Vacinas gênicas
mrodrigues@ecb.epm.br
História
 1774- Benjamin Jetsy / Fazendeiro
 The Dorset / England
 Imunizou seus 2 filhos e sua esposa com
“cowpox” a f...
Prevenção
Epidemiologia Patogênese
Imunologia Quimioterapia
Importância das vacinas no
controle e erradicação de doenças infecciosas
 Método preventivo
 Redução rápida da transmiss...
Características de uma vacina efetiva
 Segura
 Capaz de induzir altos níveis de proteção
 Induzir níveis de proteção du...
Efeito da vacinação contra poliomielite no Brasil
Anos (Ministério da Saúde)
1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 ...
Efeito da vacinação contra poliomielite no mundo
Composição químicas da vacinas existentes
- Vírus vivos atenuados
- Vírus inativados
- Bactérias vivas atenuadas
- Bactéri...
Vírus vivos atenuados
 Anti-varíola
 Anti-febre amarela
 Anti-caxumba
 Anti-poliomielítica (Oral
Sabin)
 Anti-rubéola...
Toxóides  Anti-tétano
 Anti-diftérica
Polissacarídeos
 Anti-H. influenza do tipo b
 Anti-meningocócica
 Anti-pneumocó...
 Vantagens
 Múltiplos antígenos
 Simples produção
 Baixo custo relativo
 Desvantagens
 Formulação antigênica
complex...
Razões que dificultam a geração de uma vacina
contra alguns microrganismos patogênicos
 Ausência de cultura axênica
 Nec...
Possíveis soluções para a produção de
antígeno vacinas sintéticas
 Peptídios Sintéticos
 Proteínas recombinantes
 Micro...
RESEARCH PRIORITIES FOR PRODUCTION OF NEW
AND IMPROVED VACCINES
 hepatitis types A, B, C, and D
 enteric pathogens inclu...
Doenças
Vacina recombinante ideal
 Múltiplos antígenos
 Antígenos expressos em diferentes fase
do parasito
 Composta de antígen...
Direcionamento da pesquisa
 Determinação dos mecanismos imunológicos de
proteção
 Isolamento dos genes que codificam par...
E como foram definidos os mecanismos
imunológicos de proteção?
 Transferência passiva de imunidade
 Anticorpos monoclona...
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Sistemas de expressão de proteínas
recombinantes
 Procariotos (E.coli)
 Eucariotos - Leveduras (...
Vacina contra hepatite B recombinante
Antígeno S
Purificação
Levedura
Plasmídio
Vacina
Gene ag S
Proteína
Antígeno S da Hepatite B
Partícula
Membranosa
Anticorpos
Vacinas recombinantes contra a hepatite B
Engerix-B SmithKline Beecham/US
Recombivax HB Merck/US
GenHevac B Pasteur/France...
VÍRUS RECOMBINANTES
Vacinas gênicas
VACINAS DE DNA
Vetores preparados para transferir genes
DNA
Vírus
Selvagem
Gene
exógeno
Célula hospedeira
Proteína
recombinante
Vírus
Recombinante
Vírus recombinantes
Geração de vírus recombinantes
Vírus utilizados
 Vaccinia (vacina contra varíola)
 Influenza (vacina contra gripe)
 Adenovirus (vacina contra infecção...
Estrutura dos flavivírus
Dímero da proteína do
envelope
Modelo estrutural de um dímero da proteína
do envelope do vírus da Febre Amarela
Bonaldo et al. (2002)Epítopos exógeno
Estrutura do vírus influenza
hemaglutinina do
vírus da influenza
Estrutura do vírus
vaccinia
Estrutura do Adenovírus
Formas de inoculação
 Sub-cutânea
 Intra-muscular
 Por via de mucosas
Propriedades adjuvantes
 Interferons
 IL-6
 Outros?
Imunização com vírus recombinantes
Anticorpos Linfócitos T
CD4 TH1
Linfócitos T
CD8
Vírus recombinante
•Já usado como vacina
•Produção em larga escala
•Diversos tipos de resposta
imune
•Grande quantidade de...
