Carlos Capela
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ÁCIDOS NUCLEICOS
ÁCIDOS NUCLEICOS..............................................
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B. METABOLISMO DOS NUCLEÓTIDOS ..................... 4
1. BIOSSÍNTESE DOS NU...
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C. BIOSSÍNTESE DOS ÁCIDOS NUCLEICOS E
TRANSFERÊNCIA DA INFORMAÇÃO GENÉTICA. ...
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A. INTRODUÇÃO
São as moléculas com a função de armazenamento e expressão da ...
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1.OS NUCLEÓTIDOS
São as unidades fundamentais dos ácidos nucleicos. Ligam-se...
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1.a.ii. AS PENTOSES
A adição de uma pentose a uma base nitrogenada produz um...
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1.a.iii.O FOSFATO
A adição de um ou mais radicais fosfato à pentose, através...
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2.O DNA
Está presente no núcleo das células eucarióticas, nas mitocôndrias, ...
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1.b.ii. ESTRUTURA SECUNDÁRIA – A DUPLA HÉLICE
Na dupla hélice do DNA, descri...
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Existem 3 formas estruturais de DNA:
A forma “B” – descrita por Watson e Cr...
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O DNA pode formar superenrolamento para a direita (negativo) ou para a esqu...
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segmentos de DNA “ligante” de aproximadamente 50 nucleótidos de comprimento...
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2.c.iii.NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO DO DNA
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O RNA é criado a partir de um molde de DNA e é utilizado na express...
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3.b.i. RNA RIBOSSÓMICO – RRNA
O rRNA é sintetizado no nucléolo, uma vez que...
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3.b.iii.RNA MENSAGEIRO – MRNA
É a molécula resultante da transcrição do DNA...
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B. METABOLISMO DOS
NUCLEÓTIDOS
1.BIOSSÍNTESE DOS NUCLEÓTIDOS
Embora os anim...
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1.a. Síntese dos nucleótidos com purinas
As purinas são formadas a partir d...
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A síntese faz-se por um grande número de etapas. O primeiro nucleótido a fo...
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3. Formação do ribótido de glicinamida, por combinação com a glicina.
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O IMP combinando-se com ácido aspártico forman...
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O GDP é então convertido em GTP com gasto de outro ATP.
GDP + ATP → GTP + A...
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1.b. Síntese dos nucleótidos com pirimidina
Os percursores do núcleo pirimí...
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1.b.i. SÍNTESE DO UMP
Contrariamente à síntese de novo de nucleótidos de pu...
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1.b.ii. SÍNTESE DE CMP
O UMP para se converter em CMP necessita de se trans...
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1.c. Formação dos desoxirribonucleótidos
Os desoxirribonucleótidos são form...
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Os coenzimas FAD, NAD+
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O NAD+
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são transportadores de equivalentes redutores. O NAD+
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A síntese de CoA faz-se a partir de uma outra vitamina do grupo...
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1.e. Inibidores
Actualmente, muitos fármacos são fabricados para inibirem u...
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1.e.ii. METOTREXATO
A biossíntese de purinas, bases heterocíclicas necessár...
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2.CATABOLISMO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
E NUCLEÓTIDOS
2.a. Catabolismo dos Ácido...
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2.b. Catabolismo das bases púricas
O catabolismo das purinas leva no homem ...
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Como o ácido úrico não é muito solúvel em meio aquoso, existem condições
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O catabolismo das pirimidinas, que o...
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3.a. Alterações do metabolismo das purinas
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3.a.ii. A SÍNDROME DE LESCH-NYHAN
A síndrome de Lesch-Nyhan é caracterizada...
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3.a.iii.IMUNODEFICIÊNCIA ASSOCIADA A DEFEITOS NA
DEGRADAÇÃO DE NUCLEÓTIDOS ...
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há um custo considerável envolvido. A terapia genica é a esperança para o f...
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3.b. Alterações do metabolismo das pirimidinas
Existem várias doenças devid...
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C. BIOSSÍNTESE DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS E TRANSFERÊNCIA
DA INFORMAÇÃO GENÉTICA....
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A replicação é um processo semi-conservativo, já que cada uma das novas
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Existem proteínas dotadas de grande afinidade para o DNA e especificidade p...
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A copia de DNA molde é então iniciada com a síntese de um fr...
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1.c. Terminação
A replicação da cadeia de DNA termina com a ligação do últi...
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2.TRANSCRIÇÃO DO DNA
A concentração de RNA celular está relacionada com a m...
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2.a. Iniciação
A copia de cada gene é iniciada pela RNA polimerase ao nível...
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2.d. Maturação do mRNA
A cadeia de RNA mensageiro neo-
sintetizada não pode...
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3.TRADUÇÃO – A SÍNTESE DE PROTEÍNAS
3.a. Introdução
A biossíntese de proteí...
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3.b. O código genético
O código genético dos seres vivos, hoje conhecido, f...
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• Linearidade – A leitura do código genético é feita sem sobreposições ou
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3.c. Componentes necessários à tradução
São vários, entre eles:
3.c.i. OS A...
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São formados por 2 subunidades, uma maior e outra menor, cujas característi...
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3.c.v. FACTORES PROTEICOS:
São factores de iniciação, elongação e libertaçã...
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3.d. Etapas da Biossíntese Proteica:
3.d.i. ACTIVAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS:
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3.d.ii. INICIAÇÃO DA CADEIA:
Depende da presença da subunidade ribossomal 4...
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d) O ribossoma move-se – às custas do GTP – na direcção 5’→3’ uma distância...
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Várias modificações podem ser impost...
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  1. 1. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 1 de 60 ÁCIDOS NUCLEICOS ÁCIDOS NUCLEICOS................................................ 1 A. INTRODUÇÃO ......................................................... 4 1. OS NUCLEÓTIDOS .........................................................4 1.a. Estrutura dos Nucleótidos....................................................... 4 1.A.I. AS BASES NITROGENADAS .............................................................. 4 1.A.II. AS PENTOSES ................................................................................... 4 1.A.III. O FOSFATO ...................................................................................... 4 1.b. Principais funções dos Nucleótidos........................................ 4 2. O DNA...........................................................................4 2.a. A Ligação Fosfodiéster ........................................................... 4 2.b. A Estrutura do DNA................................................................ 4 1.B.I. ESTRUTURA PRIMÁRIA .................................................................... 4 1.B.II. ESTRUTURA SECUNDÁRIA – A DUPLA HÉLICE ............................... 4 1.B.III. ESTRUTURA TERCIÁRIA................................................................... 4 2.c. Organização do Material Genético Eucariótico .................... 4 2.C.I. AS HISTONAS ................................................................................... 4 2.C.II. OS NUCLEOSSOMAS......................................................................... 4 2.C.III. NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO DO DNA................................................. 4 3. O RNA...........................................................................4 3.a. A Estrutura do RNA................................................................ 4 3.A.I. ESTRUTURA PRIMÁRIA.................................................................... 4 3.A.II. ESTRUTURA SECUNDÁRIA ............................................................... 4 3.A.III. ESTRUTURA TERCIÁRIA................................................................... 4 3.b. Tipos de RNA........................................................................... 4 3.B.I. RNA RIBOSSÓMICO – RRNA........................................................... 4 3.B.II. RNA DE TRANSFERÊNCIA – TRNA ................................................. 4 3.B.III. RNA MENSAGEIRO – MRNA........................................................... 4
