1. Kestelman Valentin M2 SVS :
Biologie des interactions du gène aux populations
Encadrants
Dr. Lorraine Bottin; Dr. Thierry Thibaut & Doctorante Pauline Robvieux
EA 4228 Ecomers
1

2. Algues structurantes
Structurent l’habitat : ingénieur de l’écosystème
(sensu Jones et al. 1994)
Disparition de l’algue  Perte de la biodiversité
(Benedetti-Cecchi, 2001)
Pacifique : Kelps
Atlantique : Laminaria ou Fucus
Méditerranée : Cystoseira
(Mann, 1973)
(Steneck et al., 2003)
2
(Photo : T.Thibaut)

3. Cystoseira en Méditerranée
Genre Cystoseira : 28 taxons dont 20
endémiques
Depuis la surface jusqu’à 80 m de
profondeur
En forte régression (Thibaut et al., 2005)
causes anthropiques :
Surpâturage
Rejet d’eaux usées, eutrophisation
Sensibles aux perturbations : mesure
la qualité de l’environnement littoral
marin (Ballesteros et al., 2007)
3La saupe, un herbivore
Population impactée
(Photos: T.Thibaut)

4. Cystoseira amentacea var. stricta
Diploïde, cycle monogénétique
(Gomez-Garreta et al., 2000)
Zygotes 100 µm, membrane
collante (Susini, 2006)
Dispersion estimée très faible
40 cm max (Mangialajo et al., 2012)
Isolement par la distance attendu
Source : Gomez-Garreta et al., 2000
Animation : Amber Rais
4
Cartographie Ceinture dense
(Photo: P. Robvieux)

5. Etat des connaissances
Etudes préliminaires :
RAPDs, marqueurs dominants, difficilement reproductibles
(Susini et al., 2007)
Microsatellites neutres, codominants, polymorphes
8 marqueurs disponibles  Structuration inter-population
(Robvieux et al., 2012)
Existe-t-il une structuration intra-population ?
Objectifs de l’étude
Décrire la structure génétique
Clarifier la distance de dispersion des recrues
Effet de perturbations anthropiques sur la structure
génétique
5

6. Matériel et méthodes
Terrain
Localisation des populations
P1
n = 43
P2
n = 45
nP1
n = 45
nP2
n = 45
Échantillonnage
Perturbation Population fragmentée 6
(Photos: T.Thibaut & A. Blanfuné)

7. 7
P1P2
nP1
nP2
xy
x
y
x
y
x
y
(Diagrammes : A. Blanfuné)

8. Matériel et méthodes
Laboratoire
Extraction d’ADN
PCR microsatellites
Analyse des génotypes
Traitement des données 8
Génotypage

9. Hypothèses testées
En panmixie (reproduction
aléatoire)
Equilibre de Hardy-
Weinberg (HW) : He = Ho
Ecart à HW : He ≠ Ho
Ecart à la panmixie
(Consanguinité, Effet
Wahlund)
F (Fis et Fst)
Déficit en hétérozygote
Autocorrélation spatiale
Détecter une structure
génétique dans l’espace
9
Effet Wahlund
Structure génétique spatiale
(Hamilton, 2009)

10. Résultats :
Richesse, Fis et Différentiation
P1 P2 nP1 nP2
Richesse allélique 3,252 3,097 3,645 2,880
Fis 0,112 *** 0,092 *** 0,077 *** 0,004 ns
P1 P2 nP1 nP2
P1 -
P2 0,372 *** -
nP1 0,419 *** 0,304 *** -
nP2 0,500 *** 0,479 *** 0,415 *** -
Richesse allélique et écart à la panmixie
Fst par paires de populations
10
P : Perturbé
nP : Non perturbé

11. Autocorrélation spatiale
Panmixie Isolement par la distance
Hamilton 2009
11
I de moran
Distance entre paires d’individus

12. Résultats : autocorrélation spatiale
 Absence de structure
génétique spatiale
 Pas d’isolement par
la distance à cette
échelle
 Pourtant déficit en Ho
pour nP1
 Consanguinité à nP1
et pas nP2 ?
Distance en cm
Pairwise kinship coefficient
Erreur Standard
IC 95 %
12

13. Résultats : autocorrélation spatiale
Structure
génétique spatiale
< 30 cm
Structure liée à la
taille des patchs ?
Pairwise kinship coefficient
13
Erreur Standard
IC 95 %
Distance en cm

14. Pollution et structure
génétique
Hypothèses :
Fragmentation depuis la perturbation,
bottleneck (goulot d’étranglement)
Disparition locale, puis recolonisation
 Pas à pas
 De manière aléatoire
1952 1997 2012
Rejets des eaux usées de
Toulon sans traitement
Usine de traitement
des eaux opérationnelle Structure génétique
spatiale observée
14
(Photos: T.Thibaut)

15. Conclusion
Populations non perturbées : non fragmentées
Fis nul ou faible
Pas d’isolement par la distance
Populations perturbées, fragmentées
Structure génétique, effet Wahlund
Patch d’individus apparentés
 Effet des perturbations
15

16. Perspectives
Lien entre génétique
et environnement
Pente / Vagues
Dispersion des zygotes / gamètes
Transplantation
Augmenter le nombre de sites à
échantillonner
Relargage et survie des gamètes
Gamètes in vitro
Stimulus  Relargage gamètes ?
Influence des vagues ?
16
(Photo: P.Robvieux)