VACINAS DE DNA
Plasmídio
vetor de
expressão
Gene
exógeno
Promotor forte
Citomegalovírus
Cauda Poli-A
Formas de inoculação
 Sub-cutânea
 Intra-muscular
 Por via de mucosas
Micro-bombardeamento com partículas (“gene gun”)
Microenhancer array
Propriedades adjuvantes
 Interferons
 IL-12
 Outros?
Núcleo
Proteína
ExógenaCélula hospedeira
Plasmídio epissomal
Injeção intra-
muscular de
DNA plasmidal
marcado com
rodamina
DNA plasmidial Núcleo Overlay
Expressão da proteína exógena após
imunização intramuscular
b-galactosidase
Expressão da proteína exógena após injeção s.c.
GFP
b-galactosidase
Imunização com DNA
Anticorpos Linfócitos T
CD4 TH1
Linfócitos T
CD8
Vacinas de DNA
 Sem proteína
 Grande quantidade de informação
genética
 Vários tipos de resposta imune
 Produção da pr...
Immunização com DNA no homem?
Hepatitis B DNA vaccine induces protective antibody
responses in human non-responders to con...
Linfócitos T CD8 ab
Restritas por MHC classe I
1996
Nobel Prize of Medicine:
Peter C. Doherty and
Rolf Zinkernagel
Citotóx...
MCH classe I + peptídeo MCH classe II + peptídeo
Linfócitos T CD8 ab Linfócitos T CD4 ab
Cutting edge:
CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their
proliferative responses.
Foulds KE, Zenewicz LA, Sh...
107 linfócitos T CD8
específicos por baço
105 linfócitos T CD4
específicos por baço
Durante a infecção experimental por LC...
Durante a infecção experimental por LCMV
Células CD8 de memória
Apoptose da célula alvo infectada
Mecanismos efetores mediados por linfócitos T CD8
Lise da célula alvo infectada
Secreção...
Vírus (HIV, etc)
Patógenos cuja a imunidade mediada por CD8 é crítica
Bactérias (M. tuberculosis, etc.)
Protozoários intra...
Vírus HIV
Gag
PolGenoma viral
Env
Diferentes estratégias para a indução
de linfócitos T CD8 específicos
 Vírus Recombinante
(DNA or RNA)
 DNA plasmidial
...
Rodrigues et al., 1994 and Miyahiara et al., 1995
ELISPOT for detection of peptide-specifc CD8 T cells.
Tetramer/Pentamer staining for
detection of peptide-specifc CD8 T cells
 D=DNA plasmidial
 V=Vaccinia
 A=Adenovírus
Prime-boost heterólogo e ativação de linf. T CD8
DNA plasmidial
Vaccinia recombinante : MVA
DNA plasmidial +CRL (adjuvante)
Adenovirus (Ad5) recombinante
DNA plasmidial +M...
DNA MVA
DNA+CRL Ad5
DNA+MPL
DNA+CRL / Ad5DNA+CRL / MVA
Freqüência de linfócitos T CD8 específicos
Céls. CD4 RNA Viral no Plasma
Controle
DNA
DNA+CRL
DNA+MPL
MVA
Ad5
Control
DNA+CRL/MVA
DNA+CRL/Ad5
DNA MVA SHIV DNA MVA SHIV
Carga viral (RNA no plasma) Contagem de CD4 no sangue
Controles
Controles
Desafio = intrarrectal
A Randomised, Double-Blind, Controlled Vaccine Efficacy
Trial of DNA/MVA ME-TRAPAgainst Malaria Infection in
Gambian Adult...
Recombinant virus against malaria
(Clinical trials = humans)
2005
http://www.vacinashiv.unifesp.br/
Conclusões
 Conhecimento básico para o desenvolvimento de vacinas
recombinantes
 Conhecimento importante dos mecanismos ...
