Guía para preparación de exposición

3. AGRADECIMIENTOS:
INSTITUTO DEL CÁNCER
(SOLCA) CUENCA
Departamento de Patología
Dr. Jorge Ugalde
Dra. Rocío Murillo
Subdepartamento de Biología
Molecular

4. AGRADECIMIENTOS:
UNIVERSIDAD DE CUENCA
Laboratorio de Biología Molecular
Lcda. Lourdes Viñansaca

5. MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN
MÉTODOS DE
AMPLIFICACIÓN
DE LAS DIANAS
PCR
TÉCNICAS
ISOTÉRMICA
S
MÉTODOS DE
AMPLIFICACIÓN
DE SONDA
AMT
AANBS
ADH
TECNOLOGÍA
INVASORA/ENZI
MA DE ROTURA
GRCL
RCL
MÉTODOS DE
AMPLIFICACIÓN
DE SEÑALES
DNA
RAMIFICA
DO
ENSAYO DE
CAPTURA DE
HÍBRIDOS

6. PCR (POLYMERASE
CHAIN REACTION:
REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA)
Es una tecnología de amplificación que
permite mediante procesos in vitro
mediados por enzimas generar copia
ilimitadas de un segmento determinado
de DNA

7. Técnica de
gran
sensibilidad y
especificidad
Esperanza en
el tratamiento
Era de los
Diagnósticos
Moleculares
Hito en la
Biotecnología

8. OBJETIVOS
GENERALES:
• Conocer el procedimiento a
seguir para efectuar la PCR.
ESPECÍFICOS:
– Identificar la secuencia de
acontecimientos
requeridos
para este fin.
– Integrar la teoría con la
práctica.
– Valorar su utilidad.

9. CONOCIMIENTOS PREVIOS
• DNA
• ¿Qué es?
• Forma
– Configuración Espacial
– Configuración Óptica
• Estructura
– Nucleótidos
• Funciones
–
–
–
–
Replicación
Almacenaje
Expresión
Variación

10. REPLICACIÓN

11. HISTORIA

12. 1953
Años
80’s
• Watson y
Crick
• Kary
Mullis

13. PCR

14. REACTIVOS, MATERIALES, EQUIPOS

15. REACTIVOS
Muestra de DNA
dNTPs:
dATP, dTTP, dGTP, dC
TP
• 20-200μM
• Concentraciones
equimolares de los 4
DNA Polimerasa (Taq)
Catalizadores
• MgCl2
Primers u
Oligonucleótidos
Iniciadores
• 0,5-1μM
por
c/100μL
Buffer o Tapón

16. MATERIALES
Tubos de
Eppendorf
Micropipetas
Puntas con
filtro
Gradillas
Rotuladores

17. EQUIPOS
Vórtex
Centrífuga
Termobloque
Cuantificador de
DNA
Campana
Termociclador
Cubeta de
Electroforesis
Fotodocumentador

18. DESARROLLO

19. ETAPAS
PREPCR
• Recepción de la muestra
• Procesamiento de la muestra
• Purificación de la muestra
• Extracción del DNA
• Cuantificación del DNA
PCR
• Preparación
del coctel
• Ciclos
POSTPCR
•
•
•
•
Tinción de la muestra
Siembra
Corrida electroforética
Revelado

20. PRE-PCR
RECEPCIÓN DE LA
MUESTRA
PROCESAMIENTO DE LA
MUESTRA
Purificación de la
muestra
Extracción del DNA
Cuantificación del
DNA

22. FUENTES DE ADN
Enfermedades Infecciosas
Patologías Oncológicas
Patologías Hereditarias
Características
propias
Muestras de tejido
Biopsias del tumor
L.A. ó vellosidades coriónicas
+ ADN leucocitario de padres
genéticas Células
nucleadas
(sangre
periférica)

23. PCR
PREPARACIÓN DE
CÓCTEL
CICLOS

24. PROTOCOLO TÉRMICO (30-50
CICLOS)
DESNATURALIZACIÓN
ALINEAMIENTO
REACCIÓN DE
EXTENSIÓN

25. CICLO [2n ó (1+e)n]
CALOR
• Desnaturalización
FRÍO
• Acoplamiento
o
Anillamiento
CALOR
• Extensión

28. Amplificación en
Progresión
Geométrica

29. CUIDADOS DE LA PCR
Lugar propio
Instrumental
exclusivo,
estéril
(lavado con H2O destilada)
Reactivos apropiados
• Conservación: -20°C
• > concentración que la requerida para la
reacción.
Uso de guantes por el manipulador

30. POST-PCR
ELECTROFORESIS
• Separación en placa por
tamaño y carga eléctrica.
• REVELADO:
– Radioautografía
• Bromuro de etidio
– Fluorescencia
• Lámpara de luz UV

31. PCR
PCR
Clásica
RT-PCR
ó PCRTI
PCR
Anidada
PCR
Múltiple
qPCR
PCR en
Tiempo
Real
PCR in
situ
Revelado
Óptico por
Fluorescencia
TERF
Guías
Moleculares

32. PCR TRANSCRIPATASA INVERSA
(PCR-TI)
RNA
• TI Termolábil
(VMATI)Thermus
Thermophilus
DNAc
• DNA
Polimerasa
Termoestable
(Taq
Polimerasa)

33. PCR ANIDADA (>sensibilidad y
especificidad)
• 2 pares de cebadores y 2
rondas de PCR.
• DESVENTAJAS:
Contaminación
en
transferencia.
• SUSTIUÍDA:
Hibridación del DNA
con sonda.