  2. 2. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 2 de 60 B. METABOLISMO DOS NUCLEÓTIDOS ..................... 4 1. BIOSSÍNTESE DOS NUCLEÓTIDOS.................................4 1.a. Síntese dos nucleótidos com purinas...................................... 4 1.A.I. SÍNTESE DE IMP.............................................................................. 4 1.A.II. SÍNTESE DE AMP E GMP................................................................ 4 1.A.III. SÍNTESE DOS NUCLEÓSIDOS DI- E TRIFOSFATO PÚRICOS................ 4 1.A.IV. REGULAÇÃO DA SÍNTESE................................................................. 4 1.b. Síntese dos nucleótidos com pirimidina ................................. 4 1.B.I. SÍNTESE DO UMP ............................................................................ 4 1.B.II. SÍNTESE DE CMP............................................................................. 4 1.B.III. REGULAÇÃO DA SÍNTESE ................................................................ 4 1.c. Formação dos desoxirribonucleótidos ................................... 4 1.C.I. FORMAÇÃO DA DTMP..................................................................... 4 1.d. Síntese das Coenzimas Nucleotídicas..................................... 4 1.D.I. NAD+ E NADP+ ............................................................................... 4 1.D.II. FAD ................................................................................................. 4 1.D.III. COA ................................................................................................. 4 1.e. Inibidores................................................................................. 4 1.E.I. SULFAS............................................................................................. 4 1.E.II. METOTREXATO ............................................................................... 4 2. CATABOLISMO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS E NUCLEÓTIDOS........................................................................4 2.a. Catabolismo dos Ácidos Nucleicos, Nucleótidos e Nucleósidos ........................................................................................ 4 2.b. Catabolismo das bases púricas ............................................... 4 2.c. Catabolismo das bases pirimídicas......................................... 4 3. DOENÇAS.......................................................................4 3.a. Alterações do metabolismo das purinas ................................. 4 3.A.I. A GOTA............................................................................................ 4 3.A.II. A SÍNDROME DE LESCH-NYHAN ..................................................... 4 3.A.III. IMUNODEFICIÊNCIA ASSOCIADA A DEFEITOS NA DEGRADAÇÃO DE NUCLEÓTIDOS DE PURINA................................................................................ 4 3.b. Alterações do metabolismo das pirimidinas........................... 4 3.B.I. ACIDÚRIA ORÓTICA HEREDITÁRIA ................................................ 4
  3. 3. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 3 de 60 C. BIOSSÍNTESE DOS ÁCIDOS NUCLEICOS E TRANSFERÊNCIA DA INFORMAÇÃO GENÉTICA. .......... 4 1. REPLICAÇÃO DO DNA..................................................4 1.a. Iniciação .................................................................................. 4 1.b. Elongação................................................................................ 4 1.c. Terminação.............................................................................. 4 2. TRANSCRIÇÃO DO DNA................................................4 2.a. Iniciação .................................................................................. 4 2.b. Elongação................................................................................ 4 2.c. Terminação.............................................................................. 4 2.d. Maturação do mRNA ............................................................... 4 3. TRADUÇÃO – A SÍNTESE DE PROTEÍNAS .....................4 3.a. Introdução ............................................................................... 4 3.b. O código genético .................................................................... 4 3.B.I. CARACTERÍSTICAS DO CÓDIGO GENÉTICO..................................... 4 3.c. Componentes necessários à tradução..................................... 4 3.C.I. OS AMINOÁCIDOS: .......................................................................... 4 3.C.II. O RNA DE TRANSFERÊNCIA:.......................................................... 4 3.C.III. O RNA MENSAGEIRO:.................................................................... 4 3.C.IV. RIBOSSOMAS: .................................................................................. 4 3.C.V. FACTORES PROTEICOS: .................................................................. 4 3.C.VI. FONTES DE ENERGIA ....................................................................... 4 3.d. Etapas da Biossíntese Proteica:.............................................. 4 3.D.I. ACTIVAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS:.................................................... 4 3.D.II. INICIAÇÃO DA CADEIA:................................................................... 4 3.D.III. ELONGAÇÃO DA CADEIA:................................................................ 4 3.D.IV. TERMINAÇÃO DA CADEIA POLIPEPTÍDICA:.................................... 4 3.D.V. MODIFICAÇÕES PÓS-TRANSLACIONAIS ......................................... 4
  4. 4. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 4 de 60 A. INTRODUÇÃO São as moléculas com a função de armazenamento e expressão da informação genética. Existem basicamente 2 tipos de ácidos nucleicos: O Ácido Desoxirribonucleico – DNA O Ácido Ribonucleico – RNA Os ácidos nucleicos são macromoléculas formadas pela ligação tipo fosfodiéster entre 5 nucleótidos diferentes. Podem-se encontrar tanto na forma livre como associados a proteínas (histonas e protaminas). Cromossoma Genes Dupla Hélice de DNA Sequência reguladora IntrõesExões Transcrição do DNA Splicing do RNA Tradução RNA Proteína
  5. 5. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 5 de 60 1.OS NUCLEÓTIDOS São as unidades fundamentais dos ácidos nucleicos. Ligam-se uns aos outros através de ligações fosfodiéster, formando cadeias muito longas com milhões de resíduos de comprimento. Além de participarem da estrutura dos ácidos nucleicos, os nucleótidos actuam também como componentes na estrutura de coenzimas importantes no metabolismo oxidativo da célula, e como forma de energia química – ATP, por exemplo. Actuam ainda como activadores e inibidores importantes em várias vias do metabolismo intermediário da célula. 1.a. Estrutura dos Nucleótidos Os nucleótidos são moléculas formadas por: • Uma pentose; • Uma base nitrogenada; • Um ou mais grupos fosfato. Ao conjunto formado pela pentose e pela base azotada dá-se o nome de Nucleósido. 1.a.i. AS BASES NITROGENADAS Pertencem a 2 famílias de compostos, e são 5 no total: • Bases Púricas, ou Purinas (anel duplo): Adenina e Guanina; • Bases Pirimídicas, ou Pirimidinas (anel simples): Citosina, Timina e Uracilo. Tanto o DNA como o RNA possuem as mesmas bases púricas, e a citosina como base pirimídica. A timina existe apenas no DNA, e no RNA, é substituída pela uracilo – que possui um grupo metil a menos. Em alguns tipos de DNA virais e no RNA de transferência podem aparecer bases incomuns. As bases azotadas unem-se ao carbono 1 das pentoses por ligações covalentes.
  6. 6. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 6 de 60 1.a.ii. AS PENTOSES A adição de uma pentose a uma base nitrogenada produz um nucleósido. Os nucleósidos de A, C, G, T e U são denominados, respectivamente, Adenosina, Citosina, Guanosina, Timidina e Uridina. Se o açúcar em questão é a Ribose, temos um ribonucleósido, característico do RNA. Se o açúcar é a desoxirribose – 1 hidroxilo (-OH) a menos em C2 – temos um desoxirribonucleósido, característico do DNA. A ligação com a base nitrogenada ocorre sempre através do hidroxilo do carbono anomérico da pentose. DNA RNA
  7. 7. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 7 de 60 1.a.iii.O FOSFATO A adição de um ou mais radicais fosfato à pentose, através de uma ligação tipo éster com o hidroxilo do carbono 5 da mesma, dá origem aos Nucleótidos. Os grupos fosfato são responsáveis pelas cargas negativas dos nucleótidos e dos ácidos nucleicos. A adição do segundo ou terceiro grupo fosfato ocorre em sequência, dando origem aos nucleótidos di e trifosfatados. A função principal destes nucleótidos di e trifosfatados é armazenar energia. 1.b. Principais funções dos Nucleótidos • Metabolismo energético – os nucleótidos entram na constituição do ATP, que é a principal forma de energia química para as células. Este está envolvido na contracção muscular, no transporte activo e na manutenção de gradientes iónicos; • Unidades monoméricas dos Ácidos Nucleicos; • Mediadores fisiológicos – nucleósidos e nucleótidos servem como mediadores fisiológicos de processos metabólicos chave, como por exemplo, a adenosina é importante no controlo do fluxo sanguíneo; • Função de Percursor – alguns nucleótidos são percursores para a formação de cofactores; • Componente de Coenzimas – o AMP é um componente das coenzimas NAD+ , NADP+ , FAD, suas formas reduzidas, e coenzima A. • Intermediários activados – os nucleótidos também servem como transportadores de intermediários activados necessários para várias reacções. Por ex: a UDP-glicose é um intermediário chave para a síntese de glicogénio e de glicoproteínas; • Efectores Alostéricos – muitas das etapas reguladoras das vias metabólicas são controladas pelas concentrações intracelulares de nucleótidos.
  8. 8. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 8 de 60 2.O DNA Está presente no núcleo das células eucarióticas, nas mitocôndrias, nos cloroplastos, e no citosol das células procarióticas. Nas células germinativas e no óvulo fertilizado, dirige todo o desenvolvimento do organismo, a partir da informação contida na sua estrutura. É duplicado cada vez que a célula somática se divide. O DNA é um polidesoxirribonucleótido formado por milhares de nucleótidos ligados entre si através de ligações fosfodiéster 3’-5’. 2.a. A Ligação Fosfodiéster Ocorre entre o fosfato do carbono 5 da pentose de um nucleótido e o hidroxilo do carbono 3 da pentose do nucleótido seguinte. A cadeia resultante é bastante polar, e possui: • Uma extremidade 5’ Fosfato, do carbono 5 da pentose, livre; • Uma extremidade 3’ Hidroxilo, do carbono 3 da pentose, livre Por convenção, as bases de uma sequência são sempre descritas da extremidade 5’ para a extremidade 3’. As ligações fosfodiéster podem ser quebradas enzimaticamente por enzimas chamadas Nucleases, que se dividem em: • Endonucleases – quebram ligações no meio da molécula; • Exonucleases – quebram ligações nas extremidades da molécula. 2.b. A Estrutura do DNA 1.b.i. ESTRUTURA PRIMÁRIA A estrutura primária é a sequência de nucleótidos que o formam. A sequência das bases é característica de um ácido nucleico, pois é nela que reside a informação genética.
  9. 9. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 9 de 60 1.b.ii. ESTRUTURA SECUNDÁRIA – A DUPLA HÉLICE Na dupla hélice do DNA, descrita pela primeira vez por Watson e Crick, as cadeias da molécula dobram-se em torno de um eixo comum e de modo antiparalelo – a extremidade 5’ de uma cadeia está emparelhada com a extremidade 3’ da outra cadeia. No tipo mais comum de hélice – “B” – o esqueleto hidrofílico dos fosfatos e pentoses fica na parte externa, enquanto que as bases hidrofóbicas, fixadas a este esqueleto, ficam no lado interno da estrutura. Existe uma complementaridade de Bases entre as cadeias da molécula do DNA. Assim, temos sempre emparelhadas: • Adenina com Timina → A-T • Citosina com Guanina → C-G As bases mantém-se emparelhadas devido à formação de pontes de hidrogénio, 2 entre “A” e “T” e 3 entre “C” e “G”.
