1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
DE LAS BAYAS DE GOJI.
Muestra: “ZUMO DE BAYAS FRESCAS DE GOJI”
BIO-ENER S.L.
Botella de 0,5 L recibida en julio-2009, para su análisis en
Septiembre/Octubre
Referencia interna: 09/321-2009
Responsable:
Dra. María Pilar Almajano (CEIB)
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2. ÍNDICE
OBJETIVO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
ANTIOXIDANTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
IMPORTANCIA DE LAS BAYAS DE GOJI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE,
POLIFENOLES Y FLAVONOIDES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
CAPTURA DE RADICALES POR EL METODO TEAC.
Cuantificación de polifenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu
Cuantificación de flavonoides
Oxigen Radical Absorbance Capacity (ORAC)
CONDICIONES GENERALES DEL ESTUDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
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3. OBJETIVO
El objetivo de este estudio es estudiar la evolución de la capacidad antioxidante del producto “Zumo de bayas
de Goji” a lo largo de 30 días y en diferentes condiciones de temperatura. Este producto está comercializado
por la empresa BIO-ENER S.L.
Se determina la evolución:
• de la capacidad antioxidante por el método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)
• de la capacidad antioxidante por el método ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity)
• de los polifenoles totales por el método Folin- Ciocalteu
• de los flavonoides por el método interno (ref Santas et al. 2008)
ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son moléculas que tienen la propiedad de evitar o prevenir la oxidación con otras moléculas.
Se produce una oxidación, siempre que una especie cede electrones a otra, la especie que gana electrones
se reduce, y la que pierde se oxida. En estas reacciones de oxidación, a veces, se pueden producir radicales
libres, especies muy oxidativas y que pueden producir daños al organismo. Los antioxidantes son especies que
acaban estas reacciones, inhibiendo algún producto intermedio y oxidándose los mismos.
Las células, como parte de su propio metabolismo, producen radicales libres y especies reactivas del oxigeno
(ROS). Estos radicales libres, son bloqueados por un complejo sistema antioxidante de enzimas como la catalasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y un continuo de antioxidantes no enzimáticos, como las
vitaminas A,E y C, glutatión, ubiquinona o flavonoides.
Si se produce un desequilibrio entre los proxidantes y los antioxidantes, se llega a un estado de estrés oxidativo, que puede ser producido por una excesiva producción de radicales libres.
La dieta juega un papel importante en la prevención de las enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo,
fundamentalmente a través de la ingestión de compuestos bioactivos de origen vegetal.
Entre ellos, las vitaminas hidrosolubles y liposolubles, carotenoides y una gran variedad de compuestos fenólicos, la capacidad antioxidante y beneficiosa de los cuales están siendo investigados ampliamente en los
últimos años.
Los compuestos fenólicos, constituyen una de las principales clases de metabolitos sencundarios de los vegetales, donde tienen diversas funciones fisiológicas. Entre otros, intervienen en el crecimiento y reproducción
de las plantas y en los procesos defensivos, (patógenos, depredadores, incluso radiación ultravioleta). Los
compuestos fenólicos presentan un anillo benzo hidroxilado, como un elemento común en todas sus estructuras moleculares, las cuáles pueden incluir grupos funcionales como esters, metil-esters, glicósidos, etc.
Los compuestos fenólicos comprenden desde moléculas simples como lo ácidos benzóicos hasta polímeros
complejos como las ligninas. Dentro de cada familia, el número de compuestos fenólicos existentes, serán
más o menos variado. Por ejemplo, se conocen más de 400 flavonoides diferentes, distribuidos en diversas
subfamilias, Los compuestos fenólicos están presentes en todo el reino vegetal y sus cantidades y tipos varían
en función de la especie, variedad y parte del vegetal considerado (frutas, semillas, brotes hojas....) horas de
exposición solar, grado de maduración, condiciones de cultivo, etc.
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4. A los alimentos los compuestos fenólicos, se presentan conjugados con azúcares, como la glucosa, galactosa,
arabinosa, ramosa, xilosa o los ácidos glucorónicos y galacturónicos. También pueden unirse con ácidos carboxílicos, ácidos orgánicos, aminoácidos y lípidos.
