1. TUTORIAL HEMATOLOGI
DASAR-DASAR PEMBACAAN
HASIL FLOW CYTOMETRY
MENGGUNAKAN SYSMEX XT 2000i
Dr. MEITI MULJANTI
Pembimbing : Dr. ARIFOEL HAYAT, SpPK

2. I. PENDAHULUAN
Alat canggih pemeriksaan hematologi
Metode flow cytometry
SYSMEX Diagnosis penyakit hematologi
XT 2000i
Menunjang diagnosis penyakit non hematologi
Interpretasi benar dalam membaca hasil
2

3. II. METODE PEMERIKSAAN
Alat hematologi otomatis di Instalasi
Patologi Klinik RS.Dr.Soetomo :
Sysmex XE 2100, produksi TOA Medical
Electronic Company, Kobe, Jepang.
3

4. Gambar 1. Metode Pemeriksaan pada Sysmex XT-2000i 4

5. 1. METODE FLOW CYTOMETRY DGN LASER SEMIKONDUKTOR
Sysmex XT-2000i menyinari bhn pemeriksaan dg laser semikonduktor
pd  633 nm dg pengecatan polymethine.
Intensitas sinar scatter tgt: diameter partikel & sudut pandang.
– sinar forward scatter  ukuran sel
– sinar side scatter  kompleksitas sel: inti & granul sitoplasma
– side fluorescence  jumlah DNA & RNA (maturitas).
Gambar 2. Flow cytometry dgn laser semikonduktor 5

6. 2. METODE DETEKSI DC DGN HYDRODYNAMIC FOCUSING
• Tujuan HDF : menghilangkan coincidence loss & variant pulses krn
aliran non-axial & resirkulasi sel ke zona sensor.
• Prinsip HDF : dibuat aliran cepat&diberi tekanan ringan pd sekeliling
menghasilkan aliran sempit (satu grs aliran)satu persatu mll celah
• Bbrp sel mll celah bersama & membentur dinding celahvariant
pulsesdideteksi sbg interferen.
Gambar 3. Metode Deteksi DC dengan Hydrodynamic Focusing
6

7. 3. Metode SLS –Hb
• Metode cyanmethemoglobin
– Perubahan hemoglobin lambat & proses rumit
– Senyawa sianida (racun sbg reagen) tdk ramah lingkungan
• Metode oksihemoglobin,
– Hemoglobin cepat diubah mjd oksihemoglobin
– Tdk menggunakan racun
– Tdk dpt mengubah methemoglobin  oksihemoglobin, nilai <
• Metode SLS-Hb ;
– Kecepatan perubahan hemoglobin cepat
– Tdk menggunakan racun
– Dpt utk mengukur methemoglobin.
7

8. Metode SLS-Hb  Sodium Lauryl Sulfate (SLS:C12H25SO4Na)
Reaksi kimia:
1. Hemolisis eritrosit
2. Perubahan molekul globin
3. Oksidasi Fe
4. Pembentukan SLS-Hb.
SLS-Hb :abs. maks pd  535nm & pundak pd  560 nm dg fotometer.
8
Gambar 4. Metode SLS

9. III. PROSEDUR PEMERIKSAAN
HGB
2
RBC/ PLT 1 3 4 DIFF
Prosedur
RET 5 4 WBC/ BASO

10. 1. Prosedur pemeriksaan RBC/ PLT
Ratio 1:500
11,7 µL diluted sample
HDF
Hitung RBC, PLT, HCT
Gambar 5. Prosedur pemeriksaan RBC/ PLT
10

11. 2. Prosedur pemeriksaan HGB
Hemolisis eritrosit
Ratio 1:250
1:375 diluted sample,
Hb  SLS-Hb
 555 nm
Gambar 6. Prosedur pemeriksaan HGB
11

12. 3. Prosedur pemeriksaan 4 DIFF
Diluted
sample
Ratio 1:52,
22 det
Flow cytometry dg
laser semikonduktor
hemolisis eritrosit
& lekosit tercat
40 µL diluted sample
Gambar 7. Prosedur pemeriksaan 4 DIFF
12

