1. Journal Reading Hematology
Full blood count and haemozoin-
containing leukocytes in children
with malaria: diagnostic value and
association with disease severity
Johanis / Yetti Hernaningsih
1

2. Latar belakang
Malaria  anemia & trombositopenia.
Impresisi perhitungan manual:
- 100 sel : 1-12%
- 10.000 sel : 4,6-5,4%
Alat hitung darah lengkap (FBC) mutakhir:
- presisi dan akurasi lebih baik
- lebih cepat (30-60 detik)
- keterbatasan penggunaan di wilayah endemis
malaria karena kompleksitas dan harga .
2

3. Latar belakang
Haemozoin (Hz): hasil akhir detoksifikasi haem
yang difagosit oleh monosit dan granulosit.
Beberapa penelitian:
- hubungan Hz dengan diseritropoiesis dan
anemia.
- hubungan antara Hz-containing leukocyte
(PCL) dengan beratnya malaria.
3

4. Latar belakang
Keterbatasan penelitian (mikroskopik)
sebelumnya:
- impresisi tinggi  PCL relatif rendah dan
pengamatan jumlah total leukosit rendah,
- menghabiskan banyak waktu dan subjektif.
PCL sangat berguna untuk mendiagnosis
malaria.
Cell-Dyn 3000® dapat mendeteksi sel yang
mengandung Hz secara otomatis.
4

5. Metode
• Penelitian dilakukan di Albert Schweitzer Hospital
(HAS), Lambaréné, Gabon, tahun 2003 dan 2004.
• Wilayah holoendemis malaria hutan hujan tropis.
• Sampel darah diambil dari penderita anak yang
didiagnosis sebagai malaria.
• Hasil FBC anak-anak usia di bawah 12 tahun.
• Data demografis dan beratnya penyakit
berdasarkan kriteria WHO 2000.
5

6. Metode
Mikroskopik Cell-Dyn 3000®
- Hitung
pigment- Σ lekosit/µl
containing 120 µl diencerkan 78 µl dikalikan
darah (1:51) dihitung 1.529
monocytes (dalam 1
(PCM) dalam eritosit & sampai
jam setelah batas
100 monosit diambil) dilisiskan dianalisis
10.000
-Hitung
pigment-
containing
granulocytes - 5 bagian hitung jenis lekosit
(PCN) dalam - Prinsip multi-angle-polarized-scatter-separation (M.A.P.S.S.®)
200 granulosit
- Setiap perhitungan, diperoleh 1 data di antara 256 saluran.
-Pewarnaan
Giemsa hapusan - Dataset disimpan sementara dalam daftar modus, diproses,
didapatkan hasil FBC, dan ditampilkan dalam bentuk grafik di
darah tebal.
monitor.
- Hanya menampilkan 5000 perhitungan pertama pada grafik.
6

7. Gambar , plot granularitas/lobularitas Cell-Dyn 3000®.
Biru: limfosit, ungu: monosit, jingga: granulosit, hijau: eosinofil (atau "mis-
classified” ganulosit yang mengandung Hz).
7

8. Metode
• Area kiri dan atas yang biasanya merupakan
area populasi eosinofil ternyata tidak
mengandung eosinofil pada anak yang tidak
menderita malaria. Sedangkan pada anak yang
menderita malaria, area tersebut berisi titik
hijau yang menunjukkan adanya PCN.
8

9. Metode
• Derajat depolarisasi yang lebih tinggi
disebabkan oleh banyaknya jumlah Hz yang
difagosit atau kristal Hz yang lebih besar,
kemungkinan berkaitan dengan beratnya
penyakit.
9

10. Metode
• Untuk uji hipotesa ini, dua indeks berat penyakit
untuk mengukur derajat depolarisasi:
(i) jumlah nilai sumbu y monosit dan granulosit
yang mengandung Hz
(ii) jumlah nilai sumbu y setelah perhitungan
matematika (akar dan logaritma nilai sumbu y).
• Indeks ini menjelaskan manfaat nilai cut-off untuk
membedakan malaria yang berat dan tidak berat.
10

11. Metode
• Data dianalisis dengan software SPSS 14.0.
• Uji data kuantitatif menggunakan t-test
sampel tidak berpasangan dengan varians
tidak sama.
• Uji data kualitatif menggunakan chi-square.
11

