Bachelorarbeit_Veselina

Lipase – katalysierte Veresterung von
Sonnenblumenöl - Fettsäure und Glycerin im
Blasensäulenreaktor
Veselina Uzunova
Bachelorarbeit
Institut für Technische Biokatalyse
August, 2011
Prüfer: Prof.Dr.rer.nat.Andreas Liese
Betreuer: Dipl.-Ing.Britta Lämmerhirt

Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die
angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Wörtlich oder dem Sinn nach aus anderen
Werken entnommene Stellen sind unter Angabe der Quellen kenntlich gemacht.
Hamburg, August 2011
Veselina Uzunova

Danksagung
Die vorliegende Diplomarbeit entstand am Institut für Technische Biokatalyse der Technischen
Universität Hamburg Harburg. An dieser Stelle möchte ich allen meinen herzlichen Dank
aussprechen, die mich bei dieser Arbeit gefördert und unterstützt haben.
Mein besonderer Dank gilt zunächst Herrn Prof. Dr. rer. nat. Andreas Liese für die Überlassung
des interessanten Themas meiner Bachelorarbeit sowie für seine menschliche, optimistische und
fachliche Unterstützung während der gesamten Arbeit. Seine stete Bereitschaft zur Diskussion
und seine Geduld haben zum Fortgang der Arbeit entscheidend beigetragen.
Mein Dank gilt Lutz Hilterhaus und Britta Lämmerhirt für die hervorragende Betreuung, die
Unterstützung und die Durchsicht dieser Arbeit. Ihre Hilfsbereitschaft sowie ihre
praxisbezogenen Hinweise waren entscheidend für eine erfolgreiche Erarbeitung meiner Arbeit.
Danke!
Und nicht zuletzt gilt mein Dank von ganzen Herzen meiner Familie und meinen Freunden für
die immerwährende Unterstützung.

Inhaltsverzeichnis
Symbolverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnes
1. Einleitung............................................................................................................................1
1.1. Motivation................................................................................................................1
1.2. Ziel der Bachelorarbeit............................................................................................3
2. Theoretische Grundlagen..................................................................................................4
2.1. Biokatalyse...............................................................................................................4
2.1.1. Wirkungsmechanismus von Enzymen.........................................................6
2.1.2. Lipasen (EC 3.1.1.3)....................................................................................7
2.1.3. Novozym 435...............................................................................................9
2.1.4. Grenzflächenaktivierung von Lipasen.........................................................9
2.2. Fetten und Fettsäuren.............................................................................................10
2.3. Glycerine 4833 – Glycerine 1.262.........................................................................11
2.4. Reaktorkonzepte zur Veresterung..........................................................................11
2.4.1. Mehrphasige Reaktorkonzepte...................................................................11
2.4.2. Lösungsmittelfreier Betrieb.......................................................................12
2.4.3. Rührkesselreaktor......................................................................................16
2.4.4. Blasensäulenreaktor...................................................................................16
3. Materialien und Methoden..............................................................................................17
3.1. Materialien.............................................................................................................17
3.1.1. Chemikalien...............................................................................................17
3.1.2. Geräte.........................................................................................................20
3.2. Methoden...............................................................................................................21
3.2.1. Veresterung im Rührkesselreaktor.............................................................21

3.2.2. Veresterung im Blasensäulenreaktor.........................................................22
3.2.3. Säurezahlbestimmung durch Titration.......................................................23
3.2.4. Aminosäureanalyse…………………………............................................24
4. Experimentelle Ergebnisse und Diskussion...................................................................26
4.1. Veresterung im Rührkesselreaktor.........................................................................26
4.2. Veresterung im Blasensäulenreaktor.....................................................................28
4.2.1. Repetiven Batches......................................................................................29
4.2.2. Einfluss der Enzymmenge.........................................................................36
4.2.3. Einfluss der Begasungsrate........................................................................38
4.2.4. Einfluss der Temperatur.............................................................................40
4.3. Vergleich des Rührkesselreaktor mit dem Blasensäulenreaktor............................42
5. Diskussion und Ausblick.................................................................................................45
6. Zusammenfassung...........................................................................................................46
Literaturverzeichnis....................................................................................................................48

Symbolverzeichnis
Abkürzungen: Bedeutung
3D dreidimensional
Abb. Abbildung
Acetyl-CoA Acetyl Coenzym A
Ala Alanin
ATP Adenosin triphosphat
AS Aminosäure
Asp. Asparagin
BA Biogene Amine
BC Blasensäulenreaktor (Bubble column)
CALB Candida antarctica Lipase B
cmc Kritische Mizellbindungskonzentration
EC Enzymklasse (enzyme class)
His. Histidin
IC Ionen-Chromatographie
KBH4 Kaliumborhydrid
LDH Lactatdehydrogenase
Leu Leucin
ME 2-Mercaptoethanol
MPA 3-Mercaptopropionsäure
OPA ortho-Phthaldialdehyd
Ser. Serin
STR Rährkesselreaktor (stirred tank reactor)
Thr Threonin
tRNA Transfer-RNA
Val Valin

Formelzeichen: Bedeutung
C Konzentration [mol/l]
Cth theoretische Konzentration [g/mol]
relativer Phasenanteil [-]
g Gravitation [m/s2
]
KL Stoffübergangskoeffiziente [s-1
]
Kdeakt Deaktivierungsrate [1/h]
L Länge des Reaktors [m]
m Masse [g]
mth theoretische Masse [g]
M Molare Masse [g/mol]
n Menge [mol]
nth theoretische Menge [mol]
P Energieeintrag
Dichte [kg/m3
]
SZ Säurezahl [-]
SZth theoretische Säurezahl [-]
T Temperatur [ ] oder [K]
t1/2 Halbwertszeit [h]
to Zeit zu Beginn der Messung [h]
t1 Zeit zu am Ende der Messung [h]
V Volumen [ml]
Volumenstrom [L.min-1
]
Vo Enzymaktivität zu Beginn der Messung [U]
V1 Enzymaktivität am Ende der Messung [U]
X Umsatz [-]

Index Bedeutung
G Gasphase
F Fluoreszenz
K Katalysator
L Flüssigphase
P Partikel
R Reaktor
S Festphase

Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1 Hydrolyse und Estersynthese mit Lipase[Schmid, R.D,1998]..............................[2]
Abb. 2.1 Energiediagramm einer enzymkatalysierten (- - -) im Vergleich zu einer
unkatalysierten (—) Reaktion [Karlson et.al,1994]...............................................[5]
Abb. 2.2 Reaktionsschema der Lipase-katalysierten Reaktion: Hydrolyse und Synthese von
Triglyceriden (R1 − R3 entsprechen den Fettsäureresten) [Biochemie,Nova Print
AD, 2006]..............................................................................................................[7]
Abb. 2.3 (A) 3D-Struktur der CALB mit Van-der-Waals-Oberfläche, Vergrößerung des
aktiven Zentrums mit Butylpropionat und den Aminosauren der katalytischen
Triade, erstellt mit Pymol (Version 0.98 Delano- Scientific); (B) Reaktionsschema
der lipasenkatalysierten Hydrolyse [Buthe, A. (2006)].........................................[8]
Abb. 2.4 Kristallstrukturanalyse von Lipase B aus Candida antarctica [Jena Bioscience,
2009]......................................................................................................................[9]
Abb. 2.5 Grenzflächenaktivierung - Lipaseaktivität in Abhängigkeit der
Substratkonzentration; cmc = kritische Mizellbildungskonzentration................[10]
Abb. 2.6 Struktur von Glycerin..........................................................................................[11]
Abb. 2.7 Schematische Darstellung von Blasensäulenreaktor (BS) und Rührkesselreaktor
(STR)...................................................................................................................[12]
Abb. 2.8 Schematische Darstellung der vier an der Umsetzung beteiligten Phasen:
Novozym 435 (S), Fettsäure (L1), Glycerin (L2) und Gas (G) [Hilterhaus,
L.,2008]...............................................................................................................[13]
Abb. 2.9 Schematische Darstellung der möglichen Strömungsformen in Blasensäulen
[Kantarci et al., 2005]..........................................................................................[14]
Abb. 2.10 Strömungsbereiche in Blasensäulen [Ewert et al.,2009].....................................[15]
Abb. 3.1 Schematische Darstellung von Rührkesselreaktor (STR):1-STR mit Rührer; 2-
Thermostat; 3-Vakuumpumpe.............................................................................[21]
Abb. 3.2 Schematische Darstellung von Blasensäulenreaktor (BC):1-BC; 2-Thermostat; 3-
Sollwertgeber FWE.............................................................................................[22]

Abb. 3.3 Reaktionsschema der primären AS mit OPA in Gegenwart von achiralen und
chiralen Thiolverbingungen [Baek, G., 1999].....................................................[24]
Abb. 4.1 Thermostatisierter Rührkesselreaktor (STR) mit Evaporation des
Reaktionswassers, Auffangen des Wassers im Kondensatsammler und
Druckmessung zur Veresterung von Glycerin mit Fettsäuren (Sonnenblumenöl)
mit Hilfe von Novozym 435................................................................................[26]
Abb. 4.2 Säurezahlkurve bei der Veresterung im Rührkesselreaktor mit Hilfe von Novozym
435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3%
(w/wS) Biokatalysator, 60o
C, 65 rpm..................................................................[27]
Abb. 4.3 Umsatzkurven bei der Veresterung im Rührkesselreaktor mit Hilfe von Novozym
435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3%
C, 65 rpm..................................................................[27]
Abb. 4.4 Thermostatisierter Blasensäulenreaktor (BS) ohne bewegliche Einbauten mit
Gaseintrag durch Bodenplatte, Regelung des Gasstromes und Entfernung des
Reaktionswassers mithilfe von Stickstoff zur Novozym 435 katalysierten
Veresterung von Glyzerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl...........................[28]
Abb. 4.5 Säurezahlkurven (RepBatch 1-5) und Linien des Abbruchkriterium bei der
Veresterung von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435.
Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N,
3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC.................[29]
Abb. 4.6 Säurezahlkurven (RepBatch 6-11) und Linien des Abbruchkriterium bei der
Veresterung von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435.
C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC.................[29]
Abb. 4.7 Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von
Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435.
C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC..................[30]
Abb. 4.8 Umsatzkurven bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe
von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure

AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C, Begasungsrate 1,20 l/min N2,
BC........................................................................................................................[30]
Abb. 4.9 Umsatzkurven der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von
Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure
C, Begasungsrate 1,20 l/min N2,
BC........................................................................................................................[31]
Abb. 4.10 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit
Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol
Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C,
Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC.......................................................................[31]
Abb. 4.11 Die Aktivität des Novozym 435 pro Zeiteinheit. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol
C,
Abb. 4.12 Umsatzkurve bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2% (w/wS) und 3% (w/wS)
Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure
AN456N, 60o
C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC...........................................[36]
Abb. 4.13 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2%
(w/wS) und 3% (w/wS) Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin,
0,38 mol Fettsäure AN456N, 60o
C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC.............[37]
Abb. 4.14 Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe
C, Begasungsrate: 0,6 l/min N2, 1,20
l/min N2 und 1,80 l/min N2, BC...........................................................................[38]
C,
Begasungsrate: 0,6 l/min N2, 1,20 l/min N2 und 1,80 l/min N2 , BC..................[39]
Abb. 4.16 Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von
Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12
mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator,
Temperatur: 55o
C, 60o
C und 65o
C; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC..............[40]

Abb. 4.17 Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe
AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, Temperatur: 55o
C, 60o
C und 65o
C;
Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, Temperatur:
55o
C, 60o
C und 65o
C; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC...................................[41]
Abb. 4.19 Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl
im Rührkesselreaktor und im Blasensäulenreaktor. Reaktionsbedingungen: 0,12
mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Novozym 435, STR:
65rpm und Vakuum, BS: 1,20 l/min N2..............................................................[42]
Abb. 4.20 Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl
im Rührkesselreaktor und im Blasensäulenreaktor. Reaktionsbedingungen: 11g
Glycerin, 105g Fettsäure AN456N, 60o
C, 3% (w/ws) Novozym 435, STR 65rpm
und Vakuum, BS:1,20 l/min N2...........................................................................[43]
Abb. 4.21 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure
aus Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12
mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C, STR
65rpm und Vakuum, BC: 1,20 l/min N2..............................................................[43]

Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1 Enzymklassifizierungen nach dem Reaktionsprinzip [Lit.Voet et al.2002]..........[4]
Tabelle 2.2 Begrenzende Faktoren der Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl
katalysiert durch Novozym 435..........................................................................[13]
Tabelle 3.1 Verwendete Chemikalien....................................................................................[17]
Tabelle 3.2 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (konjugierte Formen)2
...................................[18]
Tabelle 3.3 Produktidentifikator - [Oleon,2011]....................................................................[18]
Tabelle 3.4 Produktidentifikator - Glycerine4833 – Glycerine 1.262.[Oleon,2011].............[19]
Tabelle 3.5 Verwendete Materialien......................................................................................[20]
Tabelle 3.6 Die Mengeneinsatz Verhältnisse.........................................................................[22]
Tabelle 3.7 Die Bedingungen der Ionenaustausch-Chromatographie....................................[25]
Tabelle 3.8 Derivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA)..............................................[25]
Tabelle 4.1 Aminosäure-Verlustes.........................................................................................[35]
Tabelle 4.2 Das Enzym-Verlustes..........................................................................................[35]
Tabelle 4.3 Die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor...........[36]
Tabelle 5.1 Charakteristika und unterschiedlichen Reaktortypen..........................................[45]

1
Kapitel 1
1. Einleitung
1.1. Motivation
Esteröle sind oberflächenaktive Substanzen, die in Körperpflegeprodukten als Emulgatoren
eingesetzt werden. Sie werden in groβen Mengen aus Alkoholen und Fettsäuren produziert,
wobei letztere in vielen Fällen auf nachwachsenden Rohstoffen basieren. Als ökologischen und
ökonomischen Gründen soll die Synthese der Esteröle mittels Enzymkatalyse in
lösungsmittelfreier Umgebung durchgeführt werden.
Im Zuge der zunehmenden Knappheit an fossilen Rohstoffquellen steigert sich in den letzten
Jahrzehnten der Bedarf bei der Produktion vermehrt nachwachsende Rohstoffquellen
einzusetzen. Zur Zeit beträgt der Anteil von nachwachsenden Rohstoffen in der chemischen
Industrie in den USA und Deutschland etwa 10% [Winkler, 2009]. Hierzu gehören vorallem
natürliche Fette, Öle, Holzbestandteile, Kohlenhydrate und Proteine. Enzymatisch katalysierte
Reaktionen zeichnen sich durch einen geringen Energieverbrauch und hoher Substrat- wie
Produktselektivität aus. Oftmals können mehrere chemische Reaktionsschritte durch nur einen
enzymatischen Schritt ersetzt werden [Andreas Liese et al. 2006].
Bei biokatalytischen Prozessen nehmen dabei die Enzymkosten den größten Stellenwert ein. Um
diese so gering wie möglich zu halten, sind umfangreiche Kenntnisse zu den optimalen
Betriebsbedingungen der Biokatalysatoren notwendig. Auf die Praxis bezogen ergibt sich die
Wirtschaftlichkeit eines biokatalytischen Prozesses aus der benötigten Enzymkonzentration und
den damit verbundenen Enzymkosten, den (physikalischen) Betriebsbedingungen und dem
erzielbaren Umsatzgrad [Fullbrook,1983].
Die Veresterung von Ölen und Fetten (Triglyceride) ist ein Beispiel, bei dem die Produkte neben
dem technisch etablierten Verfahren, alternativ biokatalytisch herstellbar sind. Fettsäuren und
Glycerin sind wichtige Grundstoffe chemischer Prozesse und finden besonders in der
pharmazeutischen sowie der Lebens- und Waschmittelindustrie zahlreiche Verwendung
[Sharma, R., 2001].

2
Die Lipasen dienen zur Gewinnung von Spezialitäten aus Fetten und Ölen, und durch Variation
der Reaktionsbedingungen sind sie ebenso für Hydrolysereaktionen wie für Estersynthesen
geeignet (Abb. 1.1)
Abb. 1.1: Hydrolyse und Estersynthese mit Lipase [Schmid, R.D, 1998].
Auch für die organische Chemie sind Lipasen von großem Wert, da sie im Unterschied zu den
meisten anderen Enzymen in organischen Lösungsmitteln erstaunlich stabil sind und zudem eine
ungewöhnlich breite Substratspezifizität aufweisen:
Sie setzen eine große Zahl aliphatischer, alicyclischer, bicyclischer, aromatischer und
metallorganischer Ester um und weisen gegenüber racemischen Estern oder Verbindungen mit
mehreren Hydroxyfunktionen meist eine hohe Enantio- bzw. Regioselektivität auf. Das bei der
Lipase-Katalyse intermediär gebildete Acylenzym kann seine Acylgruppe aber nicht nur auf
Hydroxyverbindungen übertragen, sondern auch auf andere Nucleophile, wie auf die Thiogruppe
eines Thioesters oder auf aktivierte Amine. Als Folge des großen Synthesepotentials von Lipasen
gibt es über ihren Einsatz in der organischen Synthese umfangreiche Literatur, die auch deshalb
weiter zunimmt, weil Lipasen in wachsender Zahl als Handelsprodukte und in ―Test-Kits‖
angeboten werden [Schmid, R.D, 1998].

3
1.2. Ziel der Bachelorarbeit
Ziel dieser Bachelorarbeit ist Bestimmung der Enzym - Stabilität und des Enzym - Verlustes bei
der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure im Blasensäulenreaktor. Anhand der erhaltenen
Daten wird die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des gesamten Prozesses im
Blasensäulenreaktor bestimmt. Die Aufgaben lassen sich in zwei Gebiete einteilen:
- Der erste Versuch dient dazu, den komplete Reaktionsverlauf innerhalb von 24 Stunden
detailliert aufzunehmen, damit der Reaktionsverlauf im Blasensäulenreaktor vorliegt.
- Im zweiten Versuch sollten die Langzeitstabilität des Enzymes und die Ermittlung des
Enzym-Verlustes unter Prozessbedingungen untersucht werden. Die Reaktion wird so oft
wiederholt (mit Wiedernutzung des Enzymes), bis ausreichende Daten zum Kalkulieren
der Enzym-Stabilität und das Enzym-Verlustes vorliegen. Die Anzahl des repetiven
Batches hängt sehr stark davon ab, wie stabil Enzym im Blasensäulenreaktor ist.
Zuerst sollen die Versuche im Rührkesselreaktor sattfinden, um einen Vergleich mit dem
Blasensäulenreaktor machen zu können. Im Blasensäulenreaktor wird das Enzym immer wieder
verwendet, um zu ermitteln, nach der wievielten Wiederholung die Aktivität des Enzyms
nachlässt.
Dann werden die Temperatur von 55-65o
C und die Enzym-Menge von 1-3% variiert. Die
Rektion muss mit Stickstoffbegasung durchgeführt werden, damit keine Oxidation mit Fettsäure
stattfinden. Die Begasungsrate wird ebenfalls variiert.