13. DIFF CHANNEL
• Stromatolyser-4DL melisis eritrosit & trombosit ; melubangi
membran lekosit.
• Cat polymethine Stromatolyser-4DS masuk dlm lekosit ; mengikat
asam nukleat & organel sitoplasma.
• Diberi sinar laser  633 nm.
• Asam organik Stromatolyser-4DL mengikat granul eosinofil,
membedakan dg netrofil mll side scatter .
Gambar 8. DIFF Channel.
13

14. 4. Prosedur pemeriksaan WBC/ BASO
Ratio 1:50,14 detik,
hemolisis eritrosit
Flow cytometry dg
laser semikonduktor
40 µL diluted sample
Gambar 9. Prosedur pemeriksaan WBC/ BASO
14

15. WBC/ BASO CHANNEL
• Stromatolyser-FB menghasilkan eritrosit, trombosit (ghosts) & bare
nuclei of WBC kecuali basofil.
• Sel yg lisis & basofil dibedakan secara jelas oleh FSC & SSC.
• Hsl akhir basofil & bare nuclei merupakan jml total lekosit.
Gambar 10. WBC/ BASO Channel.
15

16. 5. Prosedur pemeriksaan RET
Ratio 1:255,
31 detik
Flow cytometry dg
laser semikonduktor
2,8 µL sampel yg tercat
Gambar 11. Prosedur pemeriksaan RET
16

17. RET CHANNEL
• Retikulosit intensitas fluoresensinya dibagi: LFR, MFR & HFR.
• MFR + HFR  fraksi retikulosit imatur (IRF).
• Optical platelet count (PLT-O) jg dihitung pd channel ini.
• RET-SEARCH (II) berisi cat polymethine&oxazine msk membran sel
& mengecat RNA retikulosit& DNA/RNA sel berinti.
• Retikulosit dipisahkan dr eritrosit matur  RNA & dipisahkan
dr sel berinti berdasarkan  RNA/DNA.
Gambar 12. RET Channel 17

18. III. CARA MEMBACA HASIL FCM SYSMEX XT 2000i
SFL FCS
ssc ssc
FSC
FSC
SFL SFL
Gambar 13. Gambaran FCM Sysmex XT-2000i pd org normal
18

19. 19
Gambar 14. Hsl sysmex XE 2100 di Inst. PK. RS. Dr. Soetomo

20. 2. SCATTERGRAM
DIFF Scattergram
DIFF Scattergram menggambarkan lokasi sel hitung jenis :
– limfosit, monosit, netrofil, eosinofil dan kelompok ghost eritrosit.
• Sumbu x menggambarkan intensitas sinar side scatter, &
• sumbu y intensitas sinar side fluorescence.
Gambar 15. DIFF Scattergram 20

21. WBC/ BASO Scattergram
• WBC/ BASO Scattergram khusus menunjukkan lokasi sel basofil &
WBC serta kelompok ghost eritrosit.
• Sumbu x menggambarkan intensitas sinar side scatter & sumbu y
menggambarkan intensitas sinar forward scatter.
Gambar 16. WBC/ BASO Scattergram
21

22. RET & PLT-O Scattergram
• RET scattergram khusus menunjukkan adanya retikulosit berikut
diferensiasinya yaitu LFR, MFR & HFR.
• Membedakan eritrosit dws, retikulosit & trombosit tmsk menghitung
rasio retikulosit, jml retikulosit, jml eritrosit & jml trombosit.
• PLT-O scattergram terlihat kelainan retikulosit & trombosit.
Gambar 17. RET & PLT-O Scattergram
22

23. PERBEDAAN DENGAN SYSMEX XE 2100
SYSMEX
XE-2100
1. NRBC CHANNEL 2. IMI CHANNEL
Membedakan lekosit dgn NRBC Menggunakan reagen Stromatolyser-IM
IG diproteksi dr lisis dgn adanya asam
amino.
Gambar 18. NRBC Channel Gambar 19. IMI Channel
23