12. Hasil
368 anak (54% , 46% )
152 malaria falciparum (>88% >1thn)
216 anak yang sehat atau menderita penyakit lain
(99,1% <1thn)
152 anak dengan malaria
48 malaria berat:
a. 15 kasus anemia berat,
b. 13 kasus hiperparasitemia,
c. 3 kasus hipoglikemia,
d. 17 kasus malaria serebral (3 kasus malaria
serebral + anemia berat)
12

13. 13

14. 14

15. Kurva Receiver-Operator-Characteristic (ROC) :
Area Under Curve (AUC) hitung trombosit (0,97), PCM (0,97), PCN (0,91)
untuk diagnosis malaria
(0,5-0,7:akurasi rendah, 0,7-0,9:akurasi sedang, >0,9:akurasi tinggi) 15

16. Hasil
Cut-off 250.000 trombosit/µl: sensitifitas 92%
dan spesifisitas 93%,
cut-off 150.000 trombosit/µl: sensitifitas 66% dan
spesifisitas 99%
≥ 1 titik ungu (PCM) di atas garis ambang batas
memberikan sensitifitas 96% dan spesifisitas 96%.
Titik hijau (PCN) di area analisis memberikan
sensitifitas 85% dan spesifisitas 96%.
Kombinasi keduanya memberikan sensitifitas 97%
dan spesifisitas 93%.
16

17. Mikroskopis: Pemeriksaan 200 granulosit dan 100 monosit dalam hapusan
darah tebal pewarnaan Giemsa. Cell-Dyn 3000® mean analisis 4,175
granulosit (rentang: 800–8.830) dan mean 1,364 monosit (rentang: 230–
3.660).
P = chi square test, NS: not significant (>0,05)
17

18. Hasil
Kesulitan identifikasi PCL mikroskopis dengan hapusan
darah tebal:
sulit menentukan morfologi sel yang disebabkan oleh
proses pewarnaan ,
sulit membedakan granulosit dan monosit.
Tidak dimasukkan dalam analisis statistik:
PCM: 4 kasus (PCM > 100)  malaria serebral (185),
anemia berat (169), hipoglikemia (127), dan malaria
tidak berat (109).
PCN: 2 kasus (PCN > 50)  malaria serebral (66 dan
75 PCN).
18

19. Automated detection of Hz-containing leukocytes and disease severity. Scatterplots
of (a) purple coded events (PCM, Hz-containing monocytes) and (b) green coded events
(PCN, Hz-containing granulocytes) distribution in children with non-severe and severe
malaria (left two colums), and in three subgroups of severe malaria (severe anaemia,
cerebral malaria and hyperparasitaemia, right three colums). Solid bar represents mean,
dashed bars 95% confidence interval about the mean for the standard error. See text for19
outliers that were removed.

20. Hasil
• Perbedaan tingginya PCM pada malaria berat
(mean: 25,4) dengan malaria tidak berat
(mean: 19,3)  tidak signifikan (p = 0,14).
• PCM pada kelompok anemia berat (mean:
39,9) > malaria serebral (mean: 23,3) dan
hiperparasitemia (mean: 14,8).
20

21. Hasil
• Pada PCN, terdapat perbedaan signifikan (p <
0,0001) antara kelompok malaria berat (mean:
15,7) dan malaria tidak berat (mean: 7,5).
• Perbedaan sedikit lebih tinggi pada kelompok
malaria serebral (mean: 18,0) daripada
anemia berat (mean: 15,3) dan
hiperparasitemia (mean: 16,3).
21

22. Hasil
• Jumlah lekosit yang mengandung Hz:
- distribusi lebar
- tumpang tindih antara kelompok malaria
berat dan tidak berat.
- hasil kurva ROC komputer menunjukkan AUC
untuk PCM sebesar 0,62 dan PCN sebesar 0,75
yang berarti akurasi uji (berat & tidak berat)
tersebut rendah.
22

23. Hasil
Depolarisasi biru (limfosit):
 77 dari 152 (51%) pada anak dengan
malaria, mean: 4,2 (rentang: 3-24).
 Lebih sering pada anak dengan anemia
(11/14).
23