En la actualidad, este grupo de compuestos de origen vegetal, presentan un gran interés nutricional, por su
contribución, al mantenimiento de la salud humana. De hecho, desde 1.990, diversas organizaciones internacionales, en el ámbito de la nutrición, recomiendan un consumo diario como mínimo de cinco raciones de fruta
o verdura, para asegurar una adecuada ingesta de antioxidantes y prevenir enfermedades relacionadas con el
estrés oxidativo.
La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos, viene determinada por su estructura química, por lo que
existen grandes diferencias en la efectividad en los antioxidantes entre los diferentes grupos de compuestos.
Los compuestos fenólicos pueden actuar, como donantes de hidrógeno o electrones a las reacciones de terminación, que rompen el ciclo de generación de nuevos radicales libres, anticipando las reacciones de terminación actuando como un antirradicalarios. El radical fenoxil generado es menos reactivo, ya que se estabiliza por
resonancia con los electrones π del anillo aromático.
La alimentación aporta sustancias necesarias para el metabolismo humano, pero es justamente este mecanismo el que, al mismo tiempo, produce especies secundarias como radicales libres, muy reactivos y oxidantes,
con efectos negativos para la salud.
Los seres vivos, tienen un complejo sistema, para hacer frente a esta oxidación, y en especial, los vegetales,
por estar expuestos a la radiación solar. Ciertas sustancias, llamadas antioxidantes, desde vitaminas hasta
polifenoles, bloquean la acción de estos radicales libres.
Importancia de las bayas de Goji.
Durante los últimos años, las Bayas de Goji, han estado consideradas como uno de los alimentos, con mayor
capacidad antioxidante, que las ha hecho especialmente populares.
Las bayas de Goji, (o cerezas de Goji) son el fruto de un arbusto llamado Lycium barbarum L. de la familia de
las Solánaceas. Esta planta es bien conocida en la medicina tradicional china.
Hoy en día está muy usada como alimento funcional, con una larga variedad de efectos beneficiarios para la
salud. Por ejemplo, reducción de la glucosa sanguínea, efectos anti-envejecimiento, beneficios inmunológicos,
efectos anticancerígenos, incluso anti-fatiga (Harunubu et al.2009).
El primer archivo chino que documenta el uso del Lycium barbarum L., tiene aproximadamente 2.300 años.
Los frutos de la planta pueden ser utilizados, para producir diferentes tipos de productos saludables, como
fórmulas, y zumos medicinales. Algunos constituyentes del Lycium barbarum L, han sido estudiados químicamente, especialmente los polisacáridos glicoconjugados, presentes en las bayas. El objeto de este estudio es
“Zumo de bayas frescas de Goji” obtenido directamente de las bayas y sin adición de otros componentes.
Algunos estudios han cuantificado la capacidad de diversas frutas, como la guayaba, la papaya, la banana, la
carambola, la manzana de Jamaica, o la naranja. La Guayaba, (138 mg equivalente de ácido gálico/100 g de
fruta entera) es la que más capacidad antioxidante muestra, seguida por la carambola (131 mg/100), la naranja
(75 mg/100), el mango (54 mg/100), la banana (51 mg/100), la manzana de Jamaica (35 mg/100), y la papaya
28 mg/100), todos ellos medidos con mg equivalente de ácido gálico/100 gr fruta entera (Lim et al.2007)
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5. Cuantificación de la actividad antioxidante, polifenoles y flavonoides
Existen diversos métodos de medir la actividad antioxidante total. Algunos de éstos métodos, se pueden basar
en diversos procedimientos, como es la captación de radicales libres, generados o bien la medición de los polifenoles totales, contenidos en la muestra, por el método de Folin-Ciocalteau.
Captura de radicales por el método TEAC
El método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), es un método que sirve para cuantificar la capacidad antirradicalaria de los compuestos antioxidantes, es decir, sirve para cuantificar la captura de los radicales
libres.
El método TEAC, se genera un radical libre positivo, estable, llamado ABTS (Acido 2,2 -azinobis-(3-etilbenzotioazolín-6- sulfónico) mediante una reacción entre éste y el persulfato de potasio.
