Recomendados
Mais conteúdo relacionado
Mais procurados
Mais procurados (20)
Destaque
Destaque (20)
Semelhante a Biología molecular aplicada a inmunohematología
Semelhante a Biología molecular aplicada a inmunohematología (20)
Mais de Trishdeish
Último
Último (20)
Biología molecular aplicada a inmunohematología
- 1. Biología Molecular aplicada a Inmunohematología Patricia Peralta Moncada Universidad de Chile
- 2. Temas a tratar • Introducción. • Utilidades de las técnicas moleculares en inmunohematología. • Técnicas utilizadas. • Revisión rápida de un trabajo de investigación. • Conclusiones.
- 3. Introducción • La hemaglutinación ha permitido el desarrollo y la práctica de la medicina transfusional durante el siglo XX. • La reacción entre los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos (suero de pacientes o reactivos comerciales) es la base de las técnicas en inmunohematología: • Determinación de grupoABO, Rh. • Determinación de antígenos de significancia clínica (Kell, MNS, Kidd, Duffy) • Detección de anticuerpos irregulares. • Pruebas de compatibilidad. • Limitaciones: • Fenotipo de pacientes politransfundidos. • Fenotipo de pacientes conGR recubiertos de Ig. • Identificación de variantes. • Discrepancias. • Falta de reactivos para detección de algunos antígenos. • Dificultad para crear paneles de detección e identificación de anticuerpos irregulares.
- 4. Introducción • Las técnicas que involucran al ADN han llevado a entender las bases moleculares de muchos de los sistemas sanguíneos. • Existen muchos eventos moleculares que llevan a la formación de antígenos distintos, y por ende, fenotipos distintos. • La mayoría son consecuencia de SNPs (single-nucleotide polymorphism). Eventos moleculares que llevan a antígenos y fenotipos de los grupos sanguíneos Conversión genética o eventos de recombinación (MNSs, Rh, Ch/Rg) Duplicación de un exón (Gerbich) Deleción de un gen, exón o nucleótidos (ABO, Rh, MNS, Kel, Duffy, Dombrock) Inserción de nucleótido (s) (Rh, Colton) Sustituciones de un solo nucleótido SNPs (La mayoría) Las técnicas moleculares aprovechan esto para la Genotipificación
- 5. Utilidades Pacientes con transfusiones múltiples • Como complemento a la investigación serológica. • Se recomienda la genotipificación en pacientes con múltiples transfusiones como parte del proceso de identificación de anticuerpos. • Particularmente útil en pacientes dependientes de transfusiones que han producido aloanticuerpos. Pacientes con GR recubiertos de IgG (AHAI) • No pueden ser fenotipificados de manera exacta la mayoría de las veces. • Mejoraría la posibilidad de encontrar unidades compatibles.
- 6. Utilidades Donantes • Para posibles transfusiones de la unidad (búsqueda de unidades antígeno negativos). • Para crear paneles de células para búsqueda de anticuerpos irregulares. Resolución de discrepancias • D débil y parcial • DiscrepanciasABO Materno-fetal • Para prevención de EHRN (por incompatibilidad Rh). • DNA fetal se puede obtener a partir de células amnióticas, muestras de vellosidades coriónicas y de plasma materno.
- 7. Técnicas moleculares para el análisis genético de grupos sanguíneos. • Amplificación de ADN por PCR • PCR-alelo-especifico • PCR-RFLP • PCR-multiplex • Secuenciación • Real time PCR • Microarray Complementarias o independientes.
- 8. PCR convencional • Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction). • 3 procesos que se repiten por cada ciclo: 1. Denaturación 2. Apareamiento 3. Extensión • Basado en las características de los ácidos nucleicos: 1. Mimetiza el proceso de replicación del ADN. 2. Capacidad de separarse (denaturación) y volver a hibridarse (renaturación). 3. Complementariedad de bases (A=T; G=C). • Equipo: Termociclador. • Detección: Electroforesis en gel de agarosa con tinción (Bromuro de etidio, GelRed)
- 10. PCR Alelo Específico • Uso de partidores secuencia específica. • Permite la identificación de secuencias específicas para identificar distintos alelos de un gen. Mixes de reacción pre-alicuotados basados en PCR - Sequence Specific Primers (SSP). Genotipificación rápida. Complemento a tipificación serológica.
