,
Numéro 1, Janvier - Février 2000 : 47-50
Parola et al. Chimiosensibilité de Plasmodium falciparum importé des Comores à
Marseille en 2002–2003. Médecine et Maladies Infectieuses
Volume 35, Issue 10 , October 2005, 489-491
Moreno et al. Evaluation under field conditions of the colourimetric DELI-microtest for
the assessment of Plasmodium fakiparum drug resistance. Trans R Soc Trop Med H.
2001; 95, 100- 103
Druilhe et al. A colorimetric in vitro drug sensitivity assay for Plasmodium falciparum
based on a highly sensitive double-site lactate deshydrogenase antigen-capture
enzyme-linked immunosorbent assay. Am.J.Trop. Med.Hyg. 2001;64:233-241
Makler et al. Maesurement of the lactate deshydrogenase activity of Plasmodium
falciparum as an assessment of parasitemia. Am. J. Trop. .Med Hyg. 1993; 48: 205-210
Makler et al. Parasite lactate deshydrogenase as an assay for Plasmodium falciparum
drug sensitivity . Am. J. Trop. Med. Hyg. 1993.; 48: 739-741

15. Previous drug intake
Anticoagulant
Delay of culture
Freeze and culture
Volume per well
Parasitemia
Haematocrit
pH (modifies activity of
antimalarials)
CO2/O2 concentration
(modifies pH )
Serum or substitutes
Medium (no paba no folic
acid for antifolates; no iron
for iron chelators)
Hypoxanthine
Duration of the test
Solvent to prepare the stock
solutions
Drugs (salt)
Self-life of the plates and
conservation
Calculation method (linear
or non-linear regression;
background cpm)
Dr Ringwald. Workshop, Lyon, Déc 2005