  10. 10. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 10 de 60 Existem 3 formas estruturais de DNA: A forma “B” – descrita por Watson e Crick em 1953 e já citada acima, é a forma mais comum; a hélice tem rotação para a direita, com 10 resíduos por volta e com planos de bases perpendiculares ao eixo helicoidal. A forma “A” – Obtida pela desidratação moderada da forma “B”, também possui rotação para a direita, mas possui 11 resíduos por volta e as bases estão num ângulo de 20 graus em relação ao eixo helicoidal. A forma “Z” – A hélice nesta forma possui rotação para a esquerda e contém cerca de 12 resíduos por volta. A transição entre as formas de DNA pode desempenhar um papel importante na regulação da expressão genética. 1.b.iii.ESTRUTURA TERCIÁRIA A molécula de DNA pode sofrer enrolamento no sentido da sua progressão e também dobras sobre si própria – embora de uma forma menos nítida do que as proteínas quando adquirem a estrutura terciária. Essas conformações designam-se por “supercoiling” que se poderá traduzir por sobre-enrolamento ou superenrolamento. A estrutura terciária do DNA encontra-se nos eucariotas, nos seus nucleossomas, situação em que o enrolamento se faz em torno das histonas.
  11. 11. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 11 de 60 O DNA pode formar superenrolamento para a direita (negativo) ou para a esquerda (positivo). O superenrolamento negativo comunica um “stress” torcional ao DNA que favorece a separação das cadeias. Nas células existem enzimas denominadas Topoisomerases que são capazes de conferir superenrolamento ao DNA (DNA-girase) e também de o desenrolar (Topoisomerase I). 2.c. Organização do Material Genético Eucariótico O DNA total de uma célula mede em média 1 metro de comprimento. Para que um volume tão grande de material genético esteja compreendido dentro do núcleo da célula, o DNA interage com um grande número de proteínas com o objectivo da sua compactação. Estas proteínas exercem funções importantes na organização e mobilização deste material genético 2.c.i. AS HISTONAS As histonas são pequenas proteínas básicas, ricas em lisina e arginina, e carregadas positivamente em pH fisiológico, às quais se associa a molécula do DNA. As suas cargas positivas, em associação com o catião Mg2+ , facilitam esta ligação com o esqueleto negativo do DNA e estabilizam o conjunto. Existem 5 classes de histonas: H1, H2, H2B, H3 e H4. 2.c.ii. OS NUCLEOSSOMAS São considerados as unidades estruturais dos cromossomas. São formados por 8 moléculas de histonas: 2 H2, 2 H2B, 2 H3 e 2 H4, formando um octâmero regular sobre o qual se enrola a dupla cadeia do DNA, cerca de 2 voltas (146 nucleótidos por nucleossoma). Os nucleossomas são ligados entre si por Nucleossoma
  12. 12. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 12 de 60 segmentos de DNA “ligante” de aproximadamente 50 nucleótidos de comprimento, formando os polinucleossomas, ou nucleofilamentos. Após vários níveis de organização espacial, ancorados por vários tipos de proteínas, chegamos à estrutura final dos cromossomas. A histona H1 não participa da estrutura dos nucleossomas, mas sim liga-se ao DNA “ligante” e participa do processo de compactação das estruturas, formando os solenóides.
  13. 13. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 13 de 60 2.c.iii.NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO DO DNA
  14. 14. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 14 de 60 3.O RNA O RNA é criado a partir de um molde de DNA e é utilizado na expressão da informação genética. A síntese de uma molécula de RNA a partir de um molde de DNA chama-se transcrição. Nesta transcrição, modificações podem ocorrer sobre a molécula de RNA transcrita, convertendo-a de uma cópia fiel numa cópia funcional do DNA. Em relação ao DNA, o RNA possui uracilo no lugar da timina na sequência de bases. A pentose do RNA é a Ribose. O RNA é formado por uma cadeia única, com eventual emparelhamento de bases intracadeia. A molécula do RNA é muito menor que a do DNA. 3.a. A Estrutura do RNA 3.a.i. ESTRUTURA PRIMÁRIA Tal como no DNA, a estrutura primária é a sequência de nucleótidos que o formam. 3.a.ii. ESTRUTURA SECUNDÁRIA Contrariamente ao que acontece com a molécula de DNA, o RNA é formado por uma única cadeia polinucleotídica. No entanto, esta cadeia simples pode, em determinadas zonas, dobrar-se sobre si própria, devido à formação de pontes de hidrogénio entre as bases complementares. 3.a.iii.ESTRUTURA TERCIÁRIA Além da estrutura secundária por pares de bases, as moléculas de RNA também formam outras pontes de Hidrogénio, gerando a estrutura terciária. 3.b. Tipos de RNA Existem 3 tipos fundamentais de RNA, cada um com características estruturais e funcionais próprias:
  15. 15. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 15 de 60 3.b.i. RNA RIBOSSÓMICO – RRNA O rRNA é sintetizado no nucléolo, uma vez que é nessa zona que se encontram os seus genes codificadores. Após a sua síntese vai agregar-se a proteínas específicas sintetizadas previamente no citoplasma, dando origem às ribonucleoproteinas que entram na constituição dos ribossomas, os organelos responsáveis pela síntese proteica. Corresponde a cerca de 80% do total de RNA da célula. 3.b.ii. RNA DE TRANSFERÊNCIA – TRNA É a menor molécula dos 3 tipos de RNA. Inclui na sua composição uma sequência de 3 bases designadas anticodão e tem como função estabelecer a correspondência entre os aminoácidos e os codões do mRNA, de modo a permitir a tradução da informação codificada no mRNA em proteínas. Possui um extenso emparelhamento de bases intracadeia, actuando no posicionamento dos aminoácidos na sequência prevista pelo código genético, no momento da síntese proteica. Está ligado de forma específica a cada um dos 20 aminoácidos encontrados nas proteínas (proteicos comuns). Corresponde a cerca de 15% do RNA total da célula. Estrutura secundária Estrutura terciária
  16. 16. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 16 de 60 3.b.iii.RNA MENSAGEIRO – MRNA É a molécula resultante da transcrição do DNA. Actua como transportador da informação genética do núcleo da célula eucariótica para o citosol, onde ocorrerá a biossíntese proteica, através da leitura de 3 bases – o codão. Corresponde a apenas 5% do total de RNA da célula
  17. 17. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 17 de 60 B. METABOLISMO DOS NUCLEÓTIDOS 1.BIOSSÍNTESE DOS NUCLEÓTIDOS Embora os animais ingiram ácidos nucleicos e consequentemente nucleótidos, nos seus alimentos, a sua sobrevivência não depende da absorção e utilização desses compostos, uma vez que o Homem e a maioria dos vertebrados podem sintetizar de novo nucleótidos de purina e pirimidina. Também conseguimos reutilizar aquelas de que já dispomos no nosso organismo, e que assim sofrem um “turnover” elevado. Existe um grande turnover do RNA e dos nucleótidos, mas não de DNA. O reaproveitamento de purinas, pirimidinas e nucleósidos envolve a sua conversão a nucleótidos, evitando assim à célula um gasto desnecessário de energia. Por outro lado, existe uma interconversão de nucleótidos de forma a manter uma concentração apropriada de percursores para a síntese de RNA, DNA e outros intermediários nucleotídicos. A síntese de novo tem como fontes: átomos de carbono, azoto e oxigénio, os aminoácidos glutamina, glicina e ácido aspártico, o CO2, a ribose-5-fosfato e o amoníaco (NH4). A síntese de novo de nucleótidos implica a síntese das pentoses (pela vias das pentoses fosfato) e das bases azotadas. As purinas e pirimidinas que não são reutilizadas são catabolisadas e os produtos resultantes excretados. Nos primatas, o produto de excreção final é o ácido úrico, enquanto que noutros mamíferos este é catalisado em alantoína.
  18. 18. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 18 de 60 1.a. Síntese dos nucleótidos com purinas As purinas são formadas a partir dos seguintes percursores: 1. Glicina – C4, C5 e N7. 2. Formilo (combinado ao THF) – C2 e C8. 3. Glutamina – fornece o N para os N3 e N9. 4. Ácido Aspártico – N1. 5. CO2 – C6.
  19. 19. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 19 de 60 A síntese faz-se por um grande número de etapas. O primeiro nucleótido a formar- se é o IMP, formando-se os outros a partir dele. 1.a.i. SÍNTESE DE IMP As principais etapas são as seguintes: 1. Formação da forma activada da ribose – o 5-fosforribosil-1-pirofosfato (PRPP) – por combinação da ribose-5-fosfato com o ATP. Esta reacção catalisada pela Ribose-5-fosfato Pirofosfocinase, é inibida pelo ADP, GDP, AMP e ácido 2,3-Bisfosfoglicérico. O ião Mg2+ e o grupo fosfato actuam como activadores. 2. Formação da 5-fosforribosilamina, sendo o NH2 cedido pela glutamina.