4
Kapitel 2
2. Theoretische Grundlagen
Esteröle sind oberflächenaktive Substanzen, die in Körperpflegeprodukten als Emulgatoren
eingesetzt werden. Sie werden in groβer Mengen aus Alkoholen und Fettsäuren produziert,
wobei letztere in vielen Fällen auf nachwachsenden Rohstoffen basieren. Als ökologischen und
ökonomischen Gründen soll die Synthese mittels Enzymkatalyse und lösungsmittelfreier
Umgebung durchgeführt werden.
2.1. Biokatalyse
Die biologischen Katalysatoren oder Enzyme (von griechisch „en―: in und „zyme―:
Sauerteig/Hefe) sind essentiell für das Leben auf der Erde. Der Metabolismus aller Organismen
wird durch Enzyme katalysiert. Enzyme werden entsprechend, der von ihnen katalysierten
Reaktion in sechs Enzymklassen eingeteilt:
Tabelle 2.1. Enzymklassifizierungen nach dem Reaktionsprinzip [Lit.Voet et al.2002]
Einteilung Art der katalzsierten Reaktion Beispil
1.Oxidoreduktasen Oxidations-Reduktions-Reaktionen LDH* (reduziert Pzruvat zu Lactat)
2.Transferasen Übertragung funktioneller Gruppen Hexokinase
3.Hydrolasen Hydrolasereaktionen (spalten hydrolytisch) Triglyceridlipase (spaltet Neutralfette)
4.Lyasen Eliminierung von Gruppen unter Ausbildung
von Doppelbindungen
Cytoplasmatische Citrat-Lyase (spaltet
Citrat in Acetyl-CoA und Oxalacetat)
5.Isomerasen Isomerisierung Glucosophosphat-Isomerase
(isomerisiert Glucoso-6-phosphat zu
Fructoso-6-phosphat)
6.Ligasen oder
Synthetasen
Mit ATP-Hydrolyse gekoppelte Knüpfung
von Bindungen
Aminosäure-tRNA-Ligasen verknüpfen
Aminosäuren mit der zugehörigen tRNA
*LDH- Lactatdehydrogenase (reduziert Pyrovat zu Lactat)

5
Funktion und Effektivität von Stoffwechselreaktionen in nahezu allen Organismen hängen in
erster Linie von biologischen Katalysatoren (Enzymen) ab. Damit eine Reaktion ablaufen kann,
muss zunächst eine spezifische Menge an Energie aufgebracht werden, welche als
Aktivierungsenergie bezeichnet wird. Ist die zur Verfügung stehende Energiemenge ausreichend
groß, damit die nötige Aktivierungsenergie überwunden werden kann, befinden sich die
Substratmoleküle in einem Übergangszustand. Bei ausreichender Anzahl reagieren diese dann zu
den energetisch niedrigeren Produkten weiter. Enzyme senken die erforderliche
Aktivierungsenergie ab, so dass sich bei gleicher Temperatur mehr Moleküle im
Übergangszustand befinden als ohne Katalysator [Segel, I. H, 1975]. Biologische Katalysatoren
beschleunigen Reaktionen um das 108
- bis 1010
- fache [Karlson et al, 1994] (Abb. 2.1).
Enzyme bewirken eine stärkere Herabsetzung der Aktivierungsenergie als anorganische
Katalysatoren, weshalb enzymkatalysierte Reaktionen im Allgemeinen schon bei milden
Reaktionsbedingungen ablaufen [Hartmeier,W, 1986], dieses ist zum Beispiel am menschlichen
Stoff- wechselprozess ersichtlich. Sie verschieben dabei jedoch weder das thermodynamische
Reaktionsgleichgewicht, noch gehen sie in das Produkt ein.
Abb. 2.1: Energiediagramm einer enzymkatalysierten (- - -) im Vergleich zu einer
unkatalysierten (—) Reaktion [Karlson et al,1994]

6
2.1.1. Wirkungsmechanismus von Enzymen
Das katalytische Zentrum besitzt eine spezifische Konformation und befindet sich entweder auf
der Oberfläche oder im Inneren des Proteins. Das Substrat muss entsprechende sterische
Merkmale aufweisen, um mit dem katalytischen Zentrum interagieren zu können. Neben dieser
sogenannten Substratspezifität weisen Enzyme auch eine Wirkungsspezifität auf. Sie
katalysieren nur einen bestimmten Reaktionstypus. Existieren in einem Substratmolekül mehrere
Bindungen des gleichen Typs, dann verhalten sich Enzyme regiospezifisch oder stereoselektiv,
d.h., sie spalten Bindungen an oder in bestimmten Positionen auf. Der gesamte
Reaktionsmechanismus am Enzym kann grob in folgende Schritte gegliedert werden:
 Substratbindung
 Katalytische Reaktion
 Produktfreisetzung
Bei dem Vorgang der Substratbindung kommt es zu reversiblen Konformationsänderungen des
Enzyms. Dadurch wird das Enzym so ausgerichtet, dass sich zum einen Wasserstoffbrücken,
ionische Bindungen und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat zur
Substratbindung ausbilden. Zum anderen können die für die katalytische Funktion
verantwortlichen Aminosäuren lokal umpositioniert werden. Dies geschieht durch eine
strukturinterne Ladungsverschiebung. Um die Konformationsänderung des katalytischen
Zentrums zu realisieren, muss in anderen Enzymbereichen ebenfalls eine räumliche
Strukturänderung erfolgen, ohne dabei jedoch die globale Enzymstruktur zu zerstören. Dieses
erklärt den komplexen und aus vielen Aminosäuren bestehenden Aufbau des Gesamtenzyms.
Hervorgerufen durch die substratbindenden Kräfte erfolgt neben der enzymseitigen
Konformationsänderung ebenfalls eine strukturelle Substratänderung. DurchWechselwirkungen
zwischen Substrat und katalytischem Zentrum kommt es zu Ladungsverschiebungen im Substrat.
Dies führt zu einem aktivierten Übergangszustand des Substrats [Karlson et al,1994]. Die Folge
ist eine Verminderung der Aktivierungsenergie. Im Anschluss an die Reaktion erfolgt die
Freisetzung des entstandenen Produktes an die Umgebung. Das Enzym besitzt danach seine
ursprüngliche Konformation [Pistiyski et al,2006].

7
2.1.2. Lipasen (EC 3.1.1.3)
Lipasen (EC 3.1.1.3)1
, auch Triacylglycerinester-Hydrolasen, gehören zur Familie der Serin-
Hydrolasen und entsprechen einer weitverbreiteten Gruppe von Enzymen in der Natur. Sie
kommen sowohl im Menschen, in Tieren und Pflanzen als auch in Mikroorganismen vor. Ihre
natürliche Funktion besteht in dem hydrolytischen Abbau von wasserunlöslichen Triglyceriden
zu freien Fettsäuren und Glycerin (Abb.2.2). Bei dieser biokatalytischen Gleichgewichtsreaktion
entstehen, wie beim konventionellen thermischen Verfahren, Partialglyceride als
Zwischenprodukt der Gesamtreaktion. Die Lage des Reaktionsgleichgewichtes wird durch den
Wassergehalt des Gesamtsystems bestimmt. Je nach Wassergehalt ist ebenso die Rückreaktion
(Veresterung) möglich [Pistiyski et al, 2006].
Abb.2.2: Reaktionsschema der Lipase-katalysierten Reaktion: Hydrolyse und Synthese von
Triglyceriden (R1 − R3 entsprechen den Fettsäureresten) [Biochemie,Nova Print AD, 2006].
Unter Regiospezifität versteht man das Vermögen der Lipasen die Esterbindungen an
bestimmten Positionen zu hydrolysieren und den Vorzug, längere oder kürzere bzw. gesättigte
oder ungesättigte Fettsäuren abzuspalten [Brockerhoff,1974].
Lipasen zeigen im Allgemeinen eine hohe Chemo-, Regio- und Enantioselektivität. Sie haben
eine relativ einheitliche 3D-Struktur und Reaktionssequenz, die katalytische Triade gennant
wird. Der Reaktionsmechanismus wird in Abbildung 2.3 am Beispiel der Lipase B aus Candida
antarctica (CALB) veranschaulicht. Hydrolasen die dem Strukturtyp der α/β-Hydrolase Faltung
angehören. Besitzen drei katalytisch essentielle Aminosäuren, Ser, His und Asp. Das Substrat
wird im aktiven Zentrum durch die drei Aminosäuren der katalytischen Triade katalytisch
umgesetzt[Hilterhaus,2008].
1
Die EC-Nummern bilden ein Klassifikationssystem für Enzyme. Als Kriterium für die Kategorisierung
wird die vom Enzym katalysierte Reaktion verwendet.

8
Abb.2.3. (A) 3D-Struktur der CALB mit Van-der-Waals-Oberfläche, Vergrößerung des aktiven
Zentrums mit Butylpropionat und den Aminosauren der katalytischen Triade, erstellt mit Pymol
(Version 0.98 Delano- Scientific); (B) Reaktionsschema der lipasenkatalysierten Hydrolyse
[Buthe, A. (2006)].

