Dokumen tersebut memberikan penjelasan tentang pengecatan sitokimia pada leukemia yang dapat membantu diagnosis dan klasifikasi tipe leukemia. Beberapa metode pengecatan yang dijelaskan antara lain mieloperoksidase, sudan black, PAS, LAP, dan nonspesifik esterase, beserta prinsip, reagen, dan interpretasi hasilnya.

1. 09/14/11 TUTOR HEMATOLOGI

2. Pembimbing YETTY HERNANINGSIH LABORATORIUM / INSTALASI PATOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA RSU Dr. SOETOMO SURABAYA 2009 Oleh : PANTJARARA B. TUTOR HEMATOLOGI PENGECATAN SITOKIMIA PADA LEUKEMIA 09/14/11

5. Pasien dengan tipe laukemia tertentu diklasifikasikan sehubungan dengan penentuan tindakan pengobatan yang akurat dan prognosis yang lebih baik. Klasifikasi FAB membagi leukamia akut m enjadi 2 kelompok yaitu: 1. Acute Myeloid Leukemia, di bagi menjadi: M0 AML, diferensiasi minimal M1 AML, tanpa maturasi M2 AML, dengan maturasi M3 Leukemia Promielositik Akut, hipergranuler M3v Leukemia Promielositik Akut varian, mikrogranuler M4 Leukemia Mielomonositik Akut M4eo Leukemia Mielomonositik Akut, dengan eosinifilia M5a Leukemia Monoblastik Akut, dengan diferensiasi rendah M5b Leukemia Monoblastik Akut, dengan diferensiasi baik M6 Eritroleukimia Akut M7 Leukemia Megakarioblastik Akut 09/14/11

6. 09/14/11 2. Acut Liymphoblastic Leukemia, dibagi menjadi 3 tipe yaitu: - L1, - L2 dan - L3.

7. Pengecatan sitokimia : Sudan black, Periodic acid-Schiff (PAS), Terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT), Leukocyte alkaline phosphatase (LAP), Tartrate-resistent acid phosphatase (TRAP), Myeloperoxidase, Leukocyte spesific esterase dan Leukocyte nonspecific esterase. 09/14/11

8. Masing-masing metode mempunyai spesifikasi dan mekanisme terjadinya hasil positif (+) dan negatif (-). Pada tugas tutor ini: Myeloperoxidase, Sudan black, Periodic acid-Schiff (PAS), Leukocyte Alkaline Phosphatase dan Non Spesific Esterase. 09/14/11

20. 09/14/11 Reagen: Fiksasi: Metanol Periodic-acid solution. Reagen schiff : basic fuchsin Caunterstain:aqueous Haemtoxylin.

23. Leukosit Alkalin Fosfatase (LAP) Prinsip: Pada granula neutrofilik terdapat enzim fosfatase yang mampu menghidrolisis substrat yang megandung naptol fosfat menjadi produk yang berikatan dengan zat wana membentuk komplek warna biru. Substrat mengandung naptolfosfat -> hidrolisis->naptol+ azodye 09/14/11

25. Reagen : Fiksasi : Metanolformalin 4% Substrat : Naphtol AS phosphate Buffer : Tris buffer 0,2 mol/L pH 9,0 Stock substrate solution : Larutkan naphtol AS phosphate dalam N,N- dimethylformaldehide. Tambahkan Tris buffer 100 ml 0,2 mol/l, pH 9,1. Coupling azo-dye : garam Fast Blue BB Counterstain : Aqueous Netral red 0,02%. 09/14/11

27. 09/14/11 Hapusan darah harus segera dibuat sebelum 30 menit, sebab aktifitas lekosit alkali fosfatase menurun dengan cepat pada pengunaan EDTA. Hapusan harus segera dicat dalam waktu 6 jam.

28. Interpretasi: Leukocyte Alkaline Phosphatase (LAP) dapat diukur secara kasar dengan menentukan skor ukuran dan intensitas granula yang terwarnai. Normal :15-130, nilai yang mungkin mulai 0 maksimal 400 Penghitungan pada 100 sel netrofil Intensitas pewarnaan: 0 (tanpa pewarnaan) sampai dengan 4 (pewarnaan kuat dan dalam). 0 Negatif, tanpa granula, sitoplasma tidak tercat. 1 Positif lemah, granula jarang. 2 Positif lemah, jumlah granula sedang. 3 Positif kuat, granula banyak. 4 Positif sangat kuat dengan banyak granula kasar dalam sitoplasma, sering menutupi nukleus. 09/14/11

29. 09/14/11 Kondisi yang berhubungan dengan skor abnormal Leukosit Alkalin Fosfatase Skor LAP < 15 CML Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Hematologic neoplasms Myelodysplastic syndromes Infeksi atau keracunan Skor LAP >130 Infeksi Growth factor theraphy Myeloproliferative disorder selain CML Inflammatory disorders Kehamilan, kontrasepsi oral Stress obat (lithium, korticosteroid, estrogen)