  20. 20. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 20 de 60 3. Formação do ribótido de glicinamida, por combinação com a glicina. 4. Transferência de um carbono, formando-se o ribótido da formilglicinamida. O formilo é transportado pelo ácido tetrahidrofólico (THF). 5. Amidinação pela glutamina, formando-se o ribótido da formilglicinamidina. A reacção faz-se na presença de ATP. 6. Ciclização em ribótido do 5-amino-amidazol, com gasto de ATP. 7. Carboxilação em ribótido do ácido 5-amino-imidazol carboxílico. 8. Formação de uma amida por combinação com o ácido aspártico, formando- se o ribótido do 5-amino-4-imidazol-succino carboximida. 9. Transformação em ribótido da 5-aminoimidazol-carboxamida por perda de ácido fumárico. 10. Formilação em ribótido da formil aminoimidazol-carboxamida e desidratação deste em IMP.
  21. 21. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 21 de 60 1.a.ii. SÍNTESE DE AMP E GMP O IMP combinando-se com ácido aspártico formando ácido adenilo-succínico. A energia para a síntese é fornecida pela hidrólise do GTP. O ácido adenilo-succínico hidrolisa-se, em seguida, em ácido fumárico e AMP. Para a síntese do GMP terá que ser introduzido um átomo de azoto no núcleo de purina do IMP. O IMP é, inicialmente, oxidado em XMP e, depois, este é aminado pela glutamina em GMP. 1.a.iii.SÍNTESE DOS NUCLEÓSIDOS DI- E TRIFOSFATO PÚRICOS Os mononucleótidos AMP e GMP são convertidos em nucleósidos difosfato (ADP e GDP) pela transferência de um grupo fosfato de ATP. GMP/AMP + ATP → GDP/ADP + ADP Nucleósido-5-monofosfato cinase
  22. 22. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 22 de 60 O GDP é então convertido em GTP com gasto de outro ATP. GDP + ATP → GTP + ADP Nucleósido-5-difosfato cinase A conversão do ADP em ATP é feita maioritariamente por fosforilação oxidativa, mas também por reacções de glicólise e ciclo de Krebs. O ATP e o GTP são os percursores púricos necessários para a síntese dos ácidos nucleicos. 1.a.iv. REGULAÇÃO DA SÍNTESE A síntese de nucleótidos de purina é controlada a vários níveis: • Os níveis de PRPP são regulados pelo AMP, GMP e IMP, do mesmo modo que a conversão do PRPP em 5-fosforribosilamina. • O AMP e GMP regulam a sua própria síntese a partir do IMP, ou seja, uma elevada concentração de AMP inibe a sua síntese, e uma concentração elevada de GMP inibe a do GMP. ´
  23. 23. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 23 de 60 1.b. Síntese dos nucleótidos com pirimidina Os percursores do núcleo pirimídico são C4, C5, C6 e N1 do ácido aspártico, N3 da glutamina e C2 do CO2.
  24. 24. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 24 de 60 1.b.i. SÍNTESE DO UMP Contrariamente à síntese de novo de nucleótidos de purina, este processo é mais simples devido à estrutura anelar simples das pirimidinas. 1. Formação do Carbamil-fosfato (uma forma activada de azoto) através da condensação de CO2, amoníaco e ATP, numa reacção catalisada pela Carbamil fosfato sintetase II, tendo como coenzima a Biotina. 2. O Carbamil-fosfato, reage com o ácido aspártico formando o ácido carbamil- aspártico. 3. Este ácido desidrata-se dando ácido di-hidro-orótico que é desidrogenado por um enzima com NAD+ dando ácido orótico. 4. O ácido orótico recebe a ribose do PRPP, dando ácido orotidílico. 5. Seguidamente, o ácido orotidílico descarboxila-se em UMP.
  25. 25. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 25 de 60 1.b.ii. SÍNTESE DE CMP O UMP para se converter em CMP necessita de se transformar, primeiro, em UTP (pela acção de cinases). Este, aminando-se pela glutamina na presença de ATP, origina o CTP. A formação e a presença de TMP é bastante rara. 1.b.iii.REGULAÇÃO DA SÍNTESE Devido, ao seu papel de regulador alostérico da Carbamil fosfato sintetase II, o CTP intervêm decisivamente no controlo do metabolismo dos nucleótidos pirimídicos.
  26. 26. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 26 de 60 1.c. Formação dos desoxirribonucleótidos Os desoxirribonucleótidos são formados a partir da redução do anel de ribose pela Ribonucleósido difosfato redutase que catalisa a redução dos ribonucleótidos difosfatados. Esta enzima utiliza como dador de hidrogénio na redução da ribose uma proteína, a Tioredoxina, com SH quando reduzida e S-S quando oxidada. A tioredoxina oxidada passa a reduzida pela acção do NADPH, reacção catalisada pela tioredoxina redutase. Desta forma, há uma manutenção de desoxirribonucleótidos necessários para a síntese de DNA. ADP, GDP, CDP e UDP são catabolisados respectivamente em dADP, dGDP, dCDP e dUDP. 1.c.i. FORMAÇÃO DA DTMP O uracilo não é componente do DNA porque este contêm timina (uracilo metilado). O dUMP é metilado pelo N5-N10-metileno-THF que actua como dador de electrões e de carbono, reacção catalisada pela Timidilato sintetase.
  27. 27. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 27 de 60
  28. 28. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 28 de 60 1.d. Síntese das Coenzimas Nucleotídicas Os coenzimas FAD, NAD+ , NADP+ e Coenzima A têm uma base nucleotídica. Cada um destes coenzimas tem um resíduo de AMP como parte da molécula que, no entanto, não está directamente envolvido na parte funcional da molécula. 1.d.i. NAD+ E NADP+ A síntese de NAD+ e NADP+ inicia-se a partir da condensação de Nicotinamida com PRPP. A nicotinamida ou é ingerida ou deriva do Triptofano. A carência de Nicotinamida provoca o Pelagra. O PRPP reage com a nicotinamida para formar o nicotinamida-mononucleótido que, recebendo um AMP do ATP, se transforma em NAD+ . Este pode ser fosforilado em NADP+ , pela NAD+ quinase.
  29. 29. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 29 de 60 O NAD+ e o NADP+ são transportadores de equivalentes redutores. O NAD+ é uma coenzima nas reacções (geralmente catabólicas) em que os equivalentes redutores são utilizados na síntese de ATP e actua como aceitador de 2 e- e um protão H+ , provenientes de um dador ou substrato que é oxidado. O NADP+ é utilizado em reacções (geralmente anabólicas) em que os equivalentes redutores serão aproveitados em reacções de síntese e actua de forma análoga ao NAD+ . 1.d.ii. FAD A síntese do FAD faz-se a partir da vitamina B2 (Riboflavina) que sofre 2 fosforilações pelo ATP.
  30. 30. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 30 de 60 1.d.iii.COA A síntese de CoA faz-se a partir de uma outra vitamina do grupo B, o ácido pantoténico.
  31. 31. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 31 de 60 1.e. Inibidores Actualmente, muitos fármacos são fabricados para inibirem uma enzima específica, numa via metabólica. Esta aplicação é mais facilmente observada com fármacos antivirais, antibacterianas e antitumorais, que são administradas ao paciente, sob condições de toxicidade limitada. Tal toxicidade é, frequentemente, inevitável porque, existem poucas vias metabólicas críticas que são inerentes/particulares ao tumor, ao vírus ou à bactéria. Assim, os fármacos que destroem estes organismos, frequentemente matarão as células hospedeiras. Uma característica de que se pode tirar vantagem é o tempo comparativamente mais curto de geração, dos organismos indesejáveis. Eles são muito mais sensíveis aos antimetabólitos e, em particular, àqueles que inibem as enzimas envolvidos na replicação. Antimetabólitos são compostos com alguma diferença estrutural do substrato natural. Como exemplo temos: 1.e.i. SULFAS A quimioterapia moderna teve o seu início com compostos de fórmula geral R-SO2- NHR’. A Sulfanilamida, o membro mais simples da classe, é um agente anti-bacteriano porque compete com o ácido p-aminobenzóico (PABA), que é necessário para o crescimento bacteriano. A bactéria não pode absorver ácido fólico (uma vitamina essencial para o hospedeiro), por isso deve sintetizá-la. Como a sulfanilamida é um análogo estrutural do ácido p-aminobenzóico, a dihidropteroato sintetase bacteriana é levada a fazer um intermediário contendo sulfanilamida, que não pode ser convertida a ácido fólico. Assim, a bactéria é privada de ácido fólico necessário para o crescimento e divisão. Como o homem requer ácido fólico da dieta diária, a sulfanilamida não é perigosa nas doses que destroem a bactéria.