9
2.1.3. Novozym 435
Viele Lipasen sind kommerziell zu niedrigen Preisen als unverarbeitetes, oft mit anderen
Proteinen verunreinigtes, Produkt erhältlich [Jena Bioscience, 2009]. CALB (Abb. 2.4) wird
immobilisiert auf verschiedenen Trägern oder lyophilisiert verkauft (Chirazyme L-2, Roche und
Novozyme 435, Novozymes). Das kommerziell verfügbare Novozym 435, ein Präparat mit
bemerkenswert hoher Aktivitat [Bourg-Garros et al.,1998], wird bereits großtechnisch eingesetzt
[Hills, 2003; Thum, 2004].
Abb.2.4. Kristallstrukturanalyse von Lipase B aus Candida antarctica.[Jena Bioscience,2009]
2.1.4. Grenzflächenaktivierung von Lipasen
Während die Substrate für lipasekatalysierte Reaktionen hydrophob sind, sind Lipasen selbst von
hydrophiler Natur. Sarda und Desnuelle beschrieben, dass Lipasen gegenüber gelösten
Substraten nur eine geringe Aktivität aufweisen. Sobald allerdings die Substrate ihre kritische
Micellkonzentration erreichen, steigt die Aktivität steil an (Abb.2.5). Es müssen also in der
Reaktionslösung sogenannte „Supersubstrate― oder einfacher eine zweite organische Phase
(Emulsion) vorliegen [L. Sarda,1957]. Dieses Phänomen der Grenzflächenaktivierung beruht auf
der Lipasestruktur. Durch Röntgenstrukturanalysen zeigte sich, dass die meisten Lipasen ein
amphiphiles Peptidsegment besitzen, welches wie ein Deckel das aktive Zentrum des Enzyms
bedeckt. Bei Bindung an eine hydrophobe Oberfläche, wie z.B. an einen Öltropfen, öffnet sich
der Deckel durch eine Konformationsänderung und die katalytische Aktivität der Lipase erhöht
sich [R. D. Schmid,1998].

10
Abb. 2.5: Grenzflächenaktivierung - Lipaseaktivität in Abhängigkeit der Substratkonzentration;
cmc = kritische Mizellbildungskonzentration [L. Sarda]
2.2. Fette und Fettsäuren
Fettsäuren unterscheiden sich durch die Anzahl der C-Atome (Kettenlänge) sowie der möglichen
Anwesenheit, Anzahl und Position von Doppelbindungen. Man kann Fettsäuren aufgrund ihrer
Kettenlängen in niedere (bis sieben C-Atome), mittlere (acht bis zwölf C-Atome) und höhere
(mehr als zwölf C-Atome) Fettsäuren einteilen. Die historische Namensgebung als Fettsäure
suggeriert, dass eine individuelle Verbindung einmal eine Komponente eines Fettes gewesen sein
muss, um eine Fettsäure zu sein. Dies ist aber nicht zwangsläufig der Fall. Unter diesem Begriff
werden heute Verbindungen chemischer Ähnlichkeit gesammelt. Natürliche Fettsäuren bestehen
in der Regel aus einer geraden Zahl von Kohlenstoffatomen und sind unverzweigt
[Pistiyski,2006].
Der Rohstoff für die Herstellung von Fettsäuren sind natürliche pflanzliche oder tierische Fette
und Öle. Öle und Fette bestehen hauptsächlich aus Triglyceriden (für gewöhnlich ≥ 95%) und
zum Rest aus Monoglyceriden, Diglyceriden, freie Fettsäuren, Phospholipiden und weiteren
Begleitstoffen [Pistiyski, 2006].

11
2.3. Glycerine
Abb. 2.6. Struktur von Glycerin.
Glycerin (von gr. glykerós = süß, nach IUPAC Glycerol, auch Glyzerin) ist der Trivialname und
die gebräuchliche Bezeichnung von Propan-1,2,3-triol. Glycerin ist der einfachste dreiwertige
Alkohol (Triol). Der Name Glycerol wurde eingeführt, da er die korrekte Endung -ol für einen
Alkohol besitzt. Glycerin ist in allen natürlichen Fetten und Ölen als Fettsäuereester vorhanden
und spielt eine zentrale Rolle als Zwischenprodukt in verschiedenen Stoffwechselprozessen. Als
Lebensmittelzusatzstoff trägt es das Kürzel E 422.[Breitmaier,E.,2005]
2.4. Reaktorkonzepte zur Veresterung
2.4.1. Mehrphasige Reaktorkonzepte
Die große Gruppe der mehrphasigen Reaktoren umfasst Fluid-Feststoff-, Fluid-Fluid-Systeme
sowie Systeme mit drei und mehr Phasen [Zehner und Kraume,2005] [Henkel,2005]. Fluid-
Feststoff-Systeme sind Systeme in denen ein Feststoff in einer flüssigen oder gasförmigen Phase
dispergiert ist. Reaktoren, die diese Systeme prozessieren sind unter anderen der Festbettreaktor
und der Wirbelschichtreaktor. Beim Betrieb von Fluid-Fluid-Reaktoren, also der Umsetzung
zweier flüssiger beyiehungsweise einer flüssigen und einer gasförmigen Phase, ist die chemische
Reaktion an einen Absorptionsschritt gekoppelt [Henkel,2005]. Die Unterscheidung der Fluid-
Fluid-Reaktoren ist anhand Methodik mit der die unterschiedlichen Phasen in Kontakt gebracht
werden, möglich:
- Dispersion des Gases in der Flüssigkeit (Blasensäule, Rührkessel, Bodenkolonne)
- Dispersion der Flüssigkeit im Gas (Sprühturm, Strahlwäscher)
- Dünner Film der Flüssigkeit (Rieselkolonne, Fallfilmverdampfer)

12
Weiter kann die Klassifikation von Reaktoren mit einer dispergierten Gasphase bezüglich der Art
des Energieeintragen erfolgen [Kastanek,1993]. So sind für Reaktoren mit gas/flüssig-
Grenzfläche folgende Arten des Energieeintrages zu unterscheiden [Schügel,1980]:
- Energieeintrag durch die Gasphase (Gaseintrage durch Platten, Schläuche, Ringe)
- Energieeintrag durch die Flüssigphase (Pumpen, externe Zirkulation)
- Energieeintrag durch interne, mechanische Elemente (verschiedene Rührertypen)
Im Falle einer lösungsmittelfreier Umsetzung eines heterogenen Katalysators ist der
Blasensäulenreaktor ein möglicher Reaktortyp (Abb. 2.7). Er stellt eine einfache, kostengünstige
Konstruktion dar und ist sehr anpassungsfähig [Deckwer, 1992].
Abb. 2.7: Schematische Darstellung von Blasensäulenreaktor (BS) und Rührkesselreaktor (STR).
2.4.2. Lösungsmittelfreier Betrieb
In Mehrphasensystemen existieren verschiedene Stofftransport-Schritte, die sich limitierend auf
den Gesamtprozess auswirken können. Diese können der eigentlichen Reaktion vor- oder
nachgeschaltet sein. Daher ist es notwendig hohe Stofftransportraten im Reaktor zu etablieren,
was durch die Bildung großer Phasengrenzflächen möglich ist. Die verwendten
Ausgangsmaterialien Glycerin und Fettsäure bilden ein Zweiphasensystem aus. Ihre Veresterung
wird heterogen durch Novozym 435 katalysiert und das gebildet Reaktionswasser wird mit Hilfe
eines Druckluftstorms durch den Reaktor entfernt (Abb. 2.8). Mögliche limitierende Faktoren
sind in Tabelle 2.2 zusammengefasst [Hilterhaus, L., 2008].

13
Abb. 2.8: Schematische Darstellung der vier an der Umsetzung beteiligten Phasen: Novozym
435 (S), Fettsäure (L1), Glycerin (L2) und Gas (G) [Hilterhaus, L.,2008].
Tabelle 2.2: Begrenzende Faktoren der Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl
katalysiert durch Novozym 435.
Anforderung Sofftransport Begrenzender Faktor
Emulgieren der Reaktanden Flüssig/flüssig Energieeintrag pro Volumen: P/VR
Suspendieren von Novozym 435 Fest/flüssig Energieeintrag pro Volumen: P/VR
Reaktion Diffusion Filmdiffusion: D
Porosität des Trägers: D.
Entfernen des Reaktionswassers Flüssig/gasstörmig Aktivität des Enzyms Grenzfläche
flüssig/gasförmig: kL.a
In Blasensäulenreaktor entspricht der Energieeintrag P dem Produkt aus Gasflussrate und
Druckabfall:
P = . ρL. g. . L (1)
- Volumenstrom der Gasphase [L.min-1
]
L- Länge des Reaktors [m]
ρL- Dichte der flüssigen Phasen [kg.L-1
]
g- die Gravitation; g = 9,81 [m/s2
]
- Flüssigkeitsanteil
+ =1

14
Er variiert als Funktion des Volumenstroms der Gasphase und muss in die Überlegungen zum
Energieeintrag P mit einbezogen werden. Der Gasgehalt nimmt mit steigendem
Volumenstrom der Gasphase zu und bei erhöhter Viskosität und Feststoffkonzentration ab
[Kantarci et al., 2005].
Die Berechnung des hydrodinamischen Parameters sowie des Soffübergangskoeffizienten kL
und der spezifischen Phasengrenzfläche a ist sehr komplex. Diese Parameter hängen von
Substanzeigenschaften, wie Viskosität [Ruzicka et al., 2003], Oberflächenspannung und Dichte
der Flüssigkeit sowie der Dichte des Gases ab [Kulkarni & Joshi, 2005]. Die Art des
Gaseintrages, die geometrischen Abmessungen des Reaktors sowie Prozessbedingungen sind
ebenfalls entschedend [Deckwer, 1992]. Die Modellierung der Blasenrelativgeschwindigkeit in
Gas/Flüssigkeitssystemen unter Berücksichtigung dieser Wechselwirkungen zeigt jedoch, dass
drei Bereiche im Fall der Zweiphasenströmung in Abhängigkeit vom Gasgehalt unterschieden
werden können:
- Aufstieg der Einzelblasen auf einer spiralförmigen Bahn ohne gegenseitige
Beeinflussung ( < 0,5%)
- Schwarminduzierte Turbulenze bewirken erhöhten radialen Impulsaustausch und führen
zu einer Abnahme der radialen und Zunahme der axialen Blasenrelativgeschwindigkeit
(0,5 < < 4,8%)
- Dominanz von Reynolds-Turbulenzen führt zur Abnahme der
Blasenrelativgeschwindigkeit (4,8%< ) [Hilterhaus,2008][Snabre et al, 1998]
Abb. 2.9: Schematische Darstellung der möglichen Strömungsformen in Blasensäulen [Kantarci
et al., 2005].

