Tecnologia do DNA recombinante e aplicações

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  • Tecnologia do DNA recombinante e aplicações

    1. 1. Tecnologia do DNA Recombinante & Aplicações
    2. 2. Identificação Genética - Fingerprinting
    3. 3. Complementaridade de Cadeias Tm Estringência
    4. 4. Clonagem Inserto
    5. 5. Amplicação do Clone em Bactéria
    6. 7. Utilizações do DNA Clonado
    7. 8. Utilizações do DNA Clonado
    8. 9. Retrotranscrição
    9. 10. Vetor & Inserto
    10. 11. Enzimas de Restrição
    11. 12. 4 bases
    12. 13. Corte & Ligação
    13. 14. Vetores <ul><li>Plasmídios </li></ul><ul><ul><li>Pequenos fragmentos circulares de DNA </li></ul></ul><ul><ul><li>Replicação independente do DNA bacteriano </li></ul></ul><ul><ul><li>Presença ou ausência dentro da bactéria </li></ul></ul><ul><ul><li>Quantidade variável </li></ul></ul><ul><ul><li>Resistência a drogas e outras características </li></ul></ul><ul><ul><li>Bom método para amplificar o DNA clonado </li></ul></ul><ul><ul><li>Fragmentos clonáveis até 20kb </li></ul></ul><ul><ul><li>Fragmentos grandes são perdidos </li></ul></ul><ul><ul><li>Plasmídios clássicos </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>pBR322 </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>pUC18 </li></ul></ul></ul>
    14. 15. Modos de introdução de DNA recombinante em bactérias.
    15. 16. Vetores: pBR322 & pUC18 Seleção de vetores com clone polylinker
    16. 17. Vetores <ul><li>Fago Lambda </li></ul><ul><ul><li>Acomoda um total de 45-50kb </li></ul></ul><ul><ul><li>Inserto de cerca de 15kb </li></ul></ul><ul><ul><li>DNA automaticamente embalado em partícula infectante </li></ul></ul><ul><li>Fagos Unifilamentares </li></ul><ul><ul><li>DNA unifilamentar é convertido dentro da bactéria para replicação </li></ul></ul><ul><ul><li>Facilidade para sequênciamento dos clones </li></ul></ul>
    17. 18. Fago Lambda
    18. 19. Detecção de Gene de Interesse – Plaqueamento de Fagos
    19. 20. Uso de sondas de DNA e RNA para identificar o clone portador do gene de interesse.
    20. 21. Vetores <ul><li>Cosmídios </li></ul><ul><ul><li>Híbridos de fago e plasmídio </li></ul></ul><ul><ul><li>Replicação em bactérias ou embalados como fagos </li></ul></ul><ul><ul><li>Sequências virais eliminadas permitindo introdução de DNA exógeno de até 45kb entre os sítios cos </li></ul></ul><ul><ul><li>Partícula viral penetra na bactéria, mas não tem potencial replicativo </li></ul></ul>
    21. 22. Vetores de Grande Porte <ul><li>BAC: Bacterial Artificial Chromosome </li></ul><ul><ul><li>Cromossomo Artificial de Bactéria </li></ul></ul><ul><ul><li>Inserto médio de 150kb </li></ul></ul><ul><ul><li>Inserto máximo de 400kb </li></ul></ul><ul><ul><li>Se replica como um plasmídio dentro da bactéria </li></ul></ul><ul><ul><li>Utilizado amplamento pelo Projeto Genoma </li></ul></ul>
    22. 23. Vetores de Grande Porte <ul><li>Cromossomo Artificial de Levedura </li></ul><ul><ul><li>Se comporta como um pequeno cromossomo que se replica dentro do eucarionte e carrega seu DNA de interesse </li></ul></ul><ul><ul><li>Tamanho médio do inserto: 500Kb </li></ul></ul><ul><ul><li>Tamanho máximo do inserto: 1Mb </li></ul></ul><ul><ul><li>Contém todas os elementos necessários para se replicar e segregar dentro da levedura </li></ul></ul>
    23. 24. Cromossomo Artificial de Levedura
    24. 25. Introdução de DNA Exógeno DNA Shotgun
    25. 26. Polimerase Chain Reaction - PCR
    26. 36. Gel de Agarose
    27. 37. Southern e Northern Blots
    28. 44. Mapas de Restrição - RFLP
    29. 46. Sequenciamento Capilar - Eletroferograma
    30. 51. Manipulação em Cultura de Células e Semeadura
    31. 53. Produção de Camundongos Transgênicos
    32. 57. Transgênico para Hormônio do Crescimento
    33. 61. Diagnóstico Pré-Natal

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