A éste, se le añade el antioxidante que queremos estudiar, y comprobamos la disminución de la absorvencia de
la muestra, ya que el ABTS posee un grupo cromóforo que observa la luz a 734 nm.
Cuantificación de polifenoles totales por el método del Folin-Ciocalteu
El ensayo Folin-Ciocalteu, ha estado utilizado durante muchos años, como medida del contenido en compuestos fenólicos totales en productos naturales. Aún así, el mecanismo básico es una reacción redox, por lo que
se puede considerar, como otro método de medida de la actividad antioxidante total. El método que se utiliza
actualmente, es una modificación, efectuada por Singleton y Rossi (1965) de un método que se utilizaba, para
la determinación de la tirosina, que estaba basado en la oxidación de los fenoles, por un reactivo de molibdeno
y wolframio.
La mejora introducida por Singleton y Rossi, fue el uso de un heteropolianio fosfórico de molibdeno y tungsteno
que oxida los fenoles con mayor especificidad,
(3H2O-P2O5-13WO3-5MoO3-10H2O y 3H2O-P2O5-14WO3-4MoO3-10H2O)
La oxidación de los fenoles, presentes en la muestra, causa la aparición de una coloración azulada que presenta un máximo de absorción a 765 nm, y que se cuantifica por espectrofotometría en base a una recta patrón
de ácido gálico. Se trata de un método preciso y sensible, pero que, aún así, padece numerosas variaciones,
cuando es aplicado por diferentes grupos de investigación, fundamentalmente en lo relativo a los volúmenes
utilizados de la muestra, concentración de reactivos y tiempo y temperatura de incubación. También se producen numerosas variaciones, en el modo de expresar los resultados, de manera que el patrón recomendado de
ácido gálico, ha sido sustituido, en ocasiones por otros. El ensayo de los fenoles totales, se utiliza con frecuencia en el estudio de las propiedades antioxidantes de alimentos vegetales, como zumos de fruta, al tratarse
de un parámetro que generalmente, muestra una estrecha correlación con los diferentes métodos de medir la
actividad antioxidante.
Así, cuando se evalúan, las propiedades antioxidantes de estos alimentos, el análisis de fenoles, proporciona
información valiosa a la hora de seleccionar, variedades con mayor potencial antioxidante.
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6. Cuantificación de flavonoides
Se realiza por un método interno descrito en Santas et al. Mediante separación y posterior cuantificación por
espectrofotometría UV-Vis.
Oxigen Radical Absorbance Capacity (ORAC)*
El método ORAC se aplica con frecuencia para asegurar la capacidad antioxidante en muestras biológicas
y alimentos. Se basa en la inhibición del radical peroxil oxidativo inducido por composición térmica de compuestos azo como el 2,2`-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Así, el ensayo ORAC combina
tiempo y disminución de la inhibición, a diferencia del método TEAC que únicamente evalúa la disminución en
la inhibición.
Inicialmente, el método ORAC se realizaba con B-phycoercythrin (B-PE) como compuesto fluorescente, ya
que posee diferentes longitudes de onda de excitación y emisión, elevado campo de fluorescencia, sensibilidad a las especies reactivas de oxigeno (ROS) y solubilidad en agua. Aún así, la B-PE presenta una serie de
inconvenientes: baja pureza del reactivo (aproximadamente del 30%) que provoca muchas variaciones en los
resultados si se utilizan reactivos procedentes de diferentes lotes, no es fotoestable por lo que transcurrido
un cierto tiempo, pierde totalmente la coloración e interacciona con los polifenoles. Estos inconvenientes han
provocado que a partir del año 2001 este método se haya adaptado para ser utilizado con fluorescencia (FL)
(3´6´-dihydroxy-spiro(isobenxofuran-1(3H),9´(9H)-xanthen)-3-one) como compuesto fluorescente.