24. Diskusi
Perbedaan usia
• kelompok malaria (mean: 3,7 thn)
• kelompok bukan malaria (mean: 0,6 thn)
 Σ lekosit, limfosit, monosit pada anak
<1thn lebih tinggi
24

25. Diskusi
Hb
• Terendah: malaria berat,
Lebih tinggi: malaria tanpa komplikasi,
Tertinggi: bukan malaria.
25

26. Diskusi
Trombosit
Cut-off 150.000/µl  66% malaria teridentifikasi,
spesifisitas 99%
Kurva ROC:
Cut-off 250.000/µl  sensitifitas 92%,
spesifisitas 93%.
Penelitian terbaru:
Kecenderungan agregasi trombosit pada pasien
malaria  trombosit terhitung rendah
26

27. Diskusi
Kekurangan identifikasi PCL dengan mikroskop
• Hapusan darah tebal
- sulit membedakan granulosit dan monosit
- artefak cat  Hz kecil
• Hapusan darah tipis
- banyak sel  banyak waktu menghitung
27

28. Diskusi
Kelebihan CD 3000®
• Cepat dan akurat (sensitifitas & spesifisitas
>90%)
• Deteksi pasien PCL positif lebih banyak
daripada mikroskopik (terutama PCN).
28

29. 29

30. Diskusi
Jumlah PCM berbeda antara kelompok malaria
berat dan yang tidak berat.
PCN lebih banyak pada malaria berat terutama
pada malaria serebral.
PCN sebagai petanda malaria lebih inferior
dibanding PCM, kemungkinannya:
- titik granulosit,
- waktu paruh hidup lebih pendek dari monosit,
- Σ PCN < PCM (malaria tidak berat)
30

31. 31

32. Diskusi
Keterbatasan
• Perbedaan usia  sulit bandingkan parameter
FBC.
• Hanya menampilkan 5000 sel meskipun dapat
mendeteksi PCL lebih banyak, karena:
- batas 5000 sel pertama
- hilang saat transformasi “screen shot”.
32

33. Diskusi
Keterbatasan…
• Faktor kehilangan ini sebesar 5 kali dengan
5000 perhitungan yang digunakan untuk
membentuk grafik pada layar.
• Diperlukan konfirmasi dengan anti-CD14 dan
anti-CD16 antibodi.
33

34. Diskusi
Penemuan baru
• Adanya titik biru depolarisasi tinggi mirip limfosit.
• Sel ini merupakan sel fagosit (lebih kecil, dengan
rasio inti/sitoplasma >>, inti lebih bulat, seperti
NK cell atau sel fagosit darah tepi).
• Perlu penelitian lebih lanjut (flow cytometry)
untuk penjelasan dan peranannya dalam
patofisiologi malaria.
34

35. Kesimpulan
Hitung jumlah trombosit baik untuk diagnosis
malaria (kelompok usia).
PCL lebih mudah dideteksi dengan laser-
flowcytometry.
Penemuan Hz untuk diagnosis dan penentuan
berat penyakit.
35

36. Kesimpulan
Keterbatasan penentuan prognosis 
tumpang tindih jumlah PCL malaria berat dan
yang tidak berat; kemungkinan:
- algoritma pendeteksian yang tidak sesuai,
- hilangnya data saat proses.
36

37. Terima kasih
Gabon
37

38. Pembentukan hemozoin plasmodium
St.merozoit Monomeric α-
Biokristalisasi
mencerna Hb hematin (toksik)
Inert β-hematin
Heme-
polymerase crystal
(hemozoin)
Back
38

39. Figure. Plasmodium sp. infection generally
appears as intracellular merozoites,
forming one to several rings within infected
erythrocytes. Gametocytes (left margin)
are seen infrequently.
39

40. Malaria is transfered by
mosquitoes
Parasites invade red blood
cells
Proliferation of parasites inside
red blood cells
Degradation of hemoglobin to
malaria-pigment hemozoin
(crystalline, birefringent)
Destruction of red blood cells
and
release of parasites
release of hemozoin
Development of Plasmodium vivax
Uptake of hemozoin by white (Tropen und Reisemedizin, Jürgen
blood cells: Knobloch, Gustav Fischer Verlag)
neutrophilic granulocytes,
monocytes 40