  32. 32. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 32 de 60 1.e.ii. METOTREXATO A biossíntese de purinas, bases heterocíclicas necessárias para a síntese de RNA e DNA, requer ácido fólico, que serve como uma coenzima na transferência de unidades de carbono de vários aminoácidos dadores. Metotrexato (ácido 4-amino-N10-metil fólico) é um análogo estrutural do ácido fólico. O seu mecanismo de acção é baseado na competição com o dihidrofolato (DHF) pela dihidrofolato redutase. Este liga-se 1000 vezes mais fortemente que o substrato natural e é um potente inibidor competitivo da enzima. A síntese de TMP para na presença de metotrexato devido à falha na reacção de transferência de um carbono (a Timidilato sintetase é particularmente sensível à presença de N5-N10-metileno-THF). Como a divisão celular depende de TMP e de outros nucleótidos, a célula não se pode multiplicar. Um problema é que as células humanas que se dividem rapidamente, como as da medula óssea e da mucosa intestinal, são sensíveis à droga pelas mesmas razões. Também, o uso prolongado leva a uma amplificação do gene para a dihidrofolato redutase, com níveis aumentados da enzima e crescimento preferencial de células resistentes ao metotrexato. Aminopterina (ácido 4-amino fólico) funciona de maneira similar ao metotrexato, uma vez que é estruturalmente análoga ao ácido fólico, inibindo, assim, a dihidrofolato redutase.
  33. 33. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 33 de 60 2.CATABOLISMO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS E NUCLEÓTIDOS 2.a. Catabolismo dos Ácidos Nucleicos, Nucleótidos e Nucleósidos As Nucleoproteínas são, primeiramente, cindidas por proteases em proteínas e ácidos nucleicos. A digestão de ácidos nucleicos e o seu catabolismo tecidular faz-se por vias relativamente semelhantes. O processo inicial é a despolimerização por nucleases em nucleótidos. Estas são ribonucleases ou desoxirribonucleases. Os nucleótidos resultantes são desfosforilados por nucleotidases. As nucleotidases cindem os nucleótidos formados por fosforólise, em pentose-1-fosfato e respectiva base.
  34. 34. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 34 de 60 2.b. Catabolismo das bases púricas O catabolismo das purinas leva no homem à formação de ácido úrico. O catabolismo faz-se por desaminação das bases púricas livres ou das bases integradas em nucleótidos ou nucleósidos, seguindo-se uma oxidação dos produtos formados. Por desaminação, os nucleótidos de adenina origina a hipoxantina, enquanto os nucleótidos de guanina a xantina. A hipoxantina é oxidada a xantina, e esta, pela xantina oxidase, oxida-se a ácido úrico, um produto final exclusivo da degradação da purina em seres humanos. A xantina oxidase é uma enzima que tem, como, coenzima, o FAD e contém ferro e molibdénio, e requer oxigénio como substrato.
  35. 35. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 35 de 60 Como o ácido úrico não é muito solúvel em meio aquoso, existem condições clínicas nas quais níveis elevados de ácido úrico resultam em depósito de cristais de urato de sódio, principalmente nas articulações. Na maior parte das espécies, o ácido úrico não é o produto final da excreção do metabolismo púrico sendo descarboxilado oxidativamente em alantoína pela acção da uricase. Esta enzima encontra-se no fígado e rins dos mamíferos mas não se encontra no Homem e nos primatas.
  36. 36. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 36 de 60 2.c. Catabolismo das bases pirimídicas O catabolismo das pirimidinas, que ocorre principalmente no fígado, leva a produtos finais altamente solúveis, o que contrasta com a produção a partir das purinas de ácido úrico e de urato de sódio que são pouco solúveis. No que se refere à citosina e uracilo, estes são catabolisados em β-alanina, a qual pode ser eliminada pela urina, incorporada no ácido pantoténico ou catabolisada a ácido acético. No que se refere à timina esta é catabolisada em Ácido β-aminoisobutírico, que na maior parte vai-se transformar em ureia, além disso origina algum ácido propiónico.
  37. 37. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 37 de 60 3.DOENÇAS 3.a. Alterações do metabolismo das purinas Existem várias doenças associadas a alterações no metabolismo dos nucleótidos de purina entre as quais se destacam: a Gota, a síndrome de Lesh-Nyan e a Imunodeficiência. 3.a.i. A GOTA A Gota é caracterizada pelos níveis elevados de ácido úrico no sangue e urina devido a várias anormalidades metabólicas que levam à produção aumentada de nucleótidos púricos pela via de novo. A maioria dos sintomas clínicos resulta da baixa solubilidade do ácido úrico em ambientes aquosos. Cristais de urato de sódio depositam-se nas articulações (cartilagem e membranas sinoviais) e no tecido renal intersticial. Estudos de pacientes com gota demonstraram que uma heterogeneidade e multiplicidade de defeitos são a causa da produção aumentada de ácido úrico. Em alguns casos, os defeitos bioquímicos ainda não foram determinados. Exemplos de defeitos bioquímicos que resultam numa síntese aumentada de nucleótidos incluem os seguintes: 1. Actividade aumentada da PRPP sintetase, que resulta num aumento dos níveis intracelulares de PRPP. O PRPP, age como um efector alostérico positivo da glutamina-PRPP amidotransferase, levando ao fluxo aumentado da via de novo, uma vez que a actividade da etapa limitante é acentuadamente aumentada; 2. Diminuição parcial da actividade da HGPRTase, tem duas vertentes com respeito à via de novo para a síntese de nucleótidos de purina. Primeiro, como há diminuição na recuperação de hipoxantina e guanina, o PRPP não é consumido na reacção catalisada pela HGPRTase. O PRPP pode activar a glutamina-PRPP amidotransferase. Segundo, com a diminuição da recuperação de hipoxantina e guanina, IMP e GMP não são formados por essa via, assim, a regulação da etapa da glutamina-PRPP amidotransferase por IMP e GMP como efectores alostéricos negativos fica comprometida.
  38. 38. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 38 de 60 3. Deficiências da glicose-6-fosfatase. Em pacientes que tem deficiência de glicose-6-fosfatase (doença de von Gierke e doença de armazenamento de glicogénio tipo I) também ocorre, frequentemente, hiperuricémia e gota. A perda da actividade da glicose-6-fosfatase resulta na acumulação de glicose-6- fosfato (principalmente nos hepatócitos), sendo posteriormente desviada para a via das pentoses fosfato, no que resulta um aumento de ribose-5-fosfato e consequentemente o nível de PRPP intracelular é aumentado. O PRPP é um efector alostérico positivo da glutamina-PRPP amidotransferase. Estes exemplos demonstram que factores que aumentam a actividade da etapa limitante na síntese de novo de nucleótidos de purina levam a um aumento da síntese e degradação a ácido úrico. Existem diferentes abordagens para o tratamento da gota que incluem colchicina, drogas anti-hiperuricémicas e alopurinol (um análogo da hipoxantina). O alopurinol é um inibidor eficiente da xantina oxidase que o converte em oxipurinol, que, por sua vez, se liga fortemente à enzima inactivando-a, resultando uma diminuição dos níveis de ácido úrico. Em pacientes que não possuem deficiência na HGRTPase, o tratamento com alopurinol inibe a xantina oxidase, aumentando, assim, as concentrações de hipoxantina e xantina. Essas bases púricas são, então, recuperadas para formar IMP e XMP. Estas reacções consomem PRPP e geram inibidores da glutamina-PRPP amidotransferase. O efeito global do alopurinol é a diminuição quer da formação de ácido úrico quer da síntese de novo de nucleótidos de purina.
  39. 39. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 39 de 60 3.a.ii. A SÍNDROME DE LESCH-NYHAN A síndrome de Lesch-Nyhan é caracterizada clinicamente por hiperuricémia, produção excessiva de ácido úrico e problemas neurológicos, que podem incluir espasticidade, retardo mental e auto-mutilação. Esta doença está associada a uma deficiência severa ou total da actividade da HGPRTase. O gene para a HGPRTase está no cromossoma X, assim, a deficiência é virtualmente limitada a homens, sendo as mulheres portadoras. O papel da HGPRTase é catalisar reacções nas quais hipoxantina e guanina são convertidas a nucleótidos. Assim, a hipoxantina e guanina não são recuperadas, levando ao aumento intracelular de PRPP e diminuição dos níveis de IMP ou GMP. Ambos os factores promovem a síntese de novo de nucleótidos de purina, mas sem a regulação apropriada da via. Ainda não está compreendido porque é que um defeito severo na via de recuperação leva a problemas neurológicos? Argumenta-se que os produtos da degradação das purinas (hipoxantina, xantina e ácido úrico) podem não ser tóxicos para o sistema nervoso central (SNC). No entanto, é possível que esses metabólitos sejam tóxicos para o SNC em desenvolvimento ou que a falta dessa enzima leve a um desequilíbrio nas concentrações de nucleótidos de purina em épocas críticas de desenvolvimento. Se a actividade da IMP desidrogenase no cérebro fosse extremamente baixa, a falta de HGPRTase poderia levar ao decréscimo dos níveis intracelulares de GTP devido ao decréscimo da recuperação de guanina. Como o GTP é percursor da tetrabiopterina, um cofactor necessário para a biossíntese de neurotransmissores; e é necessário em outras funções como a transdução de sinal através de proteínas-G e na síntese proteica; baixos níveis de GTP durante o desenvolvimento poderiam ser o factor desencadeador das manifestações neurológicas observadas. Tratamento de pacientes com alopurinol diminui a quantidade de ácido úrico formado, aliviando alguns dos problemas causados pelos depósitos de urato de sódio. Entretanto, como os pacientes com Lesch-Nyhan tem uma redução acentuada na actividade da HGPRTase, a hipoxantina e a guanina não são recuperadas, o PRPP não é consumido e, consequentemente a síntese de novo de nucleótidos de purina não é interrompida. Não existe tratamento para os problemas neurológicos. Estes pacientes, geralmente, morrem de insuficiência renal, resultante dos elevados depósitos de urato de sódio.
