Slides Micro

1. Funghi opportunisti

2. PATOGENI OPPORTUNISTI
Absidia corymbifera
Aspergillus fumigatus
Candida albicans
Crytococcus neoformans
Pneumocystis carinii
Rhizomucor pusillus
Rhizopus oryzae (R.arrhizus)

3. Candida albicans
è un fungo dimorfico

4. CANDIDOSI
• Provocate da Candida albicans e altre candida
spp. che costituiscono la normale flora nella
bocca, sulla pelle, nella vagina e nell’intestino
• Può manifestarsi in seguito a trattamenti con
antibiotici che sopprimono la normale flora
batterica e ne permettono una crescita maggiore

5. Infezioni sistemiche da
Candida si manifestano
• In pazienti fortemente debilitati (es. cancro)
• In diabetici
• In pazienti sottoposti a chemioterapia
• Soggetti sottoposti a trapianto
(immunosoppressi)
• Nei leucemici
• Nei malati di AIDS

6. Terapia orale-fluconazolo etc

7. La transizione
lievito ife
in vitro viene indotta da:
•Aumento della temperatura (25° → 37°C)
•Aumento del pH del mezzo (acido → basico)
•Limitazione dei nutrienti (es. glucosio)
•Siero

8. IFE: pH 7.0 / 37°C

9. GERM TUBES

10. 4-6 MICRONS

11. Pseudoifa
Clamidospore

12. DIAGNOSI
di Candida albicans

13. 1. Osservazione macroscopica
• Candida: piastra dopo 24 ore
Colonie: inizialmente bianche, cremose, brillanti
poi diventano rugose

14. 2. Osservazione microscopica
• Forma:
rotondeggiante - ovale
• Blastospore
• Presenza di Pseudoife

15. 3. Tests specifici
• Test di blastèse:
Mette in evidenza i tubi germinativi: filamenti che si formano
a partire dalle blastospore (nessun restringimento alla
base)
• Ricerca di clamidospore:
Spore (endosporulazione) sferiche o ovali prodotte in
condizioni avverse.

16. 3.1. Test di blastèse:
Agitare
Incubare 3h a
37°C
Coltura 1 ml
liquida siero

18. 3.2. Ricerca di clamidospore
Una goccia Mettere un vetrino
di coltura
Incubare
24 - 48h
a 28°C
Guardare al
Terreno a microscopio
base di mais

21. Isolamento in Candida albicans
di geni differenzialmente
espressi mediante DDRT-PCR

22. Isolamento di geni differenzialmente
espressi mediante DDRT-PCR

23. Omologia di CaGS con trasportatori
e sensori di glucosio
Identità Similarità Tipo di proteina Organismo
47% 67% Snf3p S.cerevisiae
46% 67% Rgt2p “
47% 65% Rag4 K.lactis
44% 61% Rco3 N.crassa
35% 59% Hxt2 S.cerevisiae
33% 60% CaHgt1 C.albicans
E’ presente la sequenza consensus tipica dei trasportatori e sensori
per il glucosio: 334-[-G-I-i-l-V-E-t-W-G-R-R-p-l-l-m-a-g-S-]-351

24. Distruzione del gene mediante la
tecnica della cassetta

25. Reinserimento del gene CaGS nel locus di origine
null mutant PstI PstI PstI
ura -/-
HisG
Afl III ATG TAA Afl II
CaGS
URA3
PCR2

26. Analisi per Southern

CAI12 T1 T3 T5
A
CaGS
1600 nt
Analisi per Northern
B
rRNA

27. Analisi del fenotipo
su piastra
CAI12 T1 T3 T5
etero null revert
YNB/2% gl.
+ 10% siero
YNB/0.1%gl.
+ 10% siero
H2O
+ 10% siero
M0199
pH 7.5

28. Infezione dei macrofagi
CAI12 T1 T3

29. Aspergillus
specie (185), raccolte in ben 18 gruppi
muffe ubiquitarie

30. Aspergillus fumigatus
Ife settate di A. fumigatus
che si diramano
dicotomicamente in un
campione di tessuto

31. Aspergillus fumigatus
Può riprodursi fino a 50°C : uccelli infezioni
mortali (in particolare A. fumigatus).
Nei rifiuti organici quando la T ↑, gli
aspergilli coltura pura.
miceli simili a polvere verde-bluastro:
fumigatus (latino fumoso).
I conidiofori lunghezza di 500um, conidi
formano catene parallele verdastri
(Aspergillus in latino significa spazzola)