El mecanismo de la reacción se basa en la transferencia de un átomo de hidrogeno (Hidrogen Atom Transfer,
HAT) del antioxidante al radical libre. Por esto, se utiliza el radical iniciador, el AAPH, para generar el radical
peroxil ROO· Un mol de AAPH, pierde un mol de nitrógeno, para generar dos mols de radical AAPH en un ratio
constante. En una solución saturada de aire, el radical AAPH reacciona rápidamente con el oxígeno para dar
un radical peroxil más estable, ROO·. La pérdida de fluorescencia de la FL es el indicador de la extensión de
la oxidación con el radical peroxil. En presencia de un antioxidante, RRO· capta, preferiblemente, un átomo de
hidrógeno del antioxidante estable (ArO·). Como consecuencia, la disminución de la fluorescencia de la FL por
acción del radical peroxil es disminuida o inhibida. Las reacciones que tienen lugar son:
Donde A-H representa al radical iniciador AAPH, FL-H es el compuesto fluorescente (FL) y ArOH es el antioxidante.
La protección del antioxidante se mide a partir del área de fluorescencia bajo la curva (AUC) de la muestra en
comparación con la AUC del blanco, donde el antioxidante no está presente. La AUC se calcula mediante la
siguiente expresión:
* Se explica con más profundidad debido a que es el más utilizado y a la vez más desconocido procidimentalmente.
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7. Donde:
I: número de ciclos.
F: unidades de fluorescencia
CT: tiempo de cada ciclo en minutos. En este caso, CT es igual a 2
La figura 1 muestra un ejemplo de las AUC del blanco y de los patrones, Trolox 20 mM, 40 mM,100 mM, 200
mM y 300 mM (concentraciones iniciales en muestra)
Figura 1. AUC de blancos y patrones de Trolox.
El área limpia bajo la curva (AUC límpia) se encuentra por diferencia entre el AUC de la muestra y el AUC del
blanco. Esta AUC limpia (y) se representa delante de la concentración de Trolox como patrón (X) obteniendo la
recta de regresión lineal, a partir de aquí, se calculan los moles equivalentes de Trolox por litro de muestra. Se
ha de remarcar que este calibrado con Trolox, se ha de realizar cada vez.
A la figura 2, se indica un ejemplo de la recta de calibrado obtenida por un ensayo del método ORAC.
Figura 2. Calibrado del método ORAC para un ensayo determinado
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8. Condiciones generales del estudio
La muestra se conservó con refrigeración (t=4ºC ± 2º C) y con la botella cerrada hasta el momento del inicio
del proceso.
Condiciones climáticas.
Se reproducieron las condiciones que se pueden llevar a cabo en casa. Se consideró dos situaciones, (cada
una en una botella). La cantidad necesaria para el análisis se extraerá periódicamente de ellas, en condiciones
higiénicas.
Una de las botellas se mantuvo a la temperatura de 20ºC (en un climatizador) durante todo el tiempo que duró
el experimento. La otra se conservó a temperatura ambiente, es decir sobre una mesa protegida de la luz. Ambas se dejaron desde el 16 de septiembre, durante 30 días. La evolución de la temperatura ambiente da una
media de 25,4ºC.
Debido a la evolución del experimento (posible contaminación a temperatura no refrigerada), a partir del 1 de
Octubre, se inician los estudios a temperatura de refrigeración (4ºC), con otra botella.
La desviación máxima de las condiciones reales de las cámaras respecto las condiciones establecidas es de
±2ºC. Se registró diariamente las condiciones de temperatura.
Duración del estudio.
Todos los estudios se dieron a término durante un periodo de 30 días.
Control del producto.
El producto fué analizado al inicio del estudio y a lo largo de la duración de éste, mediante controles periódicos
cada 5 días.
En cada control, se realizaron tres determinaciones por cada una de las pruebas y cada una de las temperaturas.
Toma de muestras
Cada 5 días y a la misma hora, se homogeneiza la muestra de la botella (por agitación manual) y se cogen 10
mL. No se pudo utilizar directamente el producto. Del zumo se separa la partículas en suspensión, mediante
centrifugación a 1200 rpm durante 10 minutos y se coge el sobrenedante, utilizando esta como muestra*
La metodología utilizada en los análisis corresponde a los métodos de procedimiento normalizados de trabajo
validados, basados en desarrollos internos. Los ensayos se llevaron a término con los controles y las garantías
establecidas en nuestro sistema de gestión basado en la norma ISO-17025.