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Vacinas gênicas

  1. 1. Vacinas gênicas mrodrigues@ecb.epm.br
  2. 2. História  1774- Benjamin Jetsy / Fazendeiro  The Dorset / England  Imunizou seus 2 filhos e sua esposa com “cowpox” a fim de evitar a varíola  1796- Edward Jenner / Médico  Gloucestershire / England  Imunizou uma criança chamada James Phipps
  3. 3. Prevenção Epidemiologia Patogênese Imunologia Quimioterapia
  4. 4. Importância das vacinas no controle e erradicação de doenças infecciosas  Método preventivo  Redução rápida da transmissão  Relação benefício-custo alta  Erradicação da varíola no mundo
  5. 5. Características de uma vacina efetiva  Segura  Capaz de induzir altos níveis de proteção  Induzir níveis de proteção duradouros  Induzir anticorpos neutralizantes  Induzir linfócitos T efetores  Baixo custo  Estabilidade  Fácil administração  Poucos ou nenhum efeitos colaterais
  6. 6. Efeito da vacinação contra poliomielite no Brasil Anos (Ministério da Saúde) 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 Incidênciadepolimielitepor 100.000habitantes 0 20 40 60 80 100 Coberturadavacina(%) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
  7. 7. Efeito da vacinação contra poliomielite no mundo
  8. 8. Composição químicas da vacinas existentes - Vírus vivos atenuados - Vírus inativados - Bactérias vivas atenuadas - Bactérias mortas - Toxóides - Polissacarídeos - Componentes antigênicos - obtidos por engenharia genética
  9. 9. Vírus vivos atenuados  Anti-varíola  Anti-febre amarela  Anti-caxumba  Anti-poliomielítica (Oral Sabin)  Anti-rubéola  Anti-sarampo Vírus inativados  Anti-poliomielítica injetável (Salk)  Anti-rábica  Anti-Tuberculose (BCG)Bactérias vivas atenuadas Bactérias mortas  Anti-colérica  Anti-coqueluche  Anti-febre tifóide
  10. 10. Toxóides  Anti-tétano  Anti-diftérica Polissacarídeos  Anti-H. influenza do tipo b  Anti-meningocócica  Anti-pneumocócica Componentes antigênicos obtidos por engenharia genética  Anti-hepatite B
  11. 11.  Vantagens  Múltiplos antígenos  Simples produção  Baixo custo relativo  Desvantagens  Formulação antigênica complexa  Toxicidade  Resposta imune complexa Vacinas convencionais
  12. 12. Razões que dificultam a geração de uma vacina contra alguns microrganismos patogênicos  Ausência de cultura axênica  Necessidade de grande suprimento de células humanas para o crescimento in vitro  Alto custo  Alto risco
  13. 13. Possíveis soluções para a produção de antígeno vacinas sintéticas  Peptídios Sintéticos  Proteínas recombinantes  Microrganismos geneticamente modificados  Vacinas de DNA
  14. 14. RESEARCH PRIORITIES FOR PRODUCTION OF NEW AND IMPROVED VACCINES  hepatitis types A, B, C, and D  enteric pathogens including rotavirus, shigella, and cholera  sexually transmitted diseases (genital herpes, gonorrhea, and chlamydia)  croup and pneumonia in infants and children caused by respiratory syncytial virus  AIDS  respiratory diseases caused by pneumococcus  group B streptococcus  influenza  malaria  tuberculosis  Ieprosy
  15. 15. Doenças
  16. 16. Vacina recombinante ideal  Múltiplos antígenos  Antígenos expressos em diferentes fase do parasito  Composta de antígenos com um polimorfismo limitado  Capaz de induzir múltiplos tipo de resposta imune protetora  Alta eficácia e baixo custo
  17. 17. Direcionamento da pesquisa  Determinação dos mecanismos imunológicos de proteção  Isolamento dos genes que codificam para antígenos destes microrganismos  Identificação de epítopos relevantes e com baixa variação antigênica entre as cepas