- 11. PCR-RFLP • RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphysm. • Tratamiento del DNA amplificado por PCR o tratamiento del DNA a amplificar con enzimas de restricción para generar cortes en secuencias específicas. • Se obtiene un patrón de bandeo dependiendo de los cortes realizados por las enzimas. Ejemplo: “How do we identify RHD variants using a practicalmolecular approach?” Fenotipo D Polimorfismo relacionado D débil tipo 1 809T>G; ApaLI D débil tipo 2 1154G>C; AluI D débil tipo 3 8C>G; SacI DAR-1 957G>A; BseYI
- 12. PCR-multiplex • Amplificación de la muestra de ADN utilizando varios sets de primers a la vez, en un mismo mix de reacción, que son específicos para diferentes regiones de la secuencias deADN. • Para la detección por electroforesis, se debe tener en cuenta el diseño de los partidores para obtener productos de diferentes tamaños. High-throughputmultiplex PCR genotyping for 35 red blood cell antigens in blood donors
- 13. Real Time PCR • Variante de la PCR convencional en la cual se puede cuantificar el producto simultáneamente a su amplificación (Detección en tiempo real del producto). • Se distinguen entre sí por el método de detección: • Fluorocromo no específico: • SYBR Green (se une a cualquier molécula de ADN). • Fluorocromo específico (sonda): • Sondas TaqMan • Sondas Molecular Beacons • Sondas Scorpion • Se cuantifica la fluorescencia emitida
- 14. Real Time PCR CT: Ciclo Umbral (Threshold cycle): Nº de ciclo donde la señal cruza el umbral de detección
- 15. Secuenciación • Técnica mediante la cual se logra conocer la secuencia nucleotídica de la porción de ADN a analizar. • La gran mayoría está basado en el método de Sanger y Rapley. ¿Cuándo secuenciar? Serología Genotipificación Secuenciación
- 16. Microarrays • Chip de DNA: Son una colección de sets de fragmentos de ADN adheridas de forma ordenada a una superficie sólida. • Para genotipificar múltiples regiones del genoma simultáneamente. • Se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos de hibridar con su complementario. • Detección: marcaje de la muestra con fluorocromos, plata o quimioluminiscencia. • Análisis de datos: bioinformática. Softwares especializados para cada chip con bases de datos para generar los genotipos.
- 17. Microarrays • En una misma prueba genera sobre 3000 resultados. • Se basa en la detección de SNPs. • El DNA genómico target aislado de sangre total se amplifica, se captura y se marca con fluorescencia por elongación en sondas alelo específicas inmovilizadas en micropartículas sintéticas. La fluorescencia de cada perla se analiza en el Array Imaging System (AIS). El software BioArray Solutions Information System (BASIS) calcula y ajusta la intensidad de cada reacción para asignar un genotipo y predecir un fenotipo para cada polimorfismo.
- 18. Microarrays
- 19. How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? Revista Transfusion, volumen 54, Abril de 2014.
- 20. How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? Revista Transfusion, volumen Importancia: • Prevenir la aloinmunización en receptores. Receptor D parcial Tipificado Rh+ (Sueros clasificadores) Transfusión con Rh+ 54, Abril de 2014. Formación de anti-D Donante D débil Tipificado Rh- (Sueros clasificadores) Transfundido a receptor Rh- Formación de anti-D
- 21. How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? Estrategia: Método fácil y racional para la identificación de las variantes D más comunes usando un camino más corto y menos caro en comparación a otros métodos moleculares comerciales. Algoritmo basado en la genética molecular de RHD, polimorfismos de D, frecuencias de las D variantes en diferentes poblaciones y asociación con los alelos RHCE. (Búsqueda en bases de datos ISBT y Rhesus Site) • 360 muestras con expresión atípica del antígeno D (Reactividad menor de 3+ en la tipificación D). • PCR multiplex basado en Genotyping of RHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specific exons (Maaskant-van Wijk y cols.) • Seis sets de primers específicos para la amplificación de los exones 3, 4, 5, 6, 7 y 9 del gen RHD. Adaptación: 5 sets que amplifican los exons 3, 4, 5, 7 y 9 • Localizados en las regiones donde se pueden encontrar SNPs causantes de muchos D variantes. • Basado en los resultados, combinados con la asociación a los alelos RHCE y las frecuencias de las variantes, se decide el protocolo a utilizar.