34. PCR MÚLTIPLE
• Co-amplificación en
mismo tubo.
• REQUERIMIENTOS:
un
– Cebadores con temperaturas
de amplificación semejantes.
– Ausencia
de
complementariedad entre los
cebadores.
• VENTAJA: Determinación
de múltiples dianas en una
reacción.
• DESVENTAJA:
Baja
sensibilidad.

35. PCR CUANTITATIVA
DETERMINANTES 
Eficiencia de la Amplificación
• Preparación de la muestra
• Procedimientos
de
purificación
del
ácido
nucleico
• Presencia de inhibidores
• Actuación del termociclador
PCR COMPETITIVO (PCRc )
• Co-amplificación
de
secuencias diferentes en el
mismo tubo que compartan los
cebadores.
• COMPETIDORES:
– Tamaño similar
– Composición de bases igual a la
diana
• CÁLCULO:
– Yc=Ic(1+e)n
– Yt=It(1+e)n
– Yc/Yt=Ic/It

36. PCR EN TIEMPO REAL
• Amplificación y detección
de DNA simultánea en el
mismo tubo.
• REQUERIMIENTOS
(REVELADO ÓPTICO
POR
FLUORESCENCIA):
– Termocicladores
de
precisión óptica
– Colorantes
fluorescentes
que se unen al DNA de
doble hebra
– Sondas de hibridación
(especificidad)

37. PCR EN TIEMPO REAL
• REQUERIMIENTOS
[REVELADO
POR
TRANSFERENCIA DE • REQUERIMIENTOS
(REVELADO
POR
RESONANCIA
DE
GUÍAS
FLUORESCENCIA
MOLECULARES)
(TERF)]
– 2 sondas por c/cadena de
DNA: 3’: donador y 5’:
aceptador [proporcional
a la magnitud del
producto (Y)]
– Sondas marcadas con
fluoróforos en forma de
horquilla.

38. PCR EN TIEMPO REAL
• VENTAJAS:
– Reducción del tiempo
para la entrega de
resultados.
– Menor contaminación (se
obvia el procesamiento
Post-PCR)
– Aplicación cuantitativa.

39. VENTAJAS, DESVENTAJAS Y UTILIDAD

40. VENTAJAS DE LA PCR
A partir de una muestra pequeña de
ADN se puede obtener una cantidad
considerable.
El producto se puede utilizar para
clonar, secuenciar y analizar.
Se puede amplificar ADN de
cualquier organismo vivo o muerto.

41. DESVENTAJAS DE LA PCR
Se puede reproducir solamente partes del genoma
en donde se conoce por lo menos una mínima
secuencia de 20 – 40 pb.
Se necesitan “primers” específicos que sean
complementarios al fragmento que se desea
sintetizar.
La polimerización puede tener errores al sintetizar
el ADN
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del
mismo investigador o de cualquier otro.

42. UTILIDAD
INGENIERÍA GENÉTICA
• Clonación
• Tecnologías de DNA recombinate
• Análisis y cuantificación de la expresión genética (RNAm)
DIAGNÓSTICO MOLECULAR:
• Genética
• Inmunología
• Microbiología
• Oncología
TERAPIA GÉNICO-MOLECULAR
• Proyecto Genoma Humano
• Detección de mutaciones
• Dx. Prenatal y preimplantación
MEDICINA LEGAL
ARQUEOLOGÍA

43. UTILIDAD EN INMUNOLOGÍA
Determinación de mutaciones:
• HLA

44. UTILIDAD EN MICROBIOLOGÍA
Diagnóstico etiológico y epidemiológico
(gold estándar)
Genotipificación:
•
•
•
•
Virulencia
Resistencia a fármacos
Mutaciones
Epidemiología:
VIH,
VHB,
VHC,
Citomegalovirus, Virus de Epstein Barr, VPH.

46. BIBLIOGRAFÍA:
•
•
•
•
•
•
Kindt, T.; Goldsby, R.; Osborne, B. Inmunología de Kuby. VI Edición. Editorial Mc GrawHill. México D.F.-México. 2007.
Lodish, H. et all. Biología Celular y Molecular. 5ta. Edición. Editorial Panamericana. Buenos
Aires - Argentina. 2011.
Redondo, O. Conceptos generales de Biología Molecular. Extracción de DNA y Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR). Hospital Universitario de Guadalajara. [Actualizado 25 Abr
2007.
Accesado
20
May
2013]
Disponible
en:
http://www.aebm.org/jornadas/guadalajara/EXTRACCI%D3N%20DE%20DNA%20Y%20PC
R.pdf
Regueiro J., López C., González S., Martínez E. Inmunología. IV Edición Revisada. Ed.
Médica Panamericana. Madrid - España. 2012.
Rojas, W., Anaya J., Aristizábal B., Cano L., Gómez L., Lopera D. Inmunología de Rojas. XV
Edición. Corporación para la
Torres, A.; Baca, B. Reacción en Cadena de la Polimerasa. Centro de Investigaciones
Microbiológicas. Instituto de Ciencias. Universidad de Puebla. . [Accesado 20 May
2013] Disponible en: http://www.elementos.buap.mx/num23/pdf/16.pdf