41. 41

42. Amber
intracytoplasmic
hemozoin
(arrows)
visualized
by light
microscopy within
a
polymorphonuclea
r cell in a case of
severe malaria
with
hyperparasitemia
Back
42

43. Microscopic bright field image of a
monocyte with inclusion of malaria
pigment. Inset: polarisation - microscopic
image of the hemozoin - inclusion
Back
43

44. Back
44

45. Siklus hidup plasmodium pada
manusia
Skizon hati (berisi
Sporozoit Tropozoit hati
merozoit)
Merozoit
Skizon eritrosit
Tropozoit eritrosit menginfeksi
(berisi merozoit)
eritrosit
Merozoit Sebagian
menginfeksi membentuk
eritrosit lain gametosit ( & )
45

46. Hubungan Hz dengan anemia
• Hz is intensely biologically active and catalyzes
the formation of free radicals through
repeated redox cycles initiated by the Fe (III)
moiety. The effect of Hz may be reproduced by
equivalent amounts of synthetic and hematin,
and it seems likely that intracellular or
membrane-bound Hz in contact with erythroid
cells causes cellular dysfunction and oxidative
damage (Abigail Lamikanra, Taco Kooij, and
David Roberts, manuscript submitted).
46

47. Hubungan Hz dengan diseritropoiesis
dan anemia
• Endoperoxides produced in HCMs may impair
erythroid growth.
• Hz directly inhibits erythropoiesis
independently from TNF-α, and that Hz and
TNF-α have additive effects on the
development of erythroid cells.
• Proinflammatory cytokines, in particular TNF-
α, have been thought to be the major cause of
bone marrow dysfunction.
47

48. TNF-α
• Reseptor: TNFR-I (CD 120a), TNFR-II (CD 120b)
• Merangsang: proliferasi sel, apoptosis, netrofil
untuk memfagosit
• Diproduksi oleh makrofag, monosit, limfosit,
sel mast, netrofil, keratinosit, astrosit,
mikroglia, otot polos, & sel tumor.
• Berperan pada keganasan dan infeksi parasit.
Back
48

49. Hubungan Hz dengan diseritropoiesis
dan anemia
The proportion of monocytes that contain Hz probably
reflects the total amount of Hz produced during
infection, and may also reflect the degree of deposition
of Hz in the bone marrow, stromal cells, and
hematopoietic cells.
The bone marrow sections from children who died with
severe malaria show gross dyserythropoiesis.
Significant association between the quantity of Hz and
the proportion of erythroid cells that was abnormal.
These findings are consistent with a direct inhibitory
effect of Hz on erythropoiesis.
49

50. Representative sections of bone marrow from children with severe malarial anemia.
(A-C) Highly abnormal erythropoiesis (irregular, bi-, and multinucleated erythroid
cells) in association with Hz (arrows). (D) Hz predominantly inside myeloid cells
(hematoxylin and eosin staining; original magnification, x 1000).
Back
50

51. Hubungan Hz dengan diseritropoiesis
dan anemia
• Elevated nitric oxide production in children
with Malaria Anemia is associated with
decreased hemoglobin concentrations and
that hemozoin can induce NO synthase 2 -
derived NO formation in cultured blood
mononuclear cells.
Back
51

52. Trombositopenia pada malaria
• The thrombocytopenia that complicates at
least some malarial infections is caused by
immune mechanisms; specific IgG binds to
platelet-bound malaria antigen through the
Fab portion of the immunoglobulin molecule.
• Hipersplenism
• Agregasi trombosit
Back
52

53. The 2000 WHO criteria
Severe malaria is defined as: the presence of P. falciparum on thick smear
and at least one of the following clinical or biological criteria :
 coma (Blantyre coma scale ≤ 2),
 impaired consciousness (Blantyre >2 and < 5),
 repeated convulsions (≥ 2/24 hours),
 prostration,
 respiratory distress,
 jaundice,
 metabolic acidosis (bicarbonates < 15 mmol/L),
 severe anaemia (Hb < 5 g/dL or Ht < 15%),
 hyperparasitaemia (parasitaemia > 4%),
 macroscopic haemoglobinuria,
 renal failure,
 collapse (TAS < 60 mmHg before 5 years of age),
 abnormal bleeding, or
 pulmonary oedema (X-ray criterion).
Back
53