  18. 18. E como foram definidos os mecanismos imunológicos de proteção?  Transferência passiva de imunidade  Anticorpos monoclonais  Clones de linfócitos T CD4 ou CD8
  19. 19. PROTEÍNAS RECOMBINANTES Sistemas de expressão de proteínas recombinantes  Procariotos (E.coli)  Eucariotos - Leveduras (S. cerevisae)  Baculovírus
  20. 20. Vacina contra hepatite B recombinante Antígeno S Purificação Levedura Plasmídio Vacina Gene ag S Proteína
  21. 21. Antígeno S da Hepatite B Partícula Membranosa Anticorpos
  22. 22. Vacinas recombinantes contra a hepatite B Engerix-B SmithKline Beecham/US Recombivax HB Merck/US GenHevac B Pasteur/France •Mais de 1 bilhão de doses (1982-presente). •Produzida em leveduras (S. cerevisiae)
  23. 23. VÍRUS RECOMBINANTES Vacinas gênicas VACINAS DE DNA Vetores preparados para transferir genes
  24. 24. DNA Vírus Selvagem Gene exógeno Célula hospedeira Proteína recombinante Vírus Recombinante Vírus recombinantes
  25. 25. Geração de vírus recombinantes
  26. 26. Vírus utilizados  Vaccinia (vacina contra varíola)  Influenza (vacina contra gripe)  Adenovirus (vacina contra infecção por adenovirus)  Vírus da Pólio (vacina contra pólio)  Vírus da febre amarela (vacina contra febre amarela).
  27. 27. Estrutura dos flavivírus Dímero da proteína do envelope
  28. 28. Modelo estrutural de um dímero da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela Bonaldo et al. (2002)Epítopos exógeno
  29. 29. Estrutura do vírus influenza hemaglutinina do vírus da influenza
  30. 30. Estrutura do vírus vaccinia Estrutura do Adenovírus
  31. 31. Formas de inoculação  Sub-cutânea  Intra-muscular  Por via de mucosas
  32. 32. Propriedades adjuvantes  Interferons  IL-6  Outros?
  33. 33. Imunização com vírus recombinantes Anticorpos Linfócitos T CD4 TH1 Linfócitos T CD8
  34. 34. Vírus recombinante •Já usado como vacina •Produção em larga escala •Diversos tipos de resposta imune •Grande quantidade de Informação (vírus de DNA) •Limitação da quantidade a ser inoculada •Limitação da quantidade de antígeno produzido •Pouca antigenicidade Vantagens Desvantagens
  35. 35. VACINAS DE DNA Plasmídio vetor de expressão Gene exógeno Promotor forte Citomegalovírus Cauda Poli-A
  36. 36. Formas de inoculação  Sub-cutânea  Intra-muscular  Por via de mucosas
  37. 37. Micro-bombardeamento com partículas (“gene gun”)
  38. 38. Microenhancer array
  39. 39. Propriedades adjuvantes  Interferons  IL-12  Outros?
  40. 40. Núcleo Proteína ExógenaCélula hospedeira Plasmídio epissomal
  41. 41. Injeção intra- muscular de DNA plasmidal marcado com rodamina DNA plasmidial Núcleo Overlay
  42. 42. Expressão da proteína exógena após imunização intramuscular b-galactosidase
  43. 43. Expressão da proteína exógena após injeção s.c. GFP b-galactosidase
  44. 44. Imunização com DNA Anticorpos Linfócitos T CD4 TH1 Linfócitos T CD8
  45. 45. Vacinas de DNA  Sem proteína  Grande quantidade de informação genética  Vários tipos de resposta imune  Produção da proteína “in situ”  Simples, estável e de baixo custo relativo  Sistema novo e pouco conhecido  Possibilidade de integração do vetor de expressão no genoma Vantagens Desvantagens
  46. 46. Immunização com DNA no homem? Hepatitis B DNA vaccine induces protective antibody responses in human non-responders to conventional vaccination. Rottinghaus ST, Poland GA, Jacobson RM, Barr LJ, Roy MJ. Department of Internal Medicine, Mayo Clinic, 55905, Rochester, MN, USA Vaccine. 2003. 21:4604-8.