32. Aspergillosi

33. Aspergillosi
L’invasione del tessuto polmonare è limitata a soggetti immunodepressi.

34. Aspergillus fumigatus
Fattori di Virulenza
•dimensioni del tallo fungino maggiori di quelle delle
cellule fagocitarie
•dimensioni della spora 2 a 3 µm
•l’energia meccanica del conidio in germinazione
•Micotossine

35. Micotossine
Le micotossine (un gruppo di circa 100 sostanze)
metaboliti secondari di alcuni funghi filamentosi
Aspergillus sp Penicillium sp Fusarium sp

36. Alimenti per lattanti e prima infanzia
Regolamento N. 683/2004
aflatossina B1 0,10 µg/kg
aflatossina M1 0,025 µg/kg
ocratossina A 0,50 µg/kg

37. Aspergillosi
TERAPIA
Il trattamento con Amfotericina B è incoraggiante.

38. Una sostanza antifungina ottimale
dovrebbe avere...
• Un ampio spettro di attività
• Proprietà farmacocinetiche
ottimali HOST FUNGUS
• Adeguata efficacia in vivo
• Bassa tossicità
• Basso costo
DRUG

39. Al momento esistono solo
Fungistatici Tossici
se somministrati
per lunghi periodi
• Amphotericin B
• Nystatin
• Ketoconazole
• Fluconazole
• Itraconazole

40. Candida è in grado di sopravvivere
adattandosi agli ambienti più ostili,
come quello all’interno dei macrofagi
•Regolazione dell’espressione genica
•Secrezione di proteinasi (SAP)
•Produzione di ife

41.  Isolamento di geni differenzialmente espressi
durante l’infezione dei macrofagi
 Studio della funzione dei geni isolati, per
poter individuare potenziali antifungini sui prodotti
proteici

42. Amphotericin B
Meccanismo di Azione

43. Azoles
• Azoles
Imidazoles Triazoles
• Causes Inhibition of
C-14 α demethylase,
(an enzyme required
for the synthesis of
ergosterol) by binding
to cytochrome P450

44. Imidazolo

45. Allyamines
• Inhibits squalene
epoxidase, an enzyme
essential for synthesis
of ergosterol
• Drug acculmulates in
nails, skin and fat
• Very useful for nail
infections

46. Polyenes
• Amphotericin, nystatin
• Antifungal activity by
binding to membrane
sterols such as
ergosterol and they
increase membrane
permeability and leads
to cell death

47. Amphotericin B
è in uso clinico dal 1960
• Un poliene macrolide
• Isolato dallo
Streptomyces nodosus
• Insolubile in acqua
• Solubilizzato in sodio
deossicolato

48. Amphotericin B
é attiva in vitro contro
• Candida spp.
(incluse le specie azolo-resistenti)
• Aspergillus spp.
• Cryptococcus neoformans
• Mucor spp.
• Blastomyces dermatitidis
• Coccidioides immitis
• Histoplasma capsulatum
• Paracoccidioides brasiliensis

49. Ridotta suscettibilità
(resistenza) all’ amphotericin B
• C. lusitaniae • S. apiospermum
• C. krusei • Fusarium spp.
• C. neoformans • C. carrionii
• Trichosporon spp. • F. pedrosoi
• A. terreus • ...
Walsh et al. JCM 1990; 28: 1616
Sutton et al. JCM 1999; 37: 2343
Arikan et al. JCM 1999; 37: 3946
Arikan et al. JCM 2002; 40: 1406

50. Resistenza all’ Amphotericin B
• Resistenza all’ amphotericin B è
frequentemente osservata in vivo
• Generalmente è dovuta ad una riduzione
dell’attività del sistema immunitario

51. Amphotericin B
 Amphotericin B è tossica
Effetti collaterali dell’ AmB
Nefrotossicità
Disfunzioni epatiche
Anemia,..