Apostiladeparasitologiaclnica 121130151032-phpapp01

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  1. 1. Apostila Parasitologia Clínica 2009 1 SUMÁRIO Introdução ................................................................................... 2 Método da gota espessa.............................................................. 3 Exame direto a fresco ................................................................. 4 Técnica de Hoffmann .................................................................. 4 Técnica de Faust ......................................................................... 5 Técnica da hematoxilina férrica .................................................. 6 Técnica de Willis ..........................................................................8 Técnica de Kato ........................................................................... 9 Exame parasitológico de fezes (rotina do LAC-USP) .................. 10 Técnica de Stoll .......................................................................... 12 Técnica de Ritchie ..................................................................... 13 Técnica de Rugai ........................................................................ 14 Técnica de coloração de Kynion ................................................ 15 Técnica do Swab (VASPAR) ........................................................ 19 Bibliografia recomendada para estudo ...................................... 20
  2. 2. Apostila Parasitologia Clínica 2009 2 INTRODUÇÃO A Parasitologia Clínica na prática, consiste no aprendizado de técnicas mais utilizadas no diagnóstico das principais parasitoses intestinais e sanguíneas, preparando o aluno para atuar em saúde pública, educação e pesquisa. Sejam bem vindos ! Professoras: LUCIA MARIA BRAGAZZA e SORAYA EL KHATIB
  3. 3. Apostila Parasitologia Clínica 2009 3 MÉTODO DA GOTA ESPESSA 1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento. 2. Colocar em Lâmina de microscopia três a quatro gotas de sangue fresco, colhidas por punção venosa ou da polpa digital. 3. Com a ponta de outra lâmina e com movimentos circulares, contínuos, reunir as gotas, criando uma área de aproximadamente 2 cm de diâmetro. Continuar com movimentos circulares, do centro para a periferia, durante 30 segundos para evitar a formação de fibrina, a qual poderá obscurecer as preparações coradas. 4. Terminar os movimentos circulares no centro do círculo de sangue; por