1. Universidad Anáhuac Mayab Integrantes:
•Angélica Bautista
Escuela de Medicina • Patricio Correa
Proteómica •José Mier
Prof. José Escobedo •Weyller Pam
•Jorge Valladares
2.
3. Técnica
• Consiste en la utilización de anticuerpos para
detectar el antígeno o los antígenos específicos de
interés.
• La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo
permite la detección de una única proteína dentro
de una mezcla compleja de otras proteínas.
4. ¿Como funciona?
• Se siguen una serie de pasos:
• A) separación de macromoléculas por geles de
electroforesis.
• B) las macromoléculas se transfieren a otra
matriz.(nitrocelulosa o PVDF)
• C) se bloquea la membrana para evitar la unión de Ac
utilizados para la detección de la proteína de interés.
5. • D) la proteína se le une un Ac marcado con una enzima.
• E) se añade un sustrato apropiado el cual reacciona con la
enzima y se obtiene un producto detectable. (luz)
9. Directo
• El anticuerpo primario marcado se une al antígeno
de la membrana y reacciona con el sustrato
originando una señal detectable.
10. Indirecto
• El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno.
Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario
y reacciona con el sustrato.
11. Ventajas del método directo
• Mucho más rápido ya que sólo se utiliza un anticuerpo.
• • Se elimina la posible reacción cruzada del anticuerpo
secundario.
• • Se pueden detectar diferentes antígenos utilizando
diferentes marcajes en diferentes anticuerpos
primarios.
12. Desventajas método directo
• La inmunoreactividad del anticuerpo primario
puede verse disminuida debido al marcaje.
• • El marcaje de los anticuerpos primarios es muy
cara y difícil.
• • No hay flexibilidad en el marcaje del anticuerpo
primario de un experimento a otro.
13. Ventajas método indirecto
• • Se incrementa la sensibilidad ya que cada anticuerpo primario posee
numerosos epítopos a los que
• puede unirse en anticuerpo secundario marcado, lo que permite la
amplificación de la señal.
• • Hay disponibles comercialmente una gran variedad de anticuerpos
secundarios marcados.
• • No se afecta la inmunoreactividad del anticuerpo primario por el marcaje.
• • Se pueden utilizar diferentes marcadores con el mismo anticuerpo
primario
14. Desventajas método indirecto
• Puede producirse reacción cruzada con el
anticuerpo secundario, con lo que se obtienen
marcajes
• inespecíficos.
• • Es más lento ya que se necesita un paso extra de
incubación.
17. • Se coloca un anticuerpo monoclonal en las paredes
del (posito).
18. • Se le agrega una suspensión de sangre u otro fluido.
Se hace para encontrar el antígeno
complementario.
19. • Si se presenta el antígeno se va a pegar al
anticuerpo que fue pegado al posito.
20. • Se puede ver como en la muestra del lado izquierdo
se pego el antígeno al anticuerpo.
21. • Se le agrega otro anticuerpo monoclonal que va a
tener una enzima reportera la cual va a ser la
encargada de mostrar cierto marcaje al unirse al
complejo antígeno- anticuerpo.
22. • Se le agrega primero el antígeno, estas pruebas son
para detectar anticuerpos específicos por ejemplo:
VIH.
23. • Se le inyecta la sangre al pocito que puede contener
los anticuerpos contra el antígeno que fue agregado
de no serlo, se eliminan en el siguiente paso.
24. • Del mismo modo el anticuerpo se une al antígeno
formando un complejo, después al igual que en la
directa se le inyecta un anticuerpo con una enzima
reportera que cambiara el colorante de la reacción.
25. • Al inyectarle un nuevo anticuerpo monoclonal con
la enzima reportera cambia de color la muestra y se
detecta.
26. Técnica de separación
molecular dependiente
de la distribución de
cargas moleculares.
Puede ser:
• Unidimensional
• Bidimensional
27. UNIDIMENSIONAL BIDIMENSIONAL
• 1 plano de separación • Usado en el fingerprinting y
• Utilizado en separaciones si es bien aplicado puede
rutinarias de proteínas y detectar todas las proteínas
ácidos nucleicos. de una célula.
• Su tipo de soporte es en • Se usan hojas por mayor
tubos superficie.
28. • SISTEMA CATIONICO VS ANIONICO
– Catiónico
• Si los cationes +++ van hacia el cátodo
– Aniónico
• Si se acomodan los aniones --- y van hacia el ánodo.
• Dependientes del acomodo de los electrodos:
• CÁTODO – UPPER BATH
• ÁNODO – LOWER BATH
29. – Las proteínas pueden tener
carga + ó -, pero son
dependientes del pH del
búfer.
– Gel:
• 3 secciones:
Running, Stacking, Sample
– La muestra debe ser
introducida por un medio no
convectivo (sucrosa)
– Los electrodos se conectan a
los extremos de la columna y
la electricidad pasa por los
geles.
30.
31. • TIPOS DE GELES
– Continuos (menos utilizados)
– Discontinuos: son múltiples porque
manejan concentraciones en un mismo
medio, nos permiten medir ag.
diferentes.
• GELES DE AGAROSA
– Son más adecuados para separar ácidos
nucleicos de alto peso molecular (200
mil D).
– Menos acrilamida
– La agarosa es un polisacárido que
disminuye la concentración de
acrilamida
– Utilizados para elaborar mapas
genéticos
32.
33. • Técnica de la biología molecular usada para separar
las proteínas por peso molecular. Puede separar
DNA Y RNA al igual.
• Técnica de gran alcance para conocer y resolver
mezclas proteicas.
34. SDS PAGE
• El dodecyl sulfato de sodio.- Es un detergente a
aniónico que desnaturaliza las proteínas, lo que las
disocia en subunidades.
• Esto hace que en el momento de la electroforesis
las subunidades puedan ordenarse por
tamaño, peso, plegamiento, etc.
35. 1. Solución proteica se mezcla con SDS.
2. EL SDS liga los residuos de aminoácidos con pesos
moleculares similares y les otorga una carga negativa
uniforme, lo que lineariza las moléculas por tamaño.
3. Se pone en el gel, en los respectivos pocitos, y se
agrega un tinte para que sigua el movimiento.
(Electroforesis)
36.
37.
38. SDS PAGE
• Gel empilador.- Gel de poliacrilamida de poros
grandes (4%). Almacenador. PH 6.8, este gel se
hecha sobre el gel de resolución.
• Gel de resolucion.- Gel de poliacrilamida de poros
restrictivos, pequeños. PH de 8.8, aquí las
moléculas se separan según su talla.
• Ambos usan como buffer el Tris.
39. • El gel de poliacrilamida.- Separa moléculas de
proteínas según talla y carga.
• SDS
• Electrodos
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