  40. 40. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 40 de 60 3.a.iii.IMUNODEFICIÊNCIA ASSOCIADA A DEFEITOS NA DEGRADAÇÃO DE NUCLEÓTIDOS DE PURINA Duas doenças distintas com imunodeficiência são associadas a defeitos na adenosina desaminase (ADA) e purina nucleósido fosforilase (PNP), respectivamente. Estas enzimas estão envolvidas nas vias de degradação que levam à formação de ácido úrico. Adenosina e desoxiadenosina são os substratos para a ADA, enquanto os substratos para a PNP são a inosina, guanosina, desoxiinosina e desoxiguanosina. Uma deficiência da ADA é associada a uma imunodeficiência severa combinada, envolvendo as funções dos linfócitos T e B. Deficiência da PNP é associada a uma imunodeficiência envolvendo as funções dos linfócitos T, com poucos efeitos sobre as funções dos linfócitos B. Em ambos os casos desconhece-se o mecanismo através do qual a falta destas enzimas leva à disfunção imunológica. No entanto, em pacientes com a falta de ADA, as concentrações intracelulares de dATP e S-Adenosil-Homocisteína estão grandemente aumentadas. Várias hipóteses foram levantadas para explicar as consequências bioquímicas da falta de ADA: 1. Altos níveis de dATP inibem a actividade da ribonucleótido redutase e, como consequência inibem a síntese de DNA; 2. A desoxiadenosina inactiva a S-adenosil-homocisteína hidrolase, levando à diminuição da quantidade de S-adenosilmetionina necessária para a metilação de bases do RNA e do DNA; 3. Níveis aumentados de adenosina resultam num aumento de cAMP. É possível que cada um destes mecanismos contribua para o efeito total sobre a disfunção imunológica. No entanto, não existe uma explicação adequada para a especificidade dos efeitos somente sobre os linfócitos B e T. Tratamento de crianças com deficiência de ADA, inclui transfusão de sangue, transplantes de medula óssea, terapia de reposição da enzima com ADA-polietileno glicol (ADA-PEG) e, mais recentemente, terapia genica. Cada um dos tratamentos tem vantagens e desvantagens. Transfusões sanguíneas produzem problemas de “excesso de ferro” e segurança da fonte. Transplante da medula óssea, embora seja curativo, requer um doador compatível. A terapia com reposição da enzima com ADA-PEG tem sido até ao momento o tratamento mais bem sucedido, mas requer monitoriamento constante e injecções frequentes de ADA-PEG e
  41. 41. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 41 de 60 há um custo considerável envolvido. A terapia genica é a esperança para o futuro, consiste na transferência do gene ADA para células com deficiência de ADA.
  42. 42. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 42 de 60 3.b. Alterações do metabolismo das pirimidinas Existem várias doenças devidas a alterações no metabolismo dos nucleótidos de pirimidina, entre os quais se destaca a Acidúria Orótica Hereditária. Contudo, as anormalidades clinicamente detectáveis não são muito frequentes, ao contrário do que acontece com as purinas, pelo facto dos produtos de catabolismo serem muito hidrossolúveis. 3.b.i. ACIDÚRIA ORÓTICA HEREDITÁRIA Resulta de um defeito na síntese de novo de nucleótidos de pirimidina. Esta doença genética é caracterizada por anemia severa, retardamento no crescimento e elevados níveis de excreção de ácido orótico. A base bioquímica para a acidúria orótica é um defeito numa ou ambas actividades (orotato fosforribosiltransferase ou OMP descarboxilase) associadas à UMP sintetase, uma proteína bifuncional. É uma doença muito rara (somente 15 pacientes são conhecidos), mas a compreensão das bases metabólicas dessa doença levaram a um tratamento bem sucedido. Os pacientes recebem uridina, que leva não somente à reversão do problema hematolágico, mas também à diminuição da formação de ácido orótico. A uridina é captada pelas células e convertida, pela uridina fosfotransferase, a UMP, que é convertido a UDP e, então, a UTP. O UTP formado a partir da uridina exógena, por sua vez, inibe a carbamil-fosfato sintetase II, a principal etapa reguladora da via de novo. Como resultado, o ácido orótico produzido através da via de novo é acentuadamente diminuído para níveis essencialmente normais. UTP também é substrato para a síntese de CTP. De facto, a uridina exógena desvia o metabolismo da UMP sintetase deficiente e fornece, para as células, UTP e CTP necessários para a síntese de ácidos nucleicos e outras funções celulares. O tratamento bem sucedido da acidúria orótica hereditária com uridina fornece dados, in vivo, sobre a importância da etapa da Carbamil-fosfato sintetase II, como um ponto de regulação da síntese de nucleótidos de pirimidina no homem.
  43. 43. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 43 de 60 C. BIOSSÍNTESE DOS ÁCIDOS NUCLEICOS E TRANSFERÊNCIA DA INFORMAÇÃO GENÉTICA. 1.REPLICAÇÃO DO DNA O DNA genómico de cada célula contêm em si a capacidade de se auto-replicar, resultando a formação de 2 moléculas filhas rigorosamente idênticas à molécula original. De facto, a replicação do DNA corresponde à copia integral de cada uma das cadeias constituintes do genoma da célula original através da polimerização ordenada dos nucleótidos em obediência à regra de complementaridade de bases que desta forma conduz à produção das 2 moléculas filhas. A polimerização dá-se a partir dos quatro percursores de DNA que são os nucleósidos trifosfato de desoxirribose. A reacção de polimerização dos percursores consiste no ataque nucleofílico do fosfato ligado ao carbono 5’ da respectiva pentose ao grupo hidroxilo em posição 3’ do nucleótido imediatamente precedente, dando origem à formação de ligações fosfodiéster que se vão estabelecendo sucessivamente entre os resíduos que constituem os elos da cadeia polinucleotídica. Em cada uma destas reacções é libertado um grupo pirofosfato formado por 2 fosfatos. Esta reacção é catalisada pelas DNA polimerases (enzimas de Kornberg) que, embora variando entre si, apresentam diversas propriedades comuns, nomeadamente: • Utilizam como percursores desoxirribonucleósidos trifosfatados; • Dependem do ião Mg2+ para a sua actividade; • Necessitam de um molde de DNA; • Catalisam a polimerização ordenada dos percursores, de forma sequencial e unidireccional, já que a reacção se processa exclusivamente na direcção 5’→3’.
  44. 44. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 44 de 60 A replicação é um processo semi-conservativo, já que cada uma das novas moléculas resultantes deste processo é constituído por uma cadeia proveniente da molécula original de DNA molde e por uma cadeia complementar e anti-paralela neosintetizada. A replicação inicia-se num único sítio bem definido da molécula, o sítio de iniciação da replicação, designado por origem. As 2 cadeias do DNA são copiadas em paralelo e de forma simultânea, até ao ponto de terminação da replicação, também este correspondendo a uma região bem definida do genoma. Na replicação ou duplicação distinguem-se 3 etapas: iniciação, elongação e terminação. 1.a. Iniciação Nos organismos superiores existem, em geral, múltiplos sítios de iniciação da replicação, ou origens, de modo que o DNA nuclear seja, completamente duplicado no período correspondente à fase de síntese do ciclo celular (6-8 horas). Cada unidade de replicação é designada por replicão.
