Spanish version regarding of drug susceptibility tests of M. tuberculosis.

1. Métodos para determinar la
resistencia a los fármacos
anti-tuberculosis
1
“UN DÍA PARA ESTAR AL DÍA EN TUBERCULOSIS”
H O S P I TA L R E B A G L I AT I
ESSALUD
Méd. Alberto Mendoza Ticona
Instituto Nacional de Salud
Unión Nacional Contra la Tuberculosis
Instituto de Biotecnología y Salud

2. 2

3. Pruebas de diagnóstico
 Medicina basada en evidencias
 Como evaluar una prueba diagnóstica:
- Para seleccionar una prueba a usar:
 Sensibilidad
 Especificidad
- Para evaluar la credibilidad de los resultados de la prueba:
 Valor predictivo positivo
 Valor predictivo negativo
 Coeficiente de probabilidades positivo
 Coeficiente de probabilidades negativo
 Nomograma de Fagan

4. Nomograma de Fagan
4

5. 5

6. Pruebas de susceptibilidad anti -TB
6
Pruebas Fenotípicas Pruebas genotípicas
Ensayos de nitrato reductasa (Griess)* MTBDRplus y MTBDRsl
MODS* Xpert MTB/RIF
Ensayos de fagos* INNO-LiPA Rif. TB
Ensayos de agar en capa delgada Secuenciamiento de genes de
resistencia
Proporciones en medio LJ*
Proporciones en agar 7H10, 7H11*
Reacción de reducción con colorantes
biológicos
Sistema MGIT
Sistema BACTEC 460 y 960
* Pueden ser evaluados de manera directa o indirecta.

7. 7
Métodos de Referencia

8. Pruebas de susceptibilidad convencionales
8
 Pruebas fenotípicas
 Ausencia de crecimiento de MTB en presencia de drogas.
 Tres métodos importantes en medios sólidos:
 Método de proporciones
 Método de tasa de resistencia
 Método de la concentración absoluta

9. Método de proporciones
9
 Más ampliamente usado como referencia
 Medios sólidos: LJ, Ogawa, agar 7H10, 7H11
 Proporción de resistencia > 1% (INH, RIF y PAS)
 Proporción de resistencia > 10% (demás drogas)

10. Concentraciones críticas de los principales
antibióticos para el método de proporciones
10
Antibiótico LJ 7H10 7H11
INH 0,2 0,2 - 1,0 0,2 - 1,0
RIF 40,0 1,0 1,0
EMB 2,0 5,0 7,5
S 4,0 2,0 2,0 – 10,0
PAS 0,5 2,0 8,0
KM 20,0 5,0 6,0
ETH 20,0 5,0 10,0
Ofloxacina 2,0 2,0 2,0
Capremocyna 20,0 10,0 10,0
Cycloserina 40,0 30,0 30,0
Ciprofloxacina - 2,0 2,0
Adaptado de: Kent y Kubica 1985; NCCLS 2000

11. Método de la razón de resistencia
11
 Razón entre el MIC de una cepa problema sobre el
MIC de una cepa de referencia (H37Rv)
 Regla
 Si MIC problema/MIC ref ≤ 2, sensible
 Si MIC problema/MIC ref ≥ 8, resistente
MIC: La menor concentración de droga con la que se obtiene un
número de colonias menor de 20.

12. Método de la concentración absoluta
12
 Usa un inóculo estandar
 Interpretación más fácil
 Usa concentración crítica de cada droga
 Compara con medio libre de drogas
 Interpretación:
 Incubación entre 4 a 6 semanas
 Sensible: Número de colonias < 20 con un control 3+ o 4+ en
el crecimiento control.

13. BACTEC 460
13
Becton – Dickinson
Middelbrook 7H9
Acido palmítico – C14 (12B vial)
El consumo del ac. graso produce CO2
SIRE
PZ
Considerado Gold Standar para dorgas de primera línea
Sobre todo PZ
Más rápido que medio sólido
Desventajas:
Descontinuación, costo y desechos radiactivos

14. MGIT
14
 The Mycobacterial Growth Indicator Tube
(BD)
 Versión manual y automatizada
 Contiene caldo Middlebrook 7H9
modificado unido a una sustancia
fluorescente sensible al consumo de
oxígeno.
 Requiere luz UV para revelar la
fluorescencia
 Interpretación: la presencia de fluorescencia
en el tubo con droga dentro de los dos días
de reacción positiva del tubo control.
 Indirecto y Directo

15. BACTEC 960/320
15
 Basado en el mismo principio, usa tubos MGIT
 Tiene una lectura automatizada
 Aprobado como Gold Estándar
 Buena concordancia con PS en medio sólido y BACTEC 460

16. 16
Métodos rápidos para TB-MDR
Bwanga F, et al. Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis: A meta-
analysis. BMC Infectious Diseases 2009, 9:67
Disponible en: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/9/67