15
Abb. 2.10: Strömungsbereiche in Blasensäulen [Ewert et al.,2009]
Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass die Blasengröße prinzipiell mit steigender
Gasgeschwindigkeit, Feststoffkonzentration und Viskosität der Flüssigkeit zunimmt, wobei der
Gasgehalt bei großen Blasen nicht, der von kleinen Blasen jedoch von der
Feststoffkonzentration abhängt [Kantarci et al., 2005].
Der Stoffübergangskoeffizient kL und die spezifische Phasengrenzfläche a sind von besonderer
Bedeutung hinsichtlich der Entfernung des entstehenden Reaktionswassers. Die Begasung von
hochviskosen Flüssigkeiten hat gezeigt, dass es neben dem Aufsteigen von großen Blasen zu
einer Akkumulation von kleinen Blasen (d < 1 mm) in Blasensäulenreaktoren kommt [Buchholz
et al.,1981]. Der Beitrag dieser kleinen Gasblasen zum gas/flüssig Massentranspotr liegt bei bis
zu 50% und ihre Bildung wird durch Tenside gefördert [Muller & Davidson, 1995]. Mit
steigender Begasungsrate wird auch der Anteil dieser kleinen Gasblasen gesteigert, wobei ihre
Akkumulation zeitabhängig ist. Kawalec-Pietrenko et al. konnten zeigen, dass der
Stoffübergangskoeffizient gas/flüssig in dieser kleinen Gasblasen um eine Größenordnung höher
ist, als bei großen Glasblasen, und sie somit entscheidend zum Stoffübergang in hochviskosen
Flüssigkeiten in der Blasensäule beitragen [Kawalec-Pietrenko & Pietrenko, 1999]. Im
Allgemeinen nimmt jedoch der volumetrische Massentransportkoeffizient kL.a mit steigendem
Feststoffgehalt und bei Erhöhung der Viskosität des Mediums ab. Er vergößert sich mit
steigender Gasgeschwindigkeit. Beim Vorhandensein von Tensiden werden kleine Blasen
stabilisiert, was für einen effektiven Stoffübergang von großer Bedeutung ist [Kantarci et al.,
2005].

16
2.4.3. Rührkesselreaktor
Die Systemcharakterisierung und die Charakterisierung der Biokatalysator haben gezeigt, dass
sich die Anforderungen die enzymatische lösungsmittelfreie Umsetzung von Glycerin und
Sonnenblumenöl wie folgt zusammenfassen lassen:
- Emulgieren der Reaktanden Glycerin und Fettsäure
- Syspendieren des heterogenen Katalysators Novozym 435
- Entfernen des entstehenden Reaktionswasser
Versuche im Rührkesselreaktor haben gezeigt, dass die enzymatische, lösungsmittelfreie
Umsetzung von Glycerol und Fettsäure möglich ist, wenn die Durchmischung von Reaktanden
und dem heterogenen Biokatalysator sichergestellt ist [Hilterhaus, 2008].
Im Folgenden wird nun die lösungsmittel freie Umsetzung im Rührkesselreaktor (VR = 250 ml)
untersucht, wobei der Einfluss verschiedener Parameter wie z.B. Rührdrehzahl und Temperatur
[Zlokarnik, 1999] [Zlokarnik, 2006].
2.4.4. Blasensäulenreaktor
Der Blasensäurenreaktor findet ursprünglich in der Abwasserbehandlung Anwendung. Die
Besonderheit dieses Reaktors ist, dass keine mechanischen Teile, die verschleißen könnten,
enthalten sind. Die Durchmischung findet durch einen Gasstrom vom Boden des Reaktors zur
Flüssigkeitsoberfläche statt. Der Blasensäulenreaktor eignet sich gut für enzymatische
Veresterungen, da das Enzym nicht durch mechanische Teile zerstört werden kann und sich frei
im Reaktor bewegt, was Viskositätslimitierungen verhindert, die im Festbett entstehen. Zudem
wird mit Hilfe des Gases das Reaktionswasser der Veresterung abtransportiert und die Reaktion
so auf die Seite der Produkte verschoben. Die enzymatische Veresterung zu den Fettsäureester in
einem Blasensäulenreaktor ist schneller als in einem Rührkesselreaktor [Hilterhaus,2008].

17
Kapitel 3
3. Materialien und Methoden
In diesem Kapitel sollen die theoretischen Grundlagen zur Auswertung und Bewertung der
experimentellen Ergebnisse in Kapitel 4 gezeigt werden. Dabei wird der Schwerpunkt auf die
Analysemethoden, sowie die einzelnen Versuchsaufbauten gelegt.
3.1. Materialien
3.1.1. Chemikalien
Tabelle 3.1: Verwendete Chemikalien
Chemikalien Hersteller
Lipasepräparat:
 Lipase B (Novozym 435) aus
Candida antarctica
Novozymes, A/S: Novozym 435 Product Data
Sheet, Denmark
Glycerine 4833 – Glycerine 1.262 Oleon GmbH, Emmerich am Rhein
Sonnenblumenöl:
 Nouracid®HE 456 Oleon GmbH, Emmerich am Rhein
Alle weiteren Chemikalien wurden von Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe) und Sigma
Aldrich GmbH (Seelze) bezogen.

18
 Nouracid®HE 456
Reaktivität: Das Sonnenblumenöl ist stabil unter Normalbedingungen.
Tabelle 3.2. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (konjugierte Formen)2
.
Tabelle 3.3. Produktidentifikator - [Oleon,2011]
Handelsname Nouracid®HE 456
Name Fettsäure, Sonnenblumenöl
Aggregatzustand (20o
C) Flüssig
Farbe Gelb bis dunkel gelb
pH < 7
Schmelzpunkt 10o
C
Siedepunkt >200o
C
Dichte ca.900 kg/m3
(20o
C)
Vislosität ca.80 mPa.s (60-100), (20o
C)
2
Fatty Acids and Ggycerin, Surface Chemistry, Akzo Nobel
X ≡ Nouracid®HE 456
rot gelb Andere
min max min max min max min max min max min max min max min max min max max min max min max
X Sonnenblume 1 10 196 204 135 155 20 30 3 10 58 63 1 2 10 2
FettsäuretypProdukt
mg KOH/g
Säurezahl
Farbe
51/4"
cell
Lovibond Jodzahl
g 12/100g C16 C18 C18:1 < = C18 >= C20
Fettsäurezusammensetzung in %
C18:2 C18 konjugierte C18:3

19
 Glycerine 4833 – Glycerine 1.262
Tabelle 3.4. Produktidentifikator - Glycerine4833 – Glycerine 1.262.[Oleon,2011]
Handelsname Glycerine4833 – Glycerine 1.262
Name Glycerol
Aggregatzastand (20o
C) Flüssig
Farbe Farblos bis klar gelb
Schmelzpunkt 18o
C
Siedepunkt 290o
C
Dichte ca.1262,4 kg/m3
(20o
C)
Viskosität ca.1400 mPa.s (20o
C)
Reaktivität
Er zersetzt sich bei Temperaturanstieg unter Bildung giftiger/ätzender/brennbarer Gase. Glycerin
kann bei Temperaturansieg polymerisieren. Er reagiert mit (starken) Oxidationsmitteln und auch
mit (manchen) Säuren. Glycerin ist löslich in Wasser, Ethanol, Aceton, Ethylacetat und unlöslich
in Ölen/Fetten.

20
3.1.2. Geräte
Tabelle 3.2: Verwendete Materialien
Gerät Typ Hersteller
Analysenwaage BL210S, max 210g, d = 0,1mg Startorius
Dispensette Digital 2-10ml Brand GmbH
Rührwerk RW20 IKA
Bürette Titrette®
, Class A precision, 25ml Eppendorf AG, Hamburg
Rührer KPG-Rührer IKA
Magnetrührer RCT IKA
Thermostat E100 Lauda
Membranpumpe:
Öl/Membranwechsel
ME2C Deutschland
Vacuumpumpe ME 4C NT +2AK Vacuumbrand,GmbH+CoKG,
Wertheim, Deutschland
Mass flow meter / controller,
Durchflussregler
EL-FLOW Holland
Darüber hinaus wurden ausschließlich Standardlaborgeräte verwendet.

21
Methoden
3.1.3. Rührkesselreaktor
Für die Systemcharakterisierung wurde ein 250 ml-Rührkesselreaktor aus Glas verwendet (Abb.
3.1). Der Reaktor war mit einem KPG-Rührer, einer Temperierung und Vakuumpumpe
ausgestattet. Der Rührer wurde mit 65 rpm betrieben. Die KPG-Hülse als Welleneintritt des
Reaktors ermöglicht das Anlegen eines Vakuums von 20-200 mbar am Reaktor zur Entfernung
von Wasser.
Die Reaktion wird nach folgendem Ablauf durchgeführt: der Rührkesselreaktor wird
thermostatisiert und mit Glycerin und Fettsäure befüllt (Tabelle 3.6). Die Reaktionsmischung
wird thermostatisiert. Nach Erreichen der entsprechenden Temperatur wird der Rührer
eingeschaltet und die Reaktanden für 15-20 Minuten emulgiert. In dieser Zeit ist der Anschluss
für die Probenentnahmen verschlosen und am Reaktor liegt Vakuum an. Dann wird der Reaktor
belüftet und die erste Probe entnommen, anschließend wird der Biokatalysator zugegeben, der
Anschluss für die Probennahme verschlossen und unter Vakuum gerührt. Weitere Probennahmen
geschehen analog.
Abb. 3.1: Schematische Darstellung von Rührkesselreaktor (STR):1-STR mit Rührer; 2-
Thermostat;3-Vakuumpumpe.