  45. 45. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 45 de 60 Existem proteínas dotadas de grande afinidade para o DNA e especificidade para as sequências características de cada origem, que determinam a iniciação da replicação sendo por isso designada por primers. O primer é um fragmento de RNA catalisado por uma RNA polimerase específica, designada por Primase. Este facto é bastante lógico, já que o RNA pode ser sintetizado sem um iniciador, enquanto a síntese do DNA o requer. O primer de RNA e as moléculas de proteína da forquilha de replicação constituem o primossoma. A Girase e a Helicase são duas enzimas que abrem caminho. Estas 2 enzimas preparam a molécula de DNA para a replicação: • A DNA-girase vai introduzir um ponto de torção logo adiante da progressão da bifurcação. Trata-se de uma Topoisomerase – estas enzimas, essenciais no metabolismo do DNA, não necessitam de um factor para fornecer energia, o que significa que a reacção intermediária conserva a energia da ligação fosfodiéster; • A Helicase, uma enzima que destabiliza a hélice por ruptura das pontes de hidrogénio, liga-se à cadeia de DNA na forquilha de replicação, e promove o desenrolamento à custa de energia fornecida pelo ATP. As regiões monocatenárias expostas do DNA molde são estabilizadas por uma proteína específica – proteína de ligação ao DNA ou “binding protein”. É este complexo (DNA monocatenário e proteína de ligação) que constitui o substrato para a DNA polimerase. Replicão Topoisomerase Helicase Binding proteins DNA Polimerase Ligase Primossoma Primase Cadeia leading Cadeia lagging
  46. 46. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 46 de 60 1.b. Elongação A copia de DNA molde é então iniciada com a síntese de um fragmento de RNA catalisada pela primase. O fragmento de RNA sintetizado vai ser o iniciador, sendo a cadeia polinucleotídica sintetizada a partir do grupo 3’ OH do ultimo ribonucleótido do primer, ao qual se vêm ligar o resíduo 5’ fosfato do primeiro desoxirribonucleótido da cadeia de DNA que será elongada por cópia do molde. Esta reacção catalisada pela DNA polimerase que, nesta fase, desloca a primase do sistema. Após o inicio da síntese da cadeia de DNA, estas sequências iniciadoras de RNA são removidas pela DNA polimerase e substituídas por desoxirribonucleótidos. O processo dá-se simultaneamente sobre as duas cadeias molde do DNA, afastadas uma da outra. Uma dessas cadeias oferece um molde, cuja orientação 3’→5’ é propícia ao crescimento da neocadeia na direcção 5’→3’ por polimerização sequencial dos nucleósidos trifosfato, denominando-se de cadeia “leading” ou condutora, por dirigir o processo de replicação. Aqui a replicação é contínua. Na cadeia orientada 5’→3’, denominada cadeia “lagging” ou atrasada, o processo de replicação é mais complexo, uma vez que é iniciado apenas à mediada que essa cadeia vai sendo libertada pelo próprio processo de cópia da cadeia condutora. Isto deve-se ao facto da DNA polimerase actuar apenas em sentido 5’→3’. Assim a replicação da cadeia atrasada resulta da adição de pequenos fragmentos sintetizados no sentido 5’→3’, denominados fragmentos de Okazaki, em homenagem ao seu descobridor. A cada fragmento de Okazaki corresponde um primer diferente que será depois removido e substituído por DNA, por acção da DNA polimerase. Esta enzima funciona como uma enzima de reparação das cadeias de DNA. O crescimento simultâneo das duas cadeias neosintetizadas vai, assim, progredindo, obrigando o afastamento das duas cadeias de DNA molde, designando-se por forquilha de replicação o ponto de progressão do fenómeno.
  47. 47. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 47 de 60 1.c. Terminação A replicação da cadeia de DNA termina com a ligação do último desoxirribonucleósido trifosfato à cadeia neosintetizada. A terminação, distinta da reacção de condensação catalisada pelas DNA polimerases, é catalisada por enzimas designadas por DNA ligases. É importante ainda referir que esta terminação é condicionada pelo factor ρ, que corresponde a um tripleto de bases, que dá a informação de que a replicação está concluída.
  48. 48. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 48 de 60 2.TRANSCRIÇÃO DO DNA A concentração de RNA celular está relacionada com a maior actividade metabólica do tecido em causa. Os RNAs existem nas células exclusivamente como subprodutos directos dos genes. Eles são sempre sintetizados por cópia de regiões específicas e bem delimitadas do DNA, que constitui o genoma de cada espécie, obedecendo a sua síntese ao princípio da complementaridade de bases. Este fenómeno, em que a informação contida em segmentos do DNA genómico é transferida para moléculas da mesma natureza, que reflectem a própria sequência nucleotídica dos genes designa-se por Transcrição. Este consiste essencialmente na polimerização orientada e sequencial dos percursores de RNA que são os nucleósidos trifosfato de ribose. A sequência de ribonucleótidos numa molécula de RNA é complementar à sequência de desoxirribonucleótidos de uma das cadeias da molécula de DNA. A cadeia que é transcrita para a molécula de RNA é denominada cadeia molde de DNA ou cadeia -. A outra cadeia é frequentemente referida como cadeia codificadora ou cadeia +. Ela é assim chamada porque apenas difere do RNA na medida em que neste a timina é substituída pelo uracilo. A transcrição dos genes processa-se sob a acção de enzimas designadas por RNA polimerases, dependentes do DNA, que catalisam a condensação orientada e sequencial dos ribonucleótidos por cópia da cadeia molde de DNA, baseada na complementaridade estrutural das bases. A reacção ocorre entre o grupo 3’ OH do resíduo de ribose do 1º nucleósido trifosfato percursor e o grupo 5’ fosfato do nucleósido trifosfato seguinte, com a formação de uma ligação fosfodiéster, resultando no crescimento da cadeia de RNA no sentido 5’→3’. Existe uma grande diversidade de RNA polimerases, como as RNA polimerases I, II e III, que são responsáveis pela síntese dos rRNA, mRNA e tRNA, respectivamente. Existem alguns vírus que podem fazer uma síntese em direcção contrária à transcrição, ou seja, formar DNA a partir de RNA do hospedeiro. Este processo, catalisado pela enzima transcriptase inversa é designado por transcrição inversa. Na transcrição existem 3 etapas distintas: iniciação, elongação e terminação.
  49. 49. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 49 de 60 2.a. Iniciação A copia de cada gene é iniciada pela RNA polimerase ao nível do 1º nucleótido que irá ser copiado em RNA. É designado por Nucleótido +1 (Nt+1 ). A transcrição inicia-se em regiões do DNA designadas promotores que são reconhecidas pela RNA polimerase tendo esta enzima um papel fundamental no desenvolvimento e abertura da cadeia de DNA. Estas regiões promotoras têm particularidades estruturais, verificando-se que, na maior parte dos casos, a mesma sequência de nucleótidos está presente nos diversos genes – sequências de consenso. Existem ainda factores de transcrição, nomeadamente o factor σ, que se liga às regiões promotoras e estimulam a ligação da RNA polimerase ao local promotor. A iniciação da transcrição dá-se efectivamente quando os dois primeiros ribonucleósidos trifosfatados são posicionados e condensados entre si, sob a acção da RNA polimerase. 2.b. Elongação Esta etapa consiste na polimerização sequencial de resíduos ribonucleótidos ordenados segundo a sequência de DNA molde, por complementaridade de bases. O superenrolamento do DNA induzido pela abertura localizada resultante da RNA polimerase é resolvido, durante a elongação, através da acção de Topoisomerases. 2.c. Terminação A terminação da síntese da molécula de RNA é determinado por uma sequência da molécula de DNA, um sinal que é reconhecido por uma proteína de terminação, o factor ρ. Após a terminação da síntese da molécula de RNA, a enzima separa-se da cadeia molde.
  50. 50. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 50 de 60 2.d. Maturação do mRNA A cadeia de RNA mensageiro neo- sintetizada não pode ser considerada como definitiva para a síntese de proteínas designando-se nesta fase de RNA pré- mensageiro. Neste existem 2 tipos de sequências nucleotídicas: • Exões – codificam aminoácidos; • Intrões – intercalados entre os exões, sem significado proteico. Por um mecanismo designado por splicing, realizado por uma grande complexo, o spliceossoma, os intrões são removidos por acção das maturases, seguida da reparação dos cortes pelas ligases. As etapas de processamento do mRNA envolvem adição de um cap à extremidade 5’ e a poliadenilação da extremidade 3’. Após estas transformações o mRNA é considerado maturo e pronto para a tradução. RNA Polimerase Hélice de DNAPromotor Stop Sequência Iniciação Terminação Elongação Adição de um cap PoliAdenilação RNA Splicing RNA Mensageiro maturado exões intrões spliceossomas cauda poliA
  51. 51. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 51 de 60 3.TRADUÇÃO – A SÍNTESE DE PROTEÍNAS 3.a. Introdução A biossíntese de proteínas também é chamada tradução, uma vez que envolve a tradução bioquímica da informação de uma linguagem de 4 letras e estrutura dos ácidos nucleicos numa linguagem de 20 letras e estrutura das proteínas. Em suma, a biossíntese proteica é resultado do processo de tradução da informação contida no material genético da célula; as proteínas são, portanto, a expressão da informação genética. O processo de tradução requer um Código Genético, através do qual a informação contida numa sequência de nucleótidos de um ácido nucleico é expressa na forma de uma sequência específica de aminoácidos de um peptído. Uma alteração na sequência original de nucleótidos leva a uma alteração na sequência de aminoácidos, potencialmente causando uma doença – as vezes letal – no organismo.