54. Blantyre coma scale (anak)
Gerakan bola mata
mata terarah 1
tidak terarah 0
Respon verbal
menangis normal 2
merintih 1
tidak terarah 0
Respon gerakan
respon lokal terhadap rangsang nyeri 2
menarik tungkai karena rangsang nyeri 1
non spesifik atau tidak ada reaksi 0
54

55. Pemeriksaan malaria
• Mikroskop
- ada tidaknya parasit
- spesies & stadium plasmodium
- kepadatan parasit:
* semi kuantitatif
* kuantitatif
Σ parasit/1000 eri (persentase) x Σ eri (µl) 
tipis
Σ parasit/200 leko x Σ leko (µl)  tebal 55

56. Pemeriksaan malaria
• Tes diagnostik cepat
- HRP-2 (Histidine rich protein 2)
- Enzim parasite lactate dehydrogenase (p-
LDH) dan aldolase
56

57. 1. Focus Laser Beam (λ: 632,8 nm), 2. 0˚ Scatter (cell size), 3. 10˚ Scatter (cell
complexity), 4. 90˚ Scatter (lobularity), 5. 90˚D Scatter (granularity)
57

58. Back
58

59. Microscopic images of cells (a,b: PCM; c: neutrophilic granulocyte) of a malaria patient sorted from the regions
depicted in the bivariate side scatter plots (d,e). a– c: Birefringence of the dark hemozoin inclusions was proved
by polarization microscopy and included as insets in each image. The corresponding area is indicated by a
rectangle. f,g: Corresponding scatter plots of a blood sample of a malaria-negative person. Ly, lymphocytes; M, Back
59
monocytes; Gn, neutrophilic granulocytes; Ge, eosinophilic granulocytes.

60. Metode
• Monosit dan granulosit yang mengandung Hz
berupa titik plot pada grafik granular – lobular.
• Bila tidak ada data daftar modus, maka
menggunakan screenshot.
• Wilayah plot granularitas/lobularitas diubah
menjadi bitmap image dengan resolusi
maksimal 140x140 piksel dan analisa dengan
program ImageJ.
60

61. Metode
Plot Granularitas/lobularitas Cell-Dyn 3000®:
Plot lobularitas pada sumbu x dengan side-scatter 90°
Plot granularitas pada sumbu y dengan depolarisasi scatter
90°
Komputer pada alat membuat garis dinamis yang
memisahkan antara granulosit (jingga) dan eosinofil (garis
1a).
Area analisis monosit yang mengandung Hz:
- Titik ungu diatas garis abu-abu (1a),
- Titik ungu diatas garis abu-abu horisontal 5 piksel dari dasar (1b).
 Area analisis granulosit yang mengandung Hz: sekitar garis
hitam (2)
 Area analisis kode-biru depolarisasi: di atas garis hitamGambar plot
10 piksel
dari garis dasar (3). 61

62. Monocytes, which accumulated the birefringent, malaria pigment hemozoin, a
degradation product of the parasites, are characterized by high intensity in
depolarized side scatter. pigment-corrying monocytes appear in the region
indicated as PCM, Eosinophilic granulocytes and neutrophilic granulocytes are
designated as Ge and Gn
62

63. Granularity-versus-lobularity plot of a Cell-Dyn 3000 series full-
blood count analyzer. a: Patient without malaria. b: Patient with
Plasmodium
falciparum malaria showing the typical appearance of hemozoin-
containing monocytes in the eosinophil area. Back
63

64. Malaria cerebral
 Diffuse encephalopathy where focal neurological signs are unusual
 Convulsions are usually generalised but are occasionally focal
 EEG has non-specific changes
 CT / MRI show mild cerebral swelling (cerebral oedema is rare)
 Un-arousable coma with the best motor response being non-
localising (GCS M1-4) and the best vocal response being
incomprehensible (V1-2)
 Mild neck stiffness
 Neck retraction
 Retinal haemorrhages but the pupils are normal
 Disorders of conjugate gaze are common
 Extensor posturing
 UMN or LMN lesions may be found.
64