22
3.1.4. Veresterung im Blasensäulenreaktor
Für die Systemcharakterisierung wurde ein 250 ml-Blasensäurenreaktor aus Glas verwendet
(Abb. 3.2). Der Reaktor war mit einem Sieb am Boden (50μm), einer Temperierung und einem
Durchflussregler für das eingetragene Gas ausgestattet. Die Probennahme erfolgt von oben. Jede
Reaktion wurde nach folgendem Ablauf durchgeführt: der Blasensäulenreaktor wurde
thermostatisiert. Der Reaktor wurde mit Glycerin und Fettsäure befüllt (Tabelle 3.6) und die
Reaktionsmischung bei gleichzeitiger Begasung thermostatisiert. Nach Erreichen der
entsprechenden Temperatur werden die Reaktanden für weitere 15-20 Minuten emulgiert. Nach
dieser Zeit erfolgt die erste Probenentnahme. Dann wird der Biokatalysator zugegeben und
weitere Probennahmen erfolgen zu definierten Zeitpunkten.
Abb. 3.2: Schematische Darstellung von Blasensäulenreaktor (BC):1-BC; 2-Thermostat; 3-
Sollwertgeber FWE
Tabelle 3.6. Die Mengeneinsatz Verhältnisse.
Tabelle mit 5% FA-Überschuss
Menge Fettsäure [in g] 105
Menge Fettsäure [in Mol] 0,38
Menge Glycerin [in g] 11
Menge Glycerin [in Mol] 0,12
Menge Enzym [in g] 3,5
Menge Enzym [in %] 3

23
3.1.5. Säurezahlbestimmung durch Titration
Die Bestimmung der Fettsäure durch Titration mit einer ethanolischen Kalilauge entspricht einer
Neutralisationsreaktion:
R-COOH + KOH → R-COOK + H2O (2)
Es wird davon ausgegangen, dass die Base und die Säure im stöchiometrischen Verhältnis
reagieren. Proben aus dem Rührkesselreaktor oder der Blasensäule mit einem Gewicht von ca. 1
g wurden unter Wärmezufuhr und Rühren in 20 mL Ethanol vollständig gelöst und mit einem
Magnetrührer vermischt. Die Proben wurden nach der Zugabe von 20 μL 1 %iger ethanolischer
Phenolphthalein-Lösung3
bis zum Farbumschlag (von farblos zu Magenta) mit 0,01 M
ethanolischer Kaliumhydroxid-Lösung titriert. Die Verwendung des Ethanols diente einer
verbesserten Löslichkeit der öligen Probe in der Kalilauge. Aus dem Gewicht der Probe und der
zur Neutralisation benötigten Kaliumhydroxid-Lösung wurde die Säurezahl bestimmt. Dabei gibt
die Säurezahl an, wie viel Milligramm Kaliumhydroxid zur Neutralisation von einem Gramm
Probe notwendig ist.
SZ= = (3)
mit:
SZ = Säurezahl [-]
mKOH = Masse Kaliumhydroxid [mg]
mProbe = Masse der Probe [g]
VKOH = Volumen der Kaliumhydroxidlösung [mL]
CKOH = Konzentration der Kaliumhydroxidlösung; 0,5 [mol/L]
MKOH = Molare Masse von Kaliumhydroxid; 56,1 [g/mol]
3
1g Phenolphthalein wurde in 100 ml Ethanol gelöst

24
Mithilfe der Säurezahl wurde der Umsatz berechnet:
X = .100 = .100 = .100 = .100 (4)
mit:
X = Umsatz [%]
c = Konzentration [mol/l]
cth = aus den Einwaagen berechnete theoretische Konzentration [g/mol]
n = Menge [mol]
nth = aus den Einwaagen berechnete theoretische Menge [mol]
m = Masse [g]
mth = aus den Einwaagen berechnete theoretische Masse [g]
SZ = Säurezahl [-]
SZth = aus den Einwaagen berechnete theoretische Säurezahl [-]
3.1.6. Aminosäureanalyse
 Ionenaustausch-Chromatographie:
Um höhere Nachweisempfindlichkeiten zu erhalten wies ROTH auf die Bildung von
fluoreszierenden AS-Derivaten bei Umsetzung von AS mit o-Diacetylbenzol oder o-
Phthaldialdehyd (OPA) in Gegenwart reduzierender Agentien wie KBH4 oder Thiolen wie z.B.
2-Mercaptoethanol (ME) oder 3-Mercaptopropionsäure (MPA) in alkalischer Lösung hin
[ROTH, M.,1971].
Abb. 3.3: Reaktionsschema der primären AS mit OPA in Gegenwart von achiralen und chiralen
Thiolverbingungen [Baek, G., 1999].

25
Ortho-Phthaldialdehyd (OPA) kondensiert mit Aminosäuren unter reduzierenden und alkalischen
Bedingungen zu fluoreszierenden Derivaten (Abb. 3.3), welche sehr empfindlich detektiert
werden können. Darüber hinaus ist eine nicht-fluorenszenzspektroskopische Detektion bei einer
Wellenlänge von 340 nm möglich, die allerdings wesentlich unempfindlicher ist.
Tabelle 3.7: Die Bedingungen der Ionenaustausch-Chromatographie
Bedingungen:
Citratpuffer pH = 2
Stufengradient mit steigender Ionenstärke und
ansteigendem pH
Nachweisgrenze ca. 50 pmol
Tabelle 3.8: Derivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA):
ortho-Phthaldialdehyd (OPA):
- reagiert nur mit primären Aldehyden
- fluoreszierendes Isoindol-Derivat
- Anregung 330 nm, Emission 460 nm, UV-Absorption bei 230 nm
- Raumtemperatur; pH 9,5; Reaktionszeit: wenige Minuten
- Sekundäre Amine reagieren nicht
- Nachweisgrenze 50 pmol (Fluoreszenz)

26
Kapitel 4
Dieses Kapitel soll die in der Bachelorarbeit durchgeführten Experimente illustrieren.
4. Experimentelle Ergebnisse und Diskussion
4.1. Veresterung im Rührkesselreaktor
Der Einfluss verschiedener Parameter auf den Umsatz und die Aktivität der biokatalytischen
Veresterung von Glycerin mit einer Fettsäure (Sonnenblumenöl) wurden in einem Rührkessel
(VR = 250 mL) untersucht (Abb. 4.1).
Abb. 4.1: Thermostatisierter Rührkesselreaktor (STR) mit Evaporation des Reaktionswassers,
Auffangen des Wassers im Kondensatsammler und Druckmessung zur Veresterung von Glycerin
mit Fettsäuren (Sonnenblumenöl) mit Hilfe von Novozym 435
OH
OH
OH
+
CH3
COOH
m
Novozym 435
-H2O
OH
OH
O CH3
O
m

27
Verwendet wurde immobilisierte Lipase B von Candida antarctica als Novozym 435. Enzyme
besitzen ein Temperaturmaximum, bei welchem sie eine Reaktion mit der maximalen
Reaktionsgeschwindigkeit katalysieren. Reaktion mit CALB bei Veresterung von Glycerin und
Sonnenblumenöl im STR ist sehr langsam (Abb. 4.2 und Abb. 4.3).
Abb. 4.2: Säurezahlkurve bei der Veresterung im Rührkesselreaktor mit Hilfe von Novozym 435.
Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS)
Biokatalysator, 60o
C, 65 rpm
Abb. 4.3: Umsatzkurven bei der Veresterung im Rührkesselreaktor mit Hilfe von Novozym 435.
Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS)
Biokatalysator, 60o
C, 65 rpm

28
Innerhalb der ersten 24 Stunde konnten bei 60o
C etwa 40-42% Umsatz erzielt werden. Die
Säurezahl wurde 112 mg KOH/g Probe. Reaktion mit Novozym 435 bei Veresterung von
Glycerin und Sonnenblumenöl im STR war sehr langsam.
4.2. Veresterung im Blasensäulenreaktor
Ein großes Problem bei der Verwendung von immobilisierten Enzymen in Rührkesselreaktoren
besteht allerdings darin, dass die Immobilisate durch den Eintrag von mechanischer Energie
zerstört werden. Der in dieser Arbeit verwendete Blasensäulenreaktor bot die Möglichkeit, das
Reaktionssystem ohne Energieeintrag durch mechanische Komponenten zu durchmischen (Abb.
4.4). Der dafür verwendete Stickstoff Strom ermöglichte es zudem, das Reaktionswasser ohne
die Verwendung von Vakuum auszutragen.
Abb.4.4: Thermostatisierter Blasensäulenreaktor (BS) ohne bewegliche Einbauten mit
Gaseintrag durch Bodenplatte, Regelung des Gasstromes und Entfernung des Reaktionswassers
mithilfe von Stickstoff zur Novozym 435 katalysierten Veresterung von Glyzerin und Fettsäure
aus Sonnenblumenöl.
OH
OH
OH
+
CH3
COOH
m
Novozym 435
-H2O
OH
OH
O CH3
O
m