30. Nonspesific (alpha-naphthyl butirate or alpha-naphthyl acetate) Esterase Pengecatan non spesific esterase digunakan untuk identifikasi sel monosit tetapi tidak untuk granulosit atau eosinofil. Limfosit T matur yang tercat dengan karakteristik fokal, dotlike pattern . 09/14/11

31. 09/14/11 Prinsip: Lekosit esterase merupakan kelompok enzim yang menghidrolisis acyl atau chloroacyl ester dari α - naphtol atau naphtol AS. Perbedaan pemeriksaan antara alpha-naphthyl butirate dan alpha-naphthyl acetate Esterase : pada substrat spesifik dan pH.

32. 09/14/11 α- Naphtyl butyrate esterase Reagen: Fiksasi: Buffered Formalin aseton Bufer: Bufer fosfat 100 mmol/L pH 8,0 Substrat: α - Naphtyl butyrate 100µL dalam 5ml aseton Coupling reagent: Fast garnet GBC 15 mg atau Fast Blue BB Counterstain: aqueous haematoxylin

33. 09/14/11 Metode: 1. Fiksasi: formalin aseton 30 detik 2. Bilas dgn air kran dan keringkan 3. Tambahkan Fast Garnet GBC pada bufer 4. Tambahkan 0,5 ml α - naphtol butyrate atau larutan aseton 5. Inkubasi selama 20-40 mnt 6. Bilas dengan air kran. 7 . Counterstain: Aqueous haematoksilin selama 1-5 mnt

34. 09/14/11 Interpretasi: Hasil reaksi granuler coklat Mayoritas monosit (>80%) tercat kuat. Netrofil, eosinofil, basofil dan platelet negatif (-) Limfosit B (-), T tidak tercat. Pada bone marrow : monosit dan makrofag teracat kuat. α – Naphtol butyrate lebih spesifik untuk identifikasi komponen monosit dalam AML dari pada α - Naphtol acetate.

35. 09/14/11 α- Naphtyl acetate esterase Reagen : Fiksasi : Buffered Formalin aseton Bufer : Bufer fosfat 66 mmol/L pH 6,3 Substrat : α - Naphtyl acetate 100µL dalam 5ml etilen monometil eter. Medium inkubasi. Coupling reagent: pararosaniline Counterstain: aqueous haematoxylin

36. 09/14/11 Metode: 1. Fiksasi: formalin aseton 30 detik 2. Bilas dgn air kran dan keringkan 3. Celupkan slide dalam medium inkubasi selama 30-60 mnt. 4. Bilas dengan air kran dan keringkan. 5. Counterstain: Aqueous haematoksilin selama 2-5 mnt

37. 09/14/11 Interpretasi Hasil reaksi: warna merah/coklat rata. Monosit normal dan lekemik tercat kuat Granulosit normal negatif (-) Mielodisplasi atau AML positif (+). Megakarioblas lekemik (+) Limfosit, Limfoblas T (+) dotlike Leukaemic eritroblast (+)

38. 09/14/11 Internet atlas of hemayology NORMAL HEMOPOIETIC CELLS IN CYTOCHEMICAL STAINS Peroxidase reaction Peroxidase reaction S udan black B reaction

39. 09/14/11 PAS reaction PAS reaction AS-D-chloroacetate esterase reaction Butyrate esterase reaction Internet atlas of hematology

40. 09/14/11 MPO (-) Sudan Black (-) PAS (-) PAS (+) Data pasien

41. CONTOH HASIL POSITIF Reaksi Peroksidase. Granulosit positif kuat pada sel leukemia. Pembesaran 1000X Reaksi Peroksidase pada sumsum tulang. Pembesaran 1000X. 09/14/11 Internet atlas Leukemia library

42. Sudan Black B pada sumsum tulang (Leukemia Mielositik akut) (FAB M1) 09/14/11 Sudan Black B (Leukemia Promielositk Akut) Internet atlas Leukemia library

43. 09/14/11 Granula kasar, PAS positif pada sitoplasma. Pembesaran 1000X. Granula kasar, PAS positif dalam sitoplasma limfoblas sumsum tulang. Pembesaran 1000X. Internet atlas Leukemia library

44. Reaksi Alpha- Naphthylacetae esterase pada sumsum tulang. Limfoblas negatif. Pembesaran 500X. 09/14/11 Neutrophyl Alkaline Phosphatase. Positif kuat ( 4+) dan positif sedang (3+ dan 2+) Internet atlas Leukemia library