65. Malaria cerebral in children
 Coma persists more than 30 minutes after a convulsion
 Convulsions can continue after the onset of coma
 Noisy and laboured breathing
 Cold, clammy skin with a core-to-skin temperature
difference of >100C may be seen
 Shock, with the systolic pressure below 50 mm Hg
 Extreme opisthotonus ('bent-like-a-bow') posture,
mimicking either tetanus or meningitis.
 Symmetrical upper motor neuron and brain stem
disturbances including disconjugate gaze, decerebrate and
decorticate postures
 Corneal reflex and 'Doll's eye' may be absent
Bac
k 65

66. Hasil
• Nilai mean usia anak dengan malaria berat
(3,8 thn) dan malaria tidak berat (3,4 thn)
tidak berbeda signifikan (p=0,27)
• Parameter FBC berbeda signifikan kecuali
perhitungan eosinofil antara anak dengan
malaria dan anak tanpa malaria.
• Jumlah trombosit lebih rendah pada anak
dengan malaria (65% < 150.000/µl) dan
tumpang tindih di antaranya sangat kecil.
66

67. Hasil
• Pada anak dengan malaria, jumlah lekosit
sedikit lebih tinggi pada malaria berat
• Perbedaan signifikan secara statistik hanya
pada jumlah total lekosit dan jumlah netrofil
• Hemoglobin lebih rendah pada malaria berat
• Tidak ada perbedaan jumlah trombosit
67

68. Hasil
• Tidak ada perbedaan signifikan antara dua
garis batas (gambar 1, garis 1a dan 1b) dengan
parameter PCM/PCN. Analisis semua bagian
menggunakan garis horisontal (1b).
68

69. Diskusi
Trombosit
• Lebih tinggi terutama pada anak yang lebih
muda namun interval antara nilai terendah
dan tertinggi lebih lebar.
69

70. Back
70

71. Diskusi (metode)
• CD 3000® berpotensi besar dalam kecepatan,
keakuratan pendeteksian, enumerasi PCL
untuk mengidentifikasi lebih banyak sampel
PCL-positif dan presisi lebih baik daripada
secara mikroskopis.
• Sulit melakukan enumerasi PCL mikroskopik
pada pewarnaan Giemsa hapusan darah tebal
atau tipis.
• Pewarnaan sering meninggalkan artefak yang
mengganggu penglihatan dan mudah salah 71

72. Diskusi (metode)
Pemeriksaan dengan mikroskop
polar/lapangan gelap mudah dan tidak mahal
namun sejauh ini tidak ada penelitiannya.
Dengan hapusan darah tipis meghabiskan
banyak waktu untuk menyaring setiap sel.
Penelitian lain mengamati keterbatasan
jumlah monosit dan granulosit untuk
mengidentifikasi sel yang mengandung Hz dan
menunjukkan hasil dengan impresisi yang
signifikan pada hasil hitung jenis 100 sel
secara manual. 72

73. Diskusi (PCL)
• Granulosit akan aktif memfagosit pada malaria
berat yang mengandung lebih banyak Hz; yang
merupakan penjelasan PCN merupakan
petanda inferior malaria, dimana jumlahnya
pada malaria yang tidak berat lebih sedikit
daripada PCM.
• Pengamatan ini pernah dikemukan pada
penelitian sebelumnya dengan menggunakan
metode mikroskopis, namun hasilnya sangat
berbeda. 73

74. Diskusi (PCL)
• Persentase pasien malaria berat pada
penelitian sebelumnya, variasi PCM: 65-85% ,
PCN: 37-85%
• Dapat disebabkan:
- perbedaan populasi penelitian,
- sulitnya memberikan hasil yang baik dengan
mikroskop cahaya.
74

75. Diskusi (PCL)
• Penelitian lain melakukan hitung PCL
berdasarkan asumsi hitung lekosit 7.500 atau
8.000/µl sedangkan pada penelitian ini, rata-
rata perhitungan lekosit antara malaria berat
dan yang tidak berat berbeda lebih dari
2.000/µl, dan hasil perhitungan absolut akan
sangat berbeda bila perhitungan lekosit yang
asli dikerjakan.
75