24. Scattergram abnormal
Gambar 20. Scattergram abnormal
24

25. 3. HISTOGRAM
• Histogram RBC, menggunakan grs batas 100 fL (grs merah).
– ditengah  normositer,
– bergeser ke kiri  mikrositer,
– bergeser ke kanan  makrositer.
• Distribusi RBC meluas  RBC anisositosis.
• MCHC abnormal tinggi krn data RBC & HCT menurun palsu.
• Referensi utk mendeteksi hemaglutinasi.
Gambar 21. Histogram RBC
25

26. Histogram PLT
• Histogram PLT : semakin tinggi gunung histogram  jml PLT ↗ &
semakin rendah gunung histogram  jml PLT ↙.
• Fokuskan pd bagian kanan histogram
• Luas distribusi PLT mjd besar, dpt disebabkan kesalahan data PLT.
• Pada gambar terlihat platelet agglutination, large platelets dan
schizocytes terjadi antara 20 fL sampai 40 fL.
Gambar 22. Histogram PLT
26

27. 4. Messages
• Terdapat 3 IP Message(s) pd hsl pemeriksaan FCM :
– WBC IP Message(s),
– RBC/RET IP Message(s) &
– PLT IP Message(s).
• Stp IP Message(s) tdd 2 bag : Abnormal & Suspek.
• Abnormal WBC IP Messages: Netropenia, Netrofilia, Limfopenia,
Limfositosis, Monositosis, Eosinofilia, Basofilia, Leukositopenia,
Leukositosis.
• Suspek WBC IP Messages: Blast, Immature Gran (IG), Left Shift,
Atypical Lympho/ Blast, NRBC, RBC Lyse resistance.
27

28. • Abnormal RBC IP Messages: RBC Abn Distribution,
Dimorphic Population, RET Abn Scattergram,
Retikulositosis, Anisositosis, Mikrositosis,
Makrositosis, Hipokromia, Anemia, Eritrositosis.
• Suspek dari RBC IP Messages: RBC Agglutination,
Turbidity/ HGB Interference, Iron Deficiency, HGB
Defect, Fragments.
• Abnormal PLT IP Messages: PLT Abn Scattergram, PLT
Abn Distribution, Trombositopenia, Trombositosis.
• Suspek PLT IP Messages: PLT Clumps, PLT Clumps (s).
28

29. IV. CONTOH HASIL FCM ABNORMAL
1. Acute Myeloid Leukemia (AML)
Limfosit & monosit bergabung dlm kelompok besar (DIFF Scattergram).
Pd suspek IP Messages : Blast? Hasil lbh tepat dr HDT.
29

30. Gambar 23. HDT AML
30

31. 2. Chronic Myeloid Leukemia (CML)
Cluster meluas dr daerah Netrofil  daerah SFL kuat (DIFF Scattergram)  IG.
IG 32 % (myelo 16% + meta 16%) dg metode manual & 16,8 % dg XT 2000i.
Cluster bergerombol di daerah BASO pd WBC/ BASO Scattergram  immature
31
cells/ morphologically large cells. Hasil lbh tepat dr HDT.

32. Gambar 24. HDT CML
32

33. 3. Acute Lymphocytic Leukemia (ALL)
Daerah limfosit & monosit  satu kelompok pd DIFF Scattergram, diduga bhw
jml limfoblas > 90% pd HDT. Pd WBC IP Messages : Blasts ? Hsl lbh tepat dr HDT.
33

34. Gambar 25. HDT ALL
34

35. 4. Anemia Defisiensi Besi
Luas distribusi RBC meluas menunjukkan anisositosis. Daerah RBC matur
tampak pada daerah forward scatter pada RET Scattergram, menunjukkan RBC
mikrositik. Namun tidak menunjukkan pengaruh RBC mikrositik pada data PLT-
O, sebagai indikasi pemisahan antara daerah RBC matur dan daerah platelet
pada PLT-O scattergram. Hasil lbh tepat dr HDT. 35