29
4.2.1. Repetitive Batch
Die Reaktion wurde wiederholt, bis ausreichende Daten zum Kalkulieren der Enzym-Stabilität
und des Enzym-Verlustes vorliegen. Die Ergebnisse wurden im folgenden Diagrammen
zusammen gefaßt.
Abb. 4.5: Säurezahlkurven (RepBatch 1-5) und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung
von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol
Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C, Begasungsrate
1,20 l/min N2, BC
Abb. 4.6: Säurezahlkurven (RepBatch 6-11) und Linien des Abbruchkriterium bei der
Veresterung von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen:
0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C,
Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC

30
Abb. 4.7: Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin
mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin,
0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C, Begasungsrate 1,20 l/min
N2, BC
Abb. 4.8: Umsatzkurven bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von
Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3%
C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC

31
Abb. 4.9: Umsatzkurven der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von
C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC
Abb. 4.10: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit
Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38
mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC

32
Bei Repetitive Batch 1-5 innerhalb vom ersten 1 Stunde konnten bei 60o
C etwa 42-50% Umsatz
erzielt werden. Die Säurezahl wurse von 95 bis 109 mg KOH/g Probe (siehe Abb. 4.5 und Abb.
4.7).
Bei Repetitive Batch 6-11 innerhalb vom ersten 1 Stunde konnten bei 60o
C etwa 35-42% Umsatz
erzielt werden. Die Säurezahl wurse von 108 bis 121 mg KOH/g Probe (siehe Abb. 4.6 und Abb.
4.8).
Für die Aktivitätsberechnung (Abb. 4.10) wurde jeweils der erste Wert (nach etwa 1h) des
Experiments mit dem Nullwert:
U = . 106
(5)

33
Die Halbwertszeit und die Wirtschaftlichkeitsberechnung:
Abb. 4.11: Die Aktivität des Novozym 435 pro Zeiteinheit. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol
C, Begasungsrate: 1,20
l/min N2, BC
 Deaktivierungsrate:
Die Deaktivierung ist definiert als der Verlust der Aktivität des Katalysators pro Zeiteinheit
definiert:
V1 = Vo. (5)
mit:
Kdeakt = Deaktivierungsrate [1/h]
Vo= Enzymaktivität zu Beginn der Messung [U]
V1 = Enzymaktivität am Ende der Messung [U]
to = Zeit zu Beginn der Messung [h]
t1 = Zeit am Ende der Messung [h]
Die Deaktivierung Rate bringt die Stabilität eines Katalysators.
In diesem Experiment Kdeakt ist: Kdeakt = 7,5.10-4
[1/h] mit einem Feler von 3,7.10-5

34
 Die Halbwertszeit
Die Halbwertszeit ist die Zeit, in der die Aktivität halbiert definiert:
V1 = Vo. (6)
V2 = Vo. (7)
V1 = V2 (8)
t1/2 = (9)
mit:
t1/2 = Halbwertszeit [h]
Die Halbwertszeit bringt die Stabilität eines Katalysators. Die Aktivität in der Regel zeigt einen
typischen exponentiellen Abfall. Die Halbwertszeit gibt das Ausmaß der Deaktivierung des
Katalysators unabhängig von betrachteten Zeitunterschieden.
In diesem Experiment t1/2 = 9-16 [h]
 Aminosäureanalyse
o Ionenaustausch-Chromatographie:
Mit Ergebnissen von diesem Methode wurde der Enzym-Verlustes und die Wirtschaftlichkeit
(Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor bestimmt.
Tabelle 4.1: Aminosäure-Verluste
Asp Ser Thr Ala Val Leu
AS [mg/mg Enzym] 2421 2088 2175 3018 2158 3526
AS in Novozym 435
LC 200232[mg/kg]
6640 4510 6000 6080 4650 7400
AS im Träger [%] 36.46 46.29 36.26 49.63 46.41 47.65
Tabelle 4.2:Gesamter Enzym-Verluste
AS in der Probe
[mg/kg Enzym]
AS in Novozym 435
LC 200232[mg/kg]
Verlust
[%]
23307,02 58670 60

35
Tabelle 4.3: Die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor
V2 V3 V4 V5 V5 V7 V8 V9 V10 V11 V12
Einwaage
Fettsäure
AN456N [g]
104.25 105.92 104.83 106.66 106.56 105.17 105.26 104.87 105.23 105.24 105.426
Fettsäure
AN456N
[in Mol]
0.378 0.384 0.380 0.386 0.386 0.381 0.381 0.380 0.381 0.381 0.382
Umsatz [-] 0.955 0.986 0.979 0.995 0.994 0.977 0.987 0.983 0.983 0.978 0.976
Produkt:
Triglyceride
[in Mol]
0.361 0.378 0.372 0.385 0.384 0.372 0.376 0.374 0.375 0.373 0.373
Produkt:
Triglyceride
[g/Mol]
866 866 866 866 866 866 866 866 866 866 866
Produkt:
Triglyceride
[g]
312.383 327.714 322.026 332.995 332.349 322.427 326.002 323.476 324.566 322.970 322.856
0.0035kg Novozym 435x1400€/kg = 4.90€ für 312.383g Produkt
Zusammenfassung:
 In diesem Experiment Kdeakt ist:
o Kdeakt = 7,565.10-4
[1/h]
o Feler: 3,7115.10-5
 In diesem Experiment t1/2 = 916,2884 [h]
 Enzym-Verluste: 60%
 Enzym-Kosten: 4.90€ für 312.383g Produkt

36
4.2.2. Einfluss der Enzymmenge
Bei einer Reaktion ohne Massentransportlimitierungen sollte zwischen der Aktivität eines
Enzyms und seiner eingesetzten Menge ein linearer Zusammenhang bestehen. Um diesen
Zusammenhang für das vorliegende Reaktionssystem zu ermitteln, wurden der Umsatz und die
Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Halbierung der Enzymmenge untersucht. Die
Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abbildung 4.12 und in Abbildung 4.13 dargestellt. Der
Einsatz von 1 % (w/wS) Novozym 435 führte zu einem Umsatz von 17,1 % innerhalb vom ersten
1 Stunde, wohingegen mit 2 % (w/wS) ein Umsatz von 33,1 % innerhalb vom ersten 1 Stunde
erreicht werden konnte. Der Einsatz von 3 % (w/wS) Novozym 435 führte zu einem Umsatz von
ca.50 % innerhalb vom ersten 1 Stund. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit betrug bei 1 %
(w/wS) Novozym 435 1072 U, während mit 2 % (w/wS) eine Aktivität von 2078 U erzielt werden
konnte. Bei 3% (w/wS) Novozym 435 der Aktivität ist 3044 U.
Abb. 4.12: Umsatzkurve bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2% (w/wS) und 3% (w/wS) Novozym
435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 60o
C,
Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC

37
Abb. 4.13: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2% (w/wS) und
3% (w/wS) Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure
AN456N, 60o
C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC
Die beobachteten Anfangsreaktionsgeschwindigkeit liegen im Bereich von 1-3 % (w/wS)
Novozym 435 zwischen 1072-3044 U bei 60o
C. Die Variation der Enzymbeladung zeigt, dass es
zu einem linearen Anstieg der Aktivität mit steigender Enzymbeladung kommt (Abb.4.13). Um
eine ausreichend kurze Reaktionszeit zu ermöglichen, wird eine Enzymmenge von 3% (w/wS)
Novozym 435 verwendet.
Zusammenfassung:
 Maximale Reaktionsgeschwindigkeit wird bei der Verwendung von 3% Novozym 435
erreicht. Bei dieser Konzentration der Umsatz vom ersten 1 Stunde ist 50%.
 Um eine ausreichend kurze Reaktionszeit zu ermöglichen, wird eine Enzymmenge von
3% (w/wS) Novozym 435 verwendet.

38
4.2.3. Einfluss der Begasungsrate
Die Rektion wurde mit Stickstoffbegasung durchgeführt, damit keine Oxidation der Fettsäuren
stattfand. Bei den hiezu durchgeführten Experimenten betrug der minimale Volumenstrom =
0,6 L.min-1
N2.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abbildung 4.14 und in Abbildung 4.15 dargestellt. Eine
Begasungsrate von = 0,6 L.min-1
N2 führte zu einem Umsatz von 35,5 % innerhalb vom ersten
1 Stunde, wohingegen mit = 1,20 L.min-1
N2 ein Umsatz von ca. 50 % innerhalb vom ersten 1
Stunde erreicht werden konnte. Die Begasung von = 1,80 L.min-1
N2 führte zu einem Umsatz
von 34 % innerhalb vom ersten 1 Stunde.
Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit betrug bei 0,6 L.min-1
N2 2241 U, während mit 1,20
L.min-1
eine Aktivität von 3044 U erzielt werden konnte. Bei 1,80 L.min-1
N2 its die Aktivität
2147 U.
Die geeignete Begasungsrate für Veresterung von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl
ist = 1,20 L.min-1 N2.
Abb. 4.14: Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von
C, Begasungsrate: 0,6 l/min N2, 1,20 l/min N2 und 1,80 l/min N2, BC

39
C, Begasungsrate: 0,6 l/min N2, 1,20
l/min N2 und 1,80 l/min N2 , BC
Zusammenfassung:
 Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ist bei 1,80 L.min-1
N2. Bei diser Begasungsrate
der Umsatz vom ersten 1 Stund ist 34%. Aber Aktivität von 2147 U ist geringer als
Aktivität bei einer Begasungsrate von 1,20 L.min-1
N2
 Die maximale Aktivität von 3044 U Novozym 435 wurde bei = 1,20 L.min-1
N2
beobachtet.
 Die geeignete Begasungsrate für Veresterung von Glycerin und Fettsäure aus
Sonnenblumenöl ist = 1,20 L.min-1
N2

40
4.2.4. Einfluss der Tempetatur
Innerhalb dieses Abschnitts wurde die Reaktionsgeschwindigkeit der Veresterung von Glycerin
und Fettsäuren aus Sonnenblumenöl als Funktion der Temperatur analysiert.
Abb. 4.16: Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin
mit Fettsäure bei verschiedenen Temperaturen: 55o
C, 60o
C und 65o
C. Reaktionsbedingungen:
0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator; Begasungsrate: 1,20
l/min N2, BC
Abb. 4.17: Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von
(w/wS) Biokatalysator, Temperatur: 55o
C, 60o
C und 65o
C; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC

41
mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, Temperatur: 55o
C, 60o
C und 65o
C;
Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC
Die maximale Anfangsreaktionsgeschwindigkeit wurde bei einer Temperatur von 65°C erreicht
und betrug die Aktivität von 3307 U. Bei einer Temperatur von 60°C hatte das Enzym eine
Aktivität von 3044 U, während bei 55°C Reaktionstemperatur nur noch eine
Anfangsreaktionsgeschwindigkeit von 2381 U bestimmt werden konnte. Innerhalb vom ersten 1
Stund konnten bei 55°C - 38 % Umsatz erzielt werden, während bei 60°C ca.50 %. Bei 65°C
betrug der Umsatz vom ersten 1 Stund 53 %.
Zusammenfassung:
 Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei einer Temperatur von 65o
C erreicht.
Bei dieser Temperatur war der Umsatz innerhalb der ersten 1 Stunde 53%.
 Die geeignete Reaktionstemperatur für Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl
ist 65o
C.