  52. 52. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 52 de 60 3.b. O código genético O código genético dos seres vivos, hoje conhecido, funciona como uma linguagem baseada em 4 “letras” – ou bases de nucleótidos –, que forma “palavras” de três letras que, dependendo da maneira como são agrupadas, formam as “sentenças” – ou peptídos. Estas “palavras” de 3 letras são denominadas Codões, e são possíveis 64 codões diferentes. Os codões são expressos na linguagem do mRNA, sempre no sentido 5’→3’, e cada codão pode ser traduzido num aminoácido específico. 3 Codões sinalizam o término da sequência polipeptídica, e são designados por codões de terminação: UGA, AUG e UAA O codão AUG codifica a Metionina e, a iniciação de uma cadeia polipeptídica, sendo designado por codão de iniciação. Podem ocorrer mutações pontuais, em consequência da alteração de uma das bases de um codão, que podem levar a: • Mutação silenciosa – Quando o codão alterado codifica o mesmo aminoácido; • Mutação em “missense” – Quando o codão alterado codifica um aminoácido diferente; • Mutação em “nonsense” – Quando o codão alterado sinaliza o termino da cadeia 3.b.i. CARACTERÍSTICAS DO CÓDIGO GENÉTICO • Especificidade – Um codão específico codifica sempre o mesmo aminoácido • Universalidade – O código genético é válido para qualquer ser vivo, ou seja um dado mRNA de uma espécie ao ser traduzido em células de outra espécie, iria originar sempre a mesma proteína. Contudo encontram-se na mitocôndria alguns codões que codificam aminoácidos diferentes, quando comparados com o código genético mitocondrial, devendo por esta razão dizer-se que o código genético citoplasmático é universal. • Redundância – Um mesmo aminoácido pode ter mais de um codão que o codifica. Contudo um codão codifica sempre o mesmo aminoácido, pelo que se diz que o código genético não é ambíguo.
  53. 53. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 53 de 60 • Linearidade – A leitura do código genético é feita sem sobreposições ou pausas; se 1 ou 2 nucleótidos são delectados, a leitura torna-se completamente diferente a partir do ponto da deleção. Esta mutação denomina-se “frameshift”, ou mutação localizada.
  54. 54. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 54 de 60 3.c. Componentes necessários à tradução São vários, entre eles: 3.c.i. OS AMINOÁCIDOS: Devem estar presentes todos os 20 aminoácidos proteicos comuns no momento da síntese, inclusive os essenciais. 3.c.ii. O RNA DE TRANSFERÊNCIA: São as moléculas “bilingues” do processo, e estão ligadas de forma específica aos aminoácidos nas suas extremidades 3’. Possuem o anticodão ou a sequência de bases complementar e anti-paralela ao codão do mRNA. Cada aminoácido pode ser transportado por mais de uma molécula de tRNA. São em número de cerca de 50 tRNA no ser humano, para 64 codões diferentes. A hipótese “wobble”, ou de oscilação, tenta explicar como um tRNA pode reconhecer mais que um codão; nesta hipótese, o emparelhamento da primeira base do anticodão (5’) não é necessariamente feita do modo tradicional. Assim, nesta posição, a G pode emparelhar com a C ou U, e o U com a A ou G, por exemplo. 3.c.iii. O RNA MENSAGEIRO: Produzido a partir de um molde de DNA no núcleo da célula, vai ao citosol para ser traduzido numa sequência polipeptídica Traz a sequência de codões que define o número e o posicionamento dos aminoácidos da cadeia polipeptídica Cada molécula de mRNA corresponde – quase sempre – a uma cadeia polipeptídica (monocistrônicos). 3.c.iv. RIBOSSOMAS: São organitos formados por uma complexa associação entre proteínas e RNA Ribossómico, localizados no citosol na forma livre ou associados ao retículo endoplasmático, quando sintetizam proteínas que serão “exportadas” da célula.
  55. 55. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 55 de 60 São formados por 2 subunidades, uma maior e outra menor, cujas características são expressas em termos de coeficientes de sedimentação, ou “S” (de Svedberg). O ribossoma eucariota é formado por uma subunidade 60S e outra 40S; o procariota, por uma subunidade 50S e outra 30S. Compõem um ribossoma: • rRNA – 3 moléculas no procariota, 4 moléculas no eucariota. • Proteínas ribossómicas – Desempenham várias funções na tradução. • Sítio “A” e “P” – São locais de ligação para as moléculas de tRNA, e estendem- se por ambas as subunidades: o Os sítios A e P cobrem juntos dois codões vizinhos; o Na tradução, o sítio A – de aminoacil – é ocupado pelo Aminoacil-tRNA correspondente ao codão posicionado, e especifica o próximo aminoácido a ser adicionado à cadeia peptídica em formação; o O sítio P – de peptidil – é ocupado pelo Peptidil-tRNA, ligado à cadeia peptídica que está sendo sintetizada.
  56. 56. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 56 de 60 3.c.v. FACTORES PROTEICOS: São factores de iniciação, elongação e libertação da cadeia polipeptídica que está sendo sintetizada. 3.c.vi. FONTES DE ENERGIA A adição de cada aminoácido à cadeia polipeptídica que está sendo sintetizada utiliza 2 moléculas de ATP e 2 de GTP como fonte de energia. Outras moléculas de ATP e GTP são necessárias nos processos de iniciação e libertação da cadeia sintetizada.
  57. 57. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 57 de 60 3.d. Etapas da Biossíntese Proteica: 3.d.i. ACTIVAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS: Refere-se à ligação dos aminoácidos ao(s) seu(s) tRNA específico(s). Esta ligação é catalisada pelas Aminoacil-tRNA Sintetases, enzimas que reconhecem os aminoácidos e os seus tRNA específicos com grande especificidade. A reacção ocorre em 2 etapas, e é dependente de energia. Na primeira etapa, o aminoácido liga-se ao AMP, obtido a partir da hidrólise do ATP, com libertação de PPi. Na segunda etapa, o AA-AMP liga-se à extremidade 3’ do tRNA, libertando o AMP e energia.
  58. 58. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 58 de 60 3.d.ii. INICIAÇÃO DA CADEIA: Depende da presença da subunidade ribossomal 40S, do mRNA, do tRNA com o anticodão de iniciação AUG (metionina), e de uma série de proteínas denominadas “factores de iniciação”, ou eIF, no mínimo, em número de 9, nos eucariotas. Etapas: a) O eIF-2 liga-se especificamente com uma molécula de GTP e com o Met- tRNAi; b) A subunidade ribossomal 40S liga-se ao eIF-3, que a separa e a mantém separada da subunidade 60S, que por sua vez se liga ao eIF-6, com o mesmo propósito; c) O complexo formado em (a) liga-se ao complexo 40S formado em (b), com a ajuda de vários outros factores de iniciação, e este novo complexo associa-se ao mRNA – complexo de pré-iniciação; d) A associação do complexo de pré-iniciação com o factor de iniciação eIF-5 e com a subunidade 60S do ribossoma dá origem ao complexo de iniciação propriamente dito. O GTP é hidrolisado e os outros factores de iniciação são libertados; e) O complexo de iniciação é, portanto, formado por um ribossoma 80S associado aos eIF-5 e eIF-4, ao mRNA correctamente posicionado, e ao tRNA de iniciação também posicionado no sítio P, com o sítio A vazio. 3.d.iii.ELONGAÇÃO DA CADEIA: Depende dos “factores de elongação” e do complexo de iniciação Etapas: a) O Factor de Elongação eEF-1 dirige a selecção do tRNA correcto para o posicionamento no local A do complexo de iniciação. Este posicionamento depende ainda da hidrólise de 1 GTP, e ocorre com posterior libertação do eEF- 1; b) Há a formação da ligação peptídica entre os 2 aminoácidos adjacentes; c) A enzima peptidiltransferase, componente da subunidade ribossómica 60S, faz a transferência da metionina inicial do sítio P para o aminoácido do sítio A, formando um dipeptidil-tRNA;
  59. 59. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 59 de 60 d) O ribossoma move-se – às custas do GTP – na direcção 5’→3’ uma distância de 3 nucleótidos, com a ajuda do eEF-2, ou translocase, posicionando o péptido no sítio P e libertando o sítio A para o posicionamento de um novo aminoácido; e) O tRNA livre é libertado, e o processo repete-se até a tradução completa do mRNA. 3.d.iv.TERMINAÇÃO DA CADEIA POLIPEPTÍDICA: O aparecimento de um codão de terminação – UAG, UGA ou UAA – determina a ligação de um “Factor de Libertação”, ou eRF, associado ao GTP. Este factor de libertação determina a quebra da ligação entre o último AA e seu tRNA. A dissociação do eRF do ribossoma depende da hidrólise do GTP. Ribossoma unidade pequena (40S) Ribossoma unidade grande (60S) Aminoácido tRNA iniciador Iniciação Terminação Elongação Polipéptido
  60. 60. Carlos Capela Ácidos Nucleicos página 60 de 60 3.d.v. MODIFICAÇÕES PÓS-TRANSLACIONAIS Várias modificações podem ser impostas à cadeia polipeptídica após a sua biossíntese. As principais modificações são: • Redução do Tamanho: Conversão de proteínas inactivas e zimogênios nas suas formas activas, por remoção de sequências de aminoácidos catalisadas por endoproteases específicas. • Alterações Covalentes: Fosforilação, glicosilação, hidroxilação, etc. • Algumas proteínas são ainda endereçadas a organelos. Polipéptidos Polissoma Ribossomas

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