17. Merci de votre attention
17
(Photos: P.Robvieux)

18. 18
nP1 : St-Jean-Cap-Ferrat
(Diagrammes : A. Blanfuné)

19. 19
nP2 : Cap Martin
(Diagrammes : A. Blanfuné)

20. 20
P1 : Cap Sicié A
(Diagrammes : A. Blanfuné)

21. 21
P2 : Cap Sicié B
(Diagrammes : A. Blanfuné)

22. 22
680 km
680 km
Provence Alpes Côte d’Azur Region
Corsica
C. amentacea : distribution of the species in France
(Cartes fournis par P. Robvieux)

23. CSA CSB SJCF CM
24 « monomorphe » : 154
Par population
Par locus
23

24. 24
PATCHINESS
Analysis of Variance Table
Response: Ar
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
Pop 7 0.3449 0.04928 0.1530 0.99276
Locus 1 0.9963 0.99633 3.0943 0.08507 .
Residuals 47 15.1333 0.32198
---
Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1
> anova(glm(patchm,family=quasipoisson),test="Chisq")
Analysis of Deviance Table
Model: quasipoisson, link: log
Response: Ar
Terms added sequentially (first to last)
Df Deviance Resid. Df Resid. Dev Pr(>Chi)
NULL 55 9.9784
Pop 7 0.21106 48 9.7673 0.9936
Locus 1 0.59654 47 9.1708 0.0822 .
---
Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1
Pas de variation détectable
Trop peu d’individus…

25.  PCR product from: 9 to 168.
Length: 160 bp.
The sequence of the PCR primers replaces the template
sequence.
 GTGTGGTCCTTGCTTCGTCACGTATACAGCAATAGTTG
TATAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTCATGTGACTGTT
TTTTGTCCACTATTTCATCCAAACCCATACACATTACAC
ATCATCTGCCAATACGAACAAACAAAACCAGAGCTGTC
AAGCATGC
 Amplicon attendu : 160 pb, observé (partout) 154 pb
25

26. 26
3 Pics CSA
Impair CSB
??? SJCF
Presque OK CM

27.  Uniquement population CSB (Locus 27)
27
En bleu sur le graphe…

28. Potentiellement
contaminés
15 15
Perdus
7 0
28
1 témoin pour 15 echantillons
1 contamination : Mix2 (Locus 20 et 35)
Témoin 3 : Locus 20 – 223/223 – Locus 35 – 188/201
Certains individus « liés » au T3
présentent un signal
223 en hétérozygote
Aucun individu « lié » au T3,
Ne présente de signal à 201 pb

29. 29
J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2ndEdition ©2005 Elsevier Academic Press
Stuttering : Petits signal à 1 répétition
Large allele dropout : Signal réduit
à plus grande pb
Quantité/qualité de l’ADN
+/- A à la fin de la séquence
Allèles nuls, pas de signal
http://www.uvm.edu/~biology/Classes/296D/6_Biology.pdf

30. 30Tiré du manuel de micro-checker
Micro-checker

31. Connus : pour le pollen dispersion de type « Leptokurtique »,
la grande majorité proche de la source mais aussi rares évènement
à longue distance
Ex : Centaurea corymbosa (Hardy, et al. 2004)
31

32. (Gomez-garreta et al., 2000)
n : Noyau
fa : Flagelle antérieure
fp : Flagelle postérieure
m : mastigonemes
(Clayton et al., 1992)
D’un µ-envt à un autre
Grande dispersion : Large + Courant
32

33. 33
Gomez-Garreta et al., 2000

34. Sites échantillonnés
Etude des courants (Ifremer)
34

35. Song et al., 1996
Fluorescence
Phosphorescence
35

36. 36

37. g
a
b
p
q =1 - p
aa : p²
ab : p*q + p*q = He
bb : q²
Multi-allèle
Homozygote
He : 1 - Q
(Hamilton, 2009)
37

38.  Le nombre d’alléles observés dépend fortement
de la taille de l’échantillon
 Méthode de raréfaction pour « lisser » les
différentes tailles
 Estime le nombre attendu d’allèles dans un sous-
echantillon de 2n gènes, 2N ayant été
echantillonés.
 Terme sous la somme : probabilité d’échantilloner
l’allèle i au moins une fois dans un echantillon de
taille 2n
38

39. 39

40. Le dénominateur du premier terme « pondère» la contribution des allèles et
permet à cet estimateur de ne pas souffrir de biais particulier en présence
d’allèle de faible fréquence.
Le second terme ajuste le biais attribuable à la taille d’échantillonnage.
(d’après Oddou-Muratorio et al., 2004)
Le numérateur est plus grand quand les paires d’individus (populations) ont des fréquences
alléliques qui sont chacune très différentes de la fréquence allélique moyenne. Valeurs
possible de -1 à +1 avec une quantité suffisante d’échantillons.
Valeur positive, signifie que les fréquences alléliques entre pairs d’individus, sont similaire
en moyenne. Négative : les fréquences alléliques entre pairs d’individus diffèrent en
moyenne.
Une valeur de zéro indique que les différences ne sont pas liées à la distance, ou que la
variation génétique est aléatoire dans l’espace. (d’après Hamilton, 2009)
40