42
4.3. Vergleich des Rührkesselreaktor mit dem Blasensäulenreaktor
Beim Vergleich der Reaktionsverläufe des Rührkesselreaktor und des Blasensäulenreaktor ist zu
erkennen, dass die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit im Blasensäulenreaktor höher ist als im
Rührkesselreaktor (Abb.4.19).
Abb. 4.19: Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl im
Rührkesselreaktor und im Blasensäulenreaktor. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38
mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Novozym 435, STR: 65 rpm und Vakuum, BS: 1,20 l/min N2
Der Vergleich der Umsatzverläufe der Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl mittels
Novozym 435 im Rührkesselreaktor und Blasensäulenreaktor in Abbildung 4.20 zeigt die
Reaktion im Rührkesselreaktor wesentlich langsamer ist als in der Blasensäule.

43
Abb. 4.20: Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl im
Rührkesselreaktor und im Blasensäulenreaktor. Reaktionsbedingungen: 11g Glycerin, 105g
Fettsäure AN456N, 60o
C, 3% (w/ws) Novozym 435, STR 65rpm und Vakuum, BS:1,20 l/min N2
Der Vergleich der Aktivität der Veresterung von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl
mittels Novozym 435 im Rührkesselreaktor und Blasensäulenreaktor in Abbildung 4.21 zeigt,
dass in der Veresterung im Rührkesselreaktor wesentlich weniger Aktivität ermittelt wurde.
Abb. 4.21: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure aus
C, STR 65rpm und Vakuum, BC: 1,20
l/min N2

44
Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 60o
C und einer
Enzymkonzentration von 3% (w/wS) liegt im STR bei 476 U wohingegen sie im BC 3044 U
beträgt. Dieses ist mit dem unterschiedlichen Energieeintrag in die beiden Reaktortypen zu
begründen.
Zusammenfassung:
 Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 60o
C und einer
Enzymkonzentration von 3% (w/wS) liegt im STR bei 476 U wohingegen sie im BC 3044
U beträgt.
 Die Blasensäule ist daher der geeignete Reaktor für die Versterung von Glycerin und
Fettsäuren aus Sonnenblumenöl mittels Novozym 435.

45
Kapitel 5
5. Diskussion und Ausblick
Im Rahmen dieses Versuchs wurden der enzymatischen Veresterung von Glycerin und
Fettsäuren aus Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozyme 435 im Blasensäulenreaktor und die
Wirtschaftlichkeit des Prozesses Veresterung bestimmt.
Das Reaktorkonzepte basiert auf einer Blasensäule, die mit Sticksoff durchströmt wird, wobei
das eingetragene Gas zum Einen die Aufgabe hat die Reaktanden zu mischen beziehungsweise
zu emulgieren und zum Anderen dazu dient, das entstehende Reaktionswasser auszutragen. Als
Katalysator wird Novozym 435, ein kovalent gebundener Biokatalysator auf Basis von CALB im
Blasensäulenreaktor verwendet. Die Unterschiede und Charakteristika der verschiedenen in
dieser Arbeit verwendeten Reaktoren sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst.
Tabelle 5.1: Charakteristika und unterschiedlichen Reaktortypen
Reaktor Energieeintrag Wasserabtrennung
STR KPG-Rührer Vakuum
BC Gasblasen Begasung
Auf Grund der Heterogenität vom Biokatalysator und der Viskosität der Reaktanden kann es zu
verschiedenen Massentransportlimitierungen bei der lösungsmittelfreien Veresterung kommen.
Diese Limitierungen können unter anderem in der Durchmischung und Dispersion der
Reaktanden und des Katalysators oder aber in der Diffusion in porösen Träger des Katalysators
liegen.
Die Deaktivierung und die Halbwertszeit bringt die Stabilität eines Katalysators. In diesem
Experiment sie sind: Kdeakt = 7,5.10-4
[1/h] mit einem Feler von 3,7.10-5
und t1/2 = 9-16 [h]. Mit
Ergebnissen von der Aminosäureanalyse wurde der Enzym-Verlustes und die Wirtschaftlichkeit
(Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor bestimmt (Tab. 4.1 und 4.2): Enzym-Kosten:
4.90€ für 312.383g Produkt.

46
Kapitel 6
6. Zusammenfassung
Innerhalb der vorliegenden Bachelorarbeit wurde ein Prozess für die enzymatische Veresterung
von Glycerin mit Fettsäuren aus Sonnenblumenöl ohne die Verwendung von organischen
Lösungsmitteln untersucht. Die hergestellten Produkte sind Fettsäureester von Glycerin.
Verwendet wurde immobilisierte Lipase B von Candida antarctica als Novozym 435.
Die Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl im STR mit Novozym 435 ist sehr
langsam. Innerhalb der ersten 24 Stunden konnten bei 60o
C etwa 40-42% Umsatz erzielt
werden. Die Säurezahl betrug dabei 112 mg KOH/g Probe. Ein großes Problem bei der
Verwendung von immobilisierten Enzymen in Rührkesselreaktoren besteht allerdings darin, dass
die Immobilisate durch den Eintrag von mechanischer Energie zerstört werden. Der in dieser
Arbeit verwendete Blasensäulenreaktor bot die Möglichkeit, das Reaktionssystem ohne
Energieeintrag durch mechanische Komponenten zu durchmischen. Der dafür verwendete
Stickstoffstrom ermöglichte es zudem, das Reaktionswasser ohne die Verwendung von Vakuum
auszutragen.
Bei einer Reaktion ohne Massentransportlimitierungen sollte zwischen der Aktivität eines
Enzyms und seiner eingesetzten Menge ein linearer Zusammenhang bestehen. Um diesen
Zusammenhang für das vorliegende Reaktionssystem zu ermitteln, wurden der Umsatz und die
Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Halbierung der Enzymmenge untersucht. Der Einsatz
von 1 % (w/wS) Novozym 435 führte zu einem Umsatz von 17,1 % innerhalb der ersten Stunde,
wohingegen mit 2 % (w/wS) ein Umsatz von 33,1 % innerhalb der ersten Stunde erreicht werden
konnte. Der Einsatz von 3 % (w/wS) Novozym 435 führte zu einem Umsatz von ca.50 %
innerhalb der ersten Stunde. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit betrug bei 1 % (w/wS)
Novozym 435 1072 U, während mit 2 % (w/wS) eine Aktivität von 2078 U erzielt werden
konnte. Bei 3% (w/wS) Novozym 435 war der Aktivität 3044 U. Die Variation der
Enzymbeladung zeigt, dass es zu einem linearen Anstieg der Aktivität mit steigender

47
Enzymbeladung kommt. Um eine ausreichend kurze Reaktionszeit zu ermöglichen, wird eine
Enzymmenge von 3% (w/wS) Novozym 435 verwendet.
Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei 1,80 L.min-1
N2 erreicht. Bei dieser
Begasungsrate wurde ein Umsatz von 34% innerhalb der ersten Stunde erzielt. Aber die Aktivität
von 2147 U ist bei einer Begasungsrate von 1,80 L.min-1
N2 geringer als Aktivität bei einer
Begasungsrate von 1,20 L.min-1
N2. Die maximale Aktivität von 3044 U Novozym 435 wurde
bei = 1,20 L.min-1
N2 beobachtet. Die geeignete Begasungsrate für Veresterung von Glycerin
und Fettsäure aus Sonnenblumenöl ist = 1,20 L.min-1
N2.
Die maximale Anfangsreaktionsgeschwindigkeit wurde bei einer Temperatur von 65°C
erreicht und betrug die Aktivität von 3307 U. Bei einer Temperatur von 60°C hatte das Enzym
eine Aktivität von 3044 U, während bei 55°C Reaktionstemperatur nur noch eine
Anfangsreaktionsgeschwindigkeit von 2381 U bestimmt werden konnte. Die geeignete
Reaktionstemperatur für Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl ist 65°C.
Beim Vergleich der Reaktionsverläufe des Rührkesselreaktor und des Blasensäulenreaktor ist zu
erkennen, dass die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit im Blasensäulenreaktor höher ist als im
Rührkesselreaktor. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 60o
C und
einer Enzymkonzentration von 3% (w/wS) liegt im STR bei 476 U wohingegen sie im BC 3044
U beträgt. Dieses ist mit dem unterschiedlichen Energieeintrag in die beiden Reaktortypen zu
begründen.

48
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