- 22. How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? 1. PCR multiplex 2. PCR-RFLP 3. Secuenciación de DNA
- 23. How do we identify RHD variants using a practical molecular approach?
- 25. How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? • PCR multiplex + 1 PCR-RFLP 84 muestras (23% ). • PCR multiplex + 2 PCR-RFLP 135 muestras (37%). • PCR multiplex + 3 o más PCR-RFLP + secuenciación de un exón 121 muestras (33%). Ventajas: • PCR multiplex + PCR-RFLP toman aproximadamente 2 horas (corto tiempo). • Más barato que microarrays o secuenciar los 10 exones. • Identificación de variantes no cubiertas en microarrays (11,6% de las muestras estudiadas). • Útil para resolver discrepancias RhD y distinguir entre D débil o parcial. • Puede ser adaptado a otras poblaciones.
- 26. Conclusiones • La existencia de las técnicas moleculares facilita la resolución de problemas que no pueden ser resueltos con la hemaglutinación. • Reactividad débil de algunos reactivos para ciertos antígenos. • Tipificación de pacientes con transfusiones recientes. • Identificación de riesgo de EHRN. • Aumentar la fiabilidad de unidades antígeno negativos para transfusión. • Llegar a un genotipo no significa necesariamente que el antígeno se va a expresar en el GR. • La mayoría de estas técnicas son muy costosas, por lo cual el enfoque que se está dando en los estudios es la creación de algoritmos de identificación para disminuir costos, manteniendo la calidad.
- 27. Bibliografía • Mariza Mota,MD,PhD. Hospital Israelita Albert Einstein – São Paulo, Brasil. 06 y 07 /10 /2011. Jornada de Hematologia y Medicina Transfusional de la Sociedad Chilena de Hematologia. ACTUALIZACIÓN EN INMUHEMATOLOGIA: NUEVAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS. Extraído de http://www.hematologia.org/bases/arch889.pdf • http://www.bag-healthcare.com/uploads/media/BAG_Broschuere_v_BAGene-01eng.pdf • ARUP Laboratories. Blood Group Microarray, Nine Blood Groups For genotyping the ABO, RhD/RhCE, Duffy, Kell, Kidd, Diego, Dombrock, Colton, and MNS blood groups. FEBRUARY 2010. • Secuenciación de ADN. Extraído de: http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm#Metautomatico • Axel Seltsam and Andrea Doescher. Transfus Med Hemother. Sequence-Based Typing of Human Blood Groups. Jun 2009; 36(3): 204–212. Published online May 14, 2009. doi: 10.1159/000217322. Extraído de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2980529/ • BioArrayTM HEA BeadChipTM. Extended Red Blood Cell Antigen Typing by DNA Analysis. Extraído de http://www.immucor.com/en-us/Products/Documents/BioArray_HEA_SalesSheet.pdf • Castilho Lilian, Pellegrino Júnior Jordão. Blood group genotyping. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. [serial on the Internet]. 2004 [cited 2014 Sep 15] ; 26( 2 ): 135-140. Disponible en: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842004000200012&lng=en. http://dx.doi.org/10.1590/S1516-84842004000200012. • Arnoni, C. P., Latini, F. R.M., Muniz, J. G., Gazito, D., Person, R. d. M., de Paula Vendrame, T. A., Barreto, J. A. and Castilho, L. (2014), How do we identify RHD variants using a practical molecular approach?. Transfusion, 54: 962– 969. doi: 10.1111/trf.12557
- 28. Biología Molecular aplicada a Inmunohematología Patricia Peralta Moncada Universidad de Chile
Notas do Editor
- Dificultad en obtener la inclusión de células homocigotas para los ags D, C, c, E, e, Fya, Jka, S y ags de baja incidencia
- Permite una mejor selección de unidades compatibles para pacientes con discrepancias entre genotipo y fenotipo., aumentando la sobrevida de los GR transfundidos y reduciendo la frecuencia de las transfusiones. Posibilidad: Considerar que la AHAI puede deberse a anticuerpos sin especificidad definida. (No saltar la PC) Es importante decir que la interpretación de los resultados de Genotipificación se debe tener en cuenta que no garantiza la expresión del antígeno debido a los cambios post-traduccionales, o mutaciones en los promotores (Ej: duffy y mutacion en caja GATA)
- C. Útil para transfundir la unidad (Base de datos de donante y sus ag), y para crear paneles de identificacion de anticuerpos irregulares (Búsqueda de células homocigotas y heterocigotas para ciertos alelos). E. Menos de 35 copias/mL de DNA de células fetales libres en el plasma materno se puede usar para Genotipificación de feto, no así como en DNA aislado de la fracción celular de muestras de sangre maternas. Es posible determinar por PCR el RHD fetal.