17. Ensayo de Reducción de Nitratos (NRA)
17
 Directo e Indirecto
 Reactivo de Griess
 Capacidad del MTB de reducir
nitrato a nitrito.
 Reactivo de Griess
 Lectura:
 Indirecto 7 y 14 días
 Directo 14, 21 y 28 días
 Recientemente recomendado por
la OMS.
 Incorporada al MINSA desde 2005

18. MODS (1)
18
 Desarrollado en Perú, (Caviedes , 2000)
 Simultáneamente detecta TB y
susceptibilidad a H, R y MDR
 Utiliza caldo 7H9,
enriquecimiento OADC
mezcla de antibióticos PANTA
 Principio: identificación mediante microscopio
invertido de la formación de microcolonias
características de MTB (cordones)
 Tiempo entre 7 a 21 días (para declarar negativo)

19. NaOH-
NALC PBS 7H9
Centrifuga 15
min 3000g PANTA
Vortex y dejelo Llene OADC
15 minutes tubo
hasta
15ml
Decontaminación de la muestra
900μl/pozo
MODS
isoniacida
Cultivo y prueba
rifampicina de susceptibilidad
directa
sin droga
sin droga
1 2 3 Control 4 5 19
negativo

20. MODS (2)
20
 Avalado por OMS desde 2009 para
detectar TB y TB-MDR directa e
indirectamente.
 Menor rendimiento con INH.
 Descentralizado en 4 regiones de Perú.
 Nuevas propuestas de versiones de
microscopía electrónica y
telediagnóstico y teledocencia (Zimic 2010)
 Prototipo de un nuevo kit comercial (Hardy
Diagnostic)

21. 21

22. Métodos basados en Fagos
22
 Basado en la capacidad de MTB
de permitir el crecimiento de
micobacteriofagos (D-29)
 Versiones “in house” y
comerciales (FastPlaque TB)
 Resultados buenos para R, no
para H, pero baja especificidad
 Evaluaciones en forma directa e
indirecta.
 No es respaldado por OMS.

23. Cultivo en agar de capa delgada (TLA)
23
 Capa delgada de agar 7h11
 O método de la microcolonia
 Visualización de las características culturales de las
microcolonias con microscopio estándar (Welch 1993)
 Es muy bueno para detectar TB, pero requiere mayor
evidencia para detectar TB-MDR.

24. Color test
24
 Desarrollado en Perú (Herrera B)
 En proceso de validación (Evans C)
 Detecta TB y resistencia a H, R y Quinolona (Cx)
 La colonia cambia de color
 Ahorra el proceso de decontaminación
 Envase con solución desinfectante
 Inoculación directa en los 4 campos

25. 25

26. 26

27. 27

28. Métodos colorimétricos(CRI)
28
Son métodos indirectos.
Usan indicadores de reducción o sales de
tetrazolium
para detectar el crecimeinto de micobacterias a
diversas concentraciones de drogas (MIC)
La resistencia se detecta al producirse cambio en
el color del indicador añadido al medio.
Alamar blue cambia a rosado
Sal de tetrazolium, amarillo cambia púrpura
(MTT)
REMA (Resazurin microtiter assay)
Utilizado en drogas de 1 y 2 línea.
Recomendado por OMS, julio 2010

29. Line Probe Assays
29
 Extrae ADN de muestra o cultivo.
 Amplifica secuencia especifica (PCR)
 Hibridación reversa con DNA específico
inmovilizado en líneas paralelas en una tira de papel.
 La hibridación es inferida porque se colorea la banda
respectiva
 INNO-LiPA (Complejo MTB y rPOB para RIF)
 Geno Type MTBDRplus (Complejo MTB, INH y RIF)
 Geno Type MTBDRplus (Complejo MTB, Fq, Km, Ak, Etb)

30. Regiones genómicas asociadas con resistencia a drogas de
1era y 2da línea
Antibiótico Gen Producto Frecuencia de mutación (%)
Estreptomicina rpsL Prot. Ribosomal S12 ̴ 60
rrs RNAr 16S < 10
Rifampicina rpoβ Subunidad β RNApol > 95
katG Catalasa-peroxidasa 60-70
oxyR-ahpC Alkilhidroxireductasa ̴ 20
Isoniacida inhA Enoyl ACP reductasa < 10
kasA β ketoacil ACP sintetasa < 10
ndh NADH deshidrogenasa NA
Etambutol embCAB Arabinosiltransferasas ̴ 70
Pyrazinamida pncA Amidasa 70-100
Etionamida inhA Enoyl ACP reductasa < 10
ethA Flavoprot. monooxigenasa NA
Kanamicina rrs RNAr 16S ̴ 65
Fluoroquinolonas gyrA Subunidad α DNA girasa > 90
gyrB Subunidad β DNA girasa NA
Capreomicina tlyA RNAr metiltransferasa NA
rrs RNAr 16S NA
Acido para-aminosalicilico thyA Timidilato sintetasa NA

31. Genotype MDRTBplus & MTBDRsl
Primers marcados
con biotina

32. GenoScan
GT Blot 48
Flujo de Trabajo
Software BLOTRIX

33. Identificación del Complejo M. tuberculosis y su resistencia a
Rifampicina y/o Isoniacida usando el Genotype MTBDRplus