  47. 47. Linfócitos T CD8 ab Restritas por MHC classe I 1996 Nobel Prize of Medicine: Peter C. Doherty and Rolf Zinkernagel Citotóxicos para células infectadas por vírus
  48. 48. MCH classe I + peptídeo MCH classe II + peptídeo Linfócitos T CD8 ab Linfócitos T CD4 ab
  49. 49. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. Foulds KE, Zenewicz LA, Shedlock DJ, Jiang J, Troy AE, Shen H. J Immunol. 2002 Feb 15;168(4):1528-32. Linfócitos T CD8 proliferam e se diferenciam mais rápido que linfócitos T CD4
  50. 50. 107 linfócitos T CD8 específicos por baço 105 linfócitos T CD4 específicos por baço Durante a infecção experimental por LCMV
  51. 51. Durante a infecção experimental por LCMV Células CD8 de memória
  52. 52. Apoptose da célula alvo infectada Mecanismos efetores mediados por linfócitos T CD8 Lise da célula alvo infectada Secreção de linfocinas (Interferon-g, TNF, quimiocinas, etc.)
  53. 53. Vírus (HIV, etc) Patógenos cuja a imunidade mediada por CD8 é crítica Bactérias (M. tuberculosis, etc.) Protozoários intracelulares (Plasmodium, T. cruzi, Toxoplasma)
  54. 54. Vírus HIV Gag PolGenoma viral Env
  55. 55. Diferentes estratégias para a indução de linfócitos T CD8 específicos  Vírus Recombinante (DNA or RNA)  DNA plasmidial  Combinação (prime-boost heterólogo)
  56. 56. Rodrigues et al., 1994 and Miyahiara et al., 1995 ELISPOT for detection of peptide-specifc CD8 T cells.
  57. 57. Tetramer/Pentamer staining for detection of peptide-specifc CD8 T cells
  58. 58.  D=DNA plasmidial  V=Vaccinia  A=Adenovírus
  59. 59. Prime-boost heterólogo e ativação de linf. T CD8
  60. 60. DNA plasmidial Vaccinia recombinante : MVA DNA plasmidial +CRL (adjuvante) Adenovirus (Ad5) recombinante DNA plasmidial +MPL (adjuvante) DNA plasmidial +CRL / Ad5 DNA plasmidial +CRL / MVA  Vírus Recombinante (DNA)  DNA plasmidial  Combinação (prime-boost heterólogo) Vacinação experimental de macacos contra a infecção por SHIV
  61. 61. DNA MVA DNA+CRL Ad5 DNA+MPL DNA+CRL / Ad5DNA+CRL / MVA Freqüência de linfócitos T CD8 específicos
  62. 62. Céls. CD4 RNA Viral no Plasma Controle DNA DNA+CRL DNA+MPL MVA Ad5 Control DNA+CRL/MVA DNA+CRL/Ad5
  63. 63. DNA MVA SHIV DNA MVA SHIV Carga viral (RNA no plasma) Contagem de CD4 no sangue Controles Controles Desafio = intrarrectal
  64. 64. A Randomised, Double-Blind, Controlled Vaccine Efficacy Trial of DNA/MVA ME-TRAPAgainst Malaria Infection in Gambian Adults Vasee S. Moorthy, Egeruan B. Imoukhuede, Paul Milligan, Kalifa Bojang, Sheila Keating, Pauline Kaye, Margaret Pinder, Sarah C. Gilbert, Gijs Walraven, Brian M. Greenwood, Adrian S. V. Hill. http://www.malaria-vaccines.org.uk/
  65. 65. Recombinant virus against malaria (Clinical trials = humans) 2005
  66. 66. http://www.vacinashiv.unifesp.br/
  67. 67. Conclusões  Conhecimento básico para o desenvolvimento de vacinas recombinantes  Conhecimento importante dos mecanismos imuno-protetores contra microrganismos patogênicos  Já existe várias vacinas comerciais contra hepatite B  Existem várias vacinas recombinantes sendo testadas. Os estudos para o desenvolvimento de vacinas recombinantes têm trazido:

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