Algunas de las muestras, (inicial y final) se validaron por HPLC.
*También se extrajo los polifenoles del precipitado. Presenta resultados similares al sobrenadado, pero no se recogen en este informe.
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9. Métodos
Determinación de polifenoles totales y de flavonoides.
El método de Folin-Ciocalteu se ha utilizado para la determinación de polifenoles totales, siendo el patrón y la
referencia el ácido gálico. Los resultados se expresan, como equivalentes en mg de ácido gálico por L de zumo.
Para realizar este método, se utilizó las extracciones realizadas anteriormente.
El método de Folin-Ciocalteu, se basa en una reacción entre el reactivo Folin-Ciocalteu activado con una base,
como carbonato de sodio.
El método de flavonoides cuantifica los polifenoles más activos como antioxidantes.
Para que la muestra no salga del rango lineal de la ley de Lambert-Beer, ni del rango de lectura del aparato, se
diluye adecuadamente la muestra.
Los resultados se expresaron mediante una calibración previa realizada con ácido gálico como patrón.
Estudio de la capacidad antirradicalaria.
El método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) es un método que sirve para medir capacidad antirradicalaria de una muestra.
Se compara la cantidad de inhibición del radical libre de la muestra con la de un patrón, Trolox, un isómero
hidrosoluble de la vitamina E, a partir de una recta de calibrado. Los valores obtenidos son similares (no equivalentes) a la capacidad antioxidante que tendría la vitamina E, pero con la ventaja que, al ser hidrosoluble no
queda retenido en el organismo.
El método ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity) se aplica para medir la capacidad antioxidante en
muestras biológicas y alimentos. Combina tiempo y disminución de la inhibición, a diferencia del método TEAC
que solamente evalúa la disminución en la inhibición.
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10. Resultados
a) La actividad antioxidante del Goji presenta los siguientes valores:
I) Entre 60 y 75 miliequivalentes de Trolox/L de muestra a lo largo del mes, medido por el método ORAC
que determina todas las especies reactivas al oxígeno. En la figura 3 se recoge la evolución.
Figura 3: Evolución de antioxidantes totales por ORAC
II) Entre 23 y 30 miliequivalentes de Trolox/L de muestra a lo largo de un mes, medido por el método
TEAC, que determina las especies reactivas frente radicales libres.
Los resultados se recogen en la figura 4.
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11. Figura 4: Evolución de los compuestos antirradicales por TEAC.
b) Los polifenoles totales, determinados por el método Folin-Ciocalteu, están entre 2 y 3 equivalentes en gramos de ácido gálico/L de muestra. La figura 5 muestra la evolución a lo largo de un mes.
Figura 5: Evolución de los compuestos fenólicos.
c) Los flavonoides totales se encuentran en el rango de 0,2 a 0,6 equivalentes en gramos de ácido gálico/L de
muestra. En la figura 6 se recoge la evolución.
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12. Figura 6: Evolución de los compuestos flavonoides
CONCLUSIONES:
Por tanto, se puede afirmar que la capacidad antioxidante mostrada por el zumo de Goji, de aproximadamente
unos 240 mg/100 g (medidos con mg equivalentes de ácido gálico, por cada 100 gr de zumo de Goji), presentan
una capacidad antioxidante, casi dos veces superior a la Guayaba o la carambola, unas tres veces superior a
la naranja, seis veces superior al mango y a la banana y unas siete veces superior a la manzana de Jamaica
y la papaya.
Bibliografía
Harunobu Amagase, Buxiang Sun, Carmia Borek, Lycium barbarum (goji) juice improves in vivo
antioxidant biomarkers in serum of healthy adults, Nutrition Research, Volume 29, Issue 1, January
2009, Pages 19-25.
Y.Y. Lim, T.T. Lim, J.J. Tee, Antioxidant properties of several tropical fruits: A comparative study, Food
Chemistry, Volume 103, Issue 3, 2007, Pages 1003-1008.
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