34. Identificación del Complejo M. tuberculosis y su resistencia a
Fluoroquinolonas, Aminoglicósidos/Péptidos cíclicos y Etambutol usando
el Genotype MTBDRsl

35. GeneXpert MTB/RIF
35
 Test molecular automatizado que detecta MTB y
resistencia a RIF
 Usa un heminested Real Time PCR para amplificar la
secuencia del gen rpoB
 Utiliza la plataforma MTB/RIF (GeneXpert, Cepheid)
 Integra los procesos sonre la muestra y elPCR dentro de
un cartucho de plastico:
 Lisis de la bacteria (sonicación)
 Extracción de AND
 Amplificación y
 Detección del amplicón
 El resultado se obtiene
dentro de las 2 horas.

36. Boehme et al. N Engl J Med 2010;363:1005-15.
36

37. Pruebas rápidas en Perú
37
Prueba País n Sensi- Especifi- Valor Valor Concor
bilidad cidad predicti predictiv dancia
vo o
+ -
H R H R H R H R H R
GRIESS1 Perú 192 99,1 93, 100 100 100 100 98,7 92 99, 96,4
(Asencios) 5 5
MODS Perú 338 88, 100 99,6 100 98,2 100 96,4 100 nr nr
(Moore) 9
MTBDR plus Peru 208 97 99.1 98.7 95 nr nr nr nr 97.6 97.1
(Asencios)
GeneXpert Peru 741 na 97.6 na 98,1 na nr na nr na nr
(Boheme) y
otros
H: Isoniacida R: Rifampicina

38. Comparación de pruebas rápidas
38
Características GRIESS MODS MTBDR GeneXpert
plus
Esputo BK + + + + +
Esputo BK - - + -? +
Muestras extrapulmonares - +* - -
Cultivo de micobacterias + - + +
(indirecta)
Pacientes antes de inicio + + + +
de tratamiento
Pacientes en tratamiento o - - + +/-
fracaso
Tiempo de proceso (días) 14 – 21 5 – 21 1–2 <1
Identifica MTB - + + +
Costo por prueba, solo S/.8 S/.12 S/.30 S/.140
reactivos
Costo de equipamiento 48 000 53 000 100 000 25000
* Datos solo para diagnostico en LCR, líquido pleural, heces, no para susceptibilidad.
USD

39. Nuevas declaraciones de políticas de OMS
39
Respaldado por OMS No respaldado por OMS
GeneXpert (2010) Fagos
MODS (2010) Cultivo en agar de capa fina
NRA (2010)
Pruebas colorimétricas
(2010)
MTDRplus (2008)
Inno Lipa (2008)
WHO. Non-commercial culture and drug-susceptibility testing method for
screening of patients at rosk of MDR-TB. Policy Statement. (pre publication), Julio
de 2010.

40. 40

41. 41

42. 42

43. Interpretación de una prueba
43
 Caso 1.
 Niño de 10 años con BK ++, tío que vive en su casa tiene TB-
MDR confirmada
 Caso 2
 Mujer de 30 años, vive en zona residencial de Arequipa, tiene
BK de esputo +, sin factores de riesgo para TB-MDR, primer
episodio de TB
Probabilidad pre-test de que tengan TB-MDR:
Caso 1: 50%
Caso 2: 5%

44. En Arequipa existe MODS
44
Identificacion Método de
de TB-MDR proporciones en LJ
MODS Resistente Sensible Total
Resistente 40 1 41
Sensible 4 462 466
Total 44 463 507
Sensibilidad (%) 90.91 81.28 100.00
Especificidad (%) 99.78 99.25 100.00
Índice de validez (%) 99.01 98.06 99.97
Valor predictivo + (%) 97.56 91.62 100.00
Valor predictivo - (%) 99.14 98.20 100.00
Razón de verosimilitud + 420.91 59.28 2988.39
Razón de verosimilitud - 0.09 0.04 0.23

45. Nomograma de Fagan
Caso 1 Caso2
Rojo Azul
Pre: 50% Pre: 5%
Post +: 100% Post +: 83%
Post - : 5% Post -: 0,3%
45

46. Programa de diagnóstico rápido de
TB-MDR del INS
46
 Simultáneo con el cultivo  No se necesita aislamiento
 Menos demora primario, entonces
 Menor capacidad del  bajo costo
laboratorio  menor carga de trabajo
 No se manipulan cultivos
Método Griess MODS
medio solido (LJ) medio liquido (7H9)

47. LIBRE ACCESO A CONFERENCIAS
47
41 Conferencia Mundial de la IUATLD
Berlín 2010
http://uwclh.conference2web.com/content/all

48. 48
Méd. Alberto Mendoza
Instituto Nacional de Salud
Instituto de Biotecnología y Salud
Contacto:
mendozalberto@hotmail.com
mdrxdr@gmail.com
Web site: www.tbperu.org
Teléfonos:
9807-59549 / 617 6200 - 2143