36. Gambar 26. HDT Anemia Defisiensi Besi
36

38. 38

39. Penghitungan konstanta RBC :
• MCV (Mean Corpuscular Volume) dihitung dari: RBC dan HCT dalam satuan
femtoliter (fL), 1 fL sama dengan 10-15L.
MCV = HCT (%) x 10
RBC (x 106 /µl)
• MCH (Mean Corpuscular Haemoglobin) dihitung dari: RBC dan Hb dalam satuan
pikogram (pg), 1 pg sama dengan 10-12 g
MCH = Hb (g/dL) x 10
RBC (x 106 /µl)
• MCHC (Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration) dihitung dari: HCT dan Hb
dalam satuan g/dL
MCHC = Hb (g/dL) x 100
HCT (%)
39

40. Rasio retikulosit :
RET% = jumlah partikel di zona retikulosit X 100
Jumlah partikel di zona RBC dewasa + jumlah partikel di zona retikulosit
Jumlah retikulosit :
RET# = RET% X RBC
100
Low Fluorescence Ratio (LFR) :
LFR = 100 – HFR – MFR
Middle Fluorescence Ratio (MFR) :
MFR = Jumlah partikel di zona MFR X 100
Jumlah partikel di zona retikulosit
High Fluorescence Ratio (HFR) :
HFR = Jumlah partikel di zona HFR X 100
Jumlah partikel di zona retikulosit
Immature Reticulocyte Fraction (IRF) :
IRF = MFR + HFR
40

41. Distribusi ukuran partikel RBC.
• RDW-SD : tinggi puncak diasumsikan 100%, luas distribusi terletak pada
tingkat frekuensi 20%.
• RDW-CV : pada titik L1 dan L2 ditemukan pada frekuensi 68,26% dari luas
distribusi total. Dihitung dengan rumus :
RDW-CV (%) = L2 – L1 x 100
L2 + L 1
41

42. Distribusi ukuran partikel PLT.
• MPV (Mean Platelet Volume) dihitung dari :
MPV (fL) = PCT (%) X 10.000
PLT (X 103 /µµL)
• PDW (Platelet Distribution Width) dengan tinggi puncak diasumsikan 100%, luas
distribusi pada tingkat frekuensi 20% adalah PDW. Satuan dinyatakan dalam fL.
• P-LCR (Platelet Large Cell Ratio) adalah rasio trombosit besar dari diskriminator >
12 fL. P-LCR dihitung sebagai rasio yang membandingkan jumlah partikel antara
diskriminator tetap dan UD, dengan jumlah partikel antara LD dan UD.
42

43. NILAI NORMAL HEMATOLOGI
NO HEMATOLOGI NORMAL SATUAN
1 HGB L: 13,4-17,7/ P: 11,4-15,1 g/ dL
2 RBC L: 4 – 5,5/ P: 4 - 5 106/ µL
3 HCT L: 40-47/ P: 38-42 %
4 MCV 80-93 fL
5 MCH 27-31 Pg
6 MCHC 32-36 g/dL
7 RDW-SD 35-47 fL
8 RDW-CV 11,5-14,5 %
9 WBC L: 4,3-10,3/ P: 4,7-11,3 103/µL
10 Eo 0-4 %
11 Baso 0-2 %
12 Neut 51-67 %
13 Lymph 25-33 %
43

44. NO HEMATOLOGI NORMAL SATUAN
15 Mono 2-5 %
16 PLT 142-424 103/ µL
17 PDW 9-13 fL
18 MPV 7,2-11,1 fL
19 P-LCR 15-25 %
20 PCT 0,150-0,400 %
21 NRBC 103/ µL
22 Ret 106/ µL
23 IRF,LFR,MFR,HFR %
44

45. 45

46. 46

47. 47

48. 48

49. 49