45. Reaksi Alpha- Napthylacetate esterase pada darah perifer, sel leukemia positif kuat. Pembesaran 1000X. Dengan aktifitas yang sangat tinnggi pada sel leukemia. Pembesaran 1000X. 09/14/11 Internet atlas Leukemia library

46. 09/14/11 LAP, A=0 LAP, B=1+ LAP, C=2+ Wintrobe’s

47. 09/14/11 LAP, D=3+ LAP, E=4+ Wintrobe’s

48. 09/14/11 G= PAS, granula positif pada malignant lymphoid cell (sezary syndrom) H= PAS, sel ALL dengan granula kasar Wintrobe’s

49. 09/14/11 I= Peroksidase, Granula biru dari sitoplasma mieloblas pada pasien acute myeloblastic leukemia J= Peroksidase, Granula matur warna biru Wintrobe’s

50. 09/14/11 K= Sudan Black L= Non spesifik esterase, monosit dan monoblas dengan sitoplasma warna coklat orange Wintrobe’s

51. 09/14/11 M= Chloroasetate esterase , promielosit dengan sitoplasma warna maroon, pada pasien AML Wintrobe’s

52. 09/14/11 Color atlas hematologi Harald Theml dkk Histochemical Features of AML FAB HISTOCHEMISTRY M1 Occasional peroxidate+ granules, PAS- M2 Strongly peroxidase+, PAS- M3 Strongly peroxidase+, PAS- M4 Strongly peroxidase+, some cells may be PAS+ M5 Many be peroxidase+ and PAS+, nonspecific esterase stains are strongly + . M6 Red cell precursors are PAS+, ringed sideroblasts are seen with iron stains M7 Variable, platelet peroxidase can be demonstrated by electron microscopy

53. 09/14/11 E.N Kosasih H asil tes sitokimia pada AML dan ALL Jenis tes sitokimia AML Klasifikasi FAB M0 M1-3 M4 M5 M6 M7 ALL Mieloperoksidase - + + - - - - Chloroacetate - + + +/- - - - α - naphtol acetate - - + + - +/- - Sudan Black B - + + - - - - PAS - - +/- +/- + - +

54. 09/14/11

55. 09/14/11 2. Acut Liymphoblastic Leukemia, dibagi menjadi 3 tipe yaitu: L1: ALL dengan sel limfoblas kecil-kecil dan merupakan 84% dari ALL. L2: ALL sel lebih besar, inti ireguler, kromatin bergumpal, nukleoli prominen dan sitoplasma agak banyak. Merupakan 14% dari ALL. L3: ALL mirip dengan limfoma burkitt, yaitu sitoplasma basofil dengan banyak vakuola, 1% dari ALL.

56. 09/14/11 Pengecatan sitokimia: Merupakan suatu metode yang digunakan dalam pengecatan pada sampel darah dengan berdasarkan reaksi dan menggunakan bahan-bahan kimia

57. 09/14/11 Metode: Non spesifik esterase 1, Hapusan difiksasi dengan udara kering dalam paparan formalin ->4 menit 2 . Bilas dengan air suling dan keringkan 3. Inkubasi dalam chloroacetate substrate solution -> 5-15menit ->suhu kamar. 4. Bilas dengan air suling dan keringkan. 5.Inkubasi dalam butyrate substrate solution -> 15-30menit-> suhu ruangan dan hindari sinar. 6 . Bilas dengan air suling 7. Caunterstain dalam aqueous haematoxylin -> 5 menit 8. Bilas dengan air suling keringkan dan periksa.

60. 09/14/11 Sel-sel dengan granula primer -> promielosit->azurofilik ->netrofil, eosinofil, basofil dapat dilihat hanya degan Elektron mikroskop. Granula sekunder->mielosit Granula sekunder->alkali fosfatase Granula tersier->tampak pada akhir mielosit-> pada human netrofil

61. 09/14/11

62. 09/14/11

63. 09/14/11 Keterangan gambar: LAP: A= 0, B=1+, C=2+, D=3+, E=4+ G= PAS+ ( Sezary syndrome ) H= PAS, ALL, granulakasar I= Peroksidase, granula biru, AML J = Cat biru pada granula matur K= Sudan Blak L= Non spesifik esterase, monosit dan monoblas dengan sitoplasma warna coklat orange M= Cloroasetat esterase, promielosit dengan sitoplasma warna maroon, ada pasien AML N= Tartrat-resistent acid phosphat, granula sitoplama warna gelap.

64. 09/14/11 M= Cloroasetat esterase, promielosit dengan sitoplasma warna maroon, pada pasien AML

65. 09/14/11 MPO (-) Sudan Black (-) PAS (-) PAS (+)

66. 09/14/11 Perbedaan ALL dan AML Hematologi klinik ringkas, EGC Sitokimia ALL AML Mieloperoksidase - + Sudan black - + Esterase non spesifik - + PAS (kasar) + (monositik)