- 1. Denaturación: Se recomiendan temperaturas de 94ºC durante 30 segundos a 1 minuto. Un alto contenido de G+C puede aumentar el tiempo. Se suele añadir un período de desnaturación inicial previo al comienzo de los ciclos de PCR que suele ser de 5 minutos a 94ºC para asegurar la denaturación de la hebra completa. 2. Hibridación (Apareamiento): La Tº y el tiempo dependerán de 3 factores relacionado a los oligonucleótidos: composición de las bases, tamaño y concentración (Primers). Va entre 45ºC y 65ºC, durante 30 segundos a 1 minuto. EL aumento de temperatura y del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones inespecíficas de los primers con la hebra molde. 3. Elongación: Temperatura entre 70 y 72ºC. El tiempo depende del tamaño del producto esperado. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 KB. Usualmente se agrega una extensión final al terminar todos los ciclos de 5 minutos a 72ºC. FUNDAMENTOS: 1. Mimetiza el proceso de replicación: La técnica se basa en la replicación del DNA realizada por la DNA polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de DNA en sentido 5`→ 3` usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados primers. 2. Capacidad del DNA para desnaturalizarse/ renaturalizarse por calor/frío 3. Complementariedad de bases nitrogenadas (A-T /C-G) Otra detección: Gel de poliacrilamida y tinción de nitrato de plata (AgNO3)
- 1. Denaturación: Se recomiendan temperaturas de 94ºC durante 30 segundos a 1 minuto. Un alto contenido de G+C puede aumentar el tiempo. Se suele añadir un período de desnaturación inicial previo al comienzo de los ciclos de PCR que suele ser de 5 minutos a 94ºC para asegurar la denaturación de la hebra completa. 2. Hibridación (Apareamiento): La Tº y el tiempo dependerán de 3 factores relacionado a los oligonucleótidos: composición de las bases, tamaño y concentración (Primers). Va entre 45ºC y 65ºC, durante 30 segundos a 1 minuto. EL aumento de temperatura y del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones inespecíficas de los primers con la hebra molde. 3. Elongación: Temperatura entre 70 y 72ºC. El tiempo depende del tamaño del producto esperado. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 KB. Usualmente se agrega una extensión final al terminar todos los ciclos de 5 minutos a 72ºC.
- How do we identify RHD variants using a practical molecular approach?
- Es una PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de iniciadores en un único tubo de reacción con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción todos los pares de iniciadores de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. La ventaja de esta PCR es que se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, utilizando menor cantidad de molde para el análisis y menor cantidad de reactivos. La prueba para 35 genotipos fue llevada a cabo en 6 mix de reacción multiplex que consistieron en hasta 7 diferentes targets de amplificación por mix. El producto de PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa. El ensayo incluyó 12 antígenos de alta frecuencia. En cada reacción se incluyeron SNPs de alta incidencia que sirvieron como controles internos. Al mezclar 2 o 3 alelos de HFAs con algunos de frecuencia baja o promedio en un mix de reacción, en la detección en el gel de agarosa se logra la separación de las bandas y pudo ser fácilmente interpretado. Fue realizadon en microplacas de 96 pocillos. Se pudieron tipificar 16 individuos para 35 genotipos cada uno por placa, equivalente a 560 tests en una microplaca. Los pares de primers consistieron en al menos uno SSP para la determinación de los 35 polimorfismos, con productos que variaron entre 209 – 713 pb. Tabla 2: La distribución de los ensayos de PCR multiplex en 6 mixes de reacción, conteniendo entre 5 a 7 pares de primers por mix.
- Da la posibilidad de detectar en tiempo real la amplificación de nuestro genoma de interés. Detección: Inespecífica: SYBR Green, se asocia a la molécula de ADN interactuando con la hendidura menor del ADN. Emite fluorescencia en el rango del color verde (peak de absorción en λ = 498 nm y el de emisión en λ = 522 nm) Específicas basadas en sondas: fragmento de ADN complementario a una región del ADN que queremos amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta fluorescencia ("quencher”). Taqman: Hibrida al centro del producto de PCR. Cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del "quencher" y emite fluorescencia al ser excitada con un láser. Fluorescencia que está relacionada con la cantidad de amplicón producido. Beacons: Forma una horquilla debido a que tiene una zona de apareamineto de bases. El presencia del amplicón, la horquilla se abre, e hibrida con el amplicón, en el giro de la horquilla, que es la región complementaria a éste. Al final de la zona complementaria tiene en un extremo el fluoróforo donador o reportero (5’) y al 3’ el quencher. Cuando se abre emite fluorescencia. Scorpion: Similar a Beacons por su estructura de horquilla, pero tienen un primer adherido en la región del quencher. La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En general para que sea válida esta técnica requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. Utilidad en Genotipificación? La mayoría de los estudios son realizados con PCR convencional con SSP, RFLP o multiplex.
- Esto mismo se grafica en relación al Ct (eje Y) y log de ADN correspondiente al log de la fluorescencia (eje X). Obteniendo una recta.
- Para la investigación de sospecha de mutaciones, la secuenciación es una herramienta muy ponderosa. La mayoría está basado en la secuenciación de Sanger (Didesoxinucleótidos terminadores de cadena). Se introdujeron al mercado terminadores de cadena marcados con tinciones, que aumentaron la fiabilidad por ciclo de secuenciación de productos de PCR. Cada terminador (didesoxinucleótido trifosfato o ddNTPs) está marcado con una tinción fluorescente diferente y se une covalentemente al amplicón durante la reacción de extension. Los productos resultantes se separan por electroforesis capilar y son detectados con tecnología laser. Durante el proceso se genera un electroferograma, que representa gráficamente la secuencia del product de PCR. El método clásico para pruebas de grupos sanguíneos es la hemaglutinación (S y E apropiados, simple y no costosa). Algunas veces limitada. TAD+. Tx recientes. Tipificación basado en DNA es muy útil cuando la hemaglutinación es limitada. Hasta el momento, son utilizadas como complemento a la hemaglutinación. Cada día es más común que en los laboratorios clínicos complementen con técnicas moleculares cuando una muestral muestral fenotipos inusuales de grupos sanguíneos o cuando contienen anticuerpos contra ag eritrocitarios difíciles de identificar. Cuando ambas técnicas no concuerdan, se recurred a la secuenciación.
- Human Erythrocyte Antigen by DNA Analysis: The BioArray HEA BeadChip Kit detects 24 red blood cell polymorphisms associated with 38 antigens and phenotypic variants in a single test. For donor testing, extended antigen typing can help identify samples as rare, weak, or containing altered phenotypes to more deeply characterize a donor registry. Recently and poly-transfused patients can also benefit from extended typing by DNA analysis. The HEA BeadChip is currently available in a 12x8 or 1x96 format for 96 tests. RH Antigen DNA by Analysis: The BioArray RHCE and RHD BeadChips extensively identify more than 35 and 75 RH variants, respectively, across two assays, providing quick and accurate DNA analysis results to aid in the investigation and management of individuals with variations in RH expression. The RH BeadChip kits are available as a 6x8 format for 48 tests. Human Platelet Antigen by DNA Analysis: The BioArray HPA BeadChip detects 22 platelet antigens in a single test. Extended platelet antigen typing information can aid in the diagnosis and management of neonatal alloimmune thrombocytopenia, post-transfusion purpura and platelet refractoriness. The HPA BeadChip is available in a 12x8 or 1x96 format for 96 tests. Human Leukocyte Antigen by DNA Analysis: The BioArray HLA-A and HLA-B BeadChip detects over 60 and 70 leukocyte antigens, respectively, across two assays. HLA Class I typing information can be valuable when used for HLA matching in platelet transfusions. HLA BeadChip kits are available in a 12x8 format for 96 tests.
- Otras técnicas: microarrays y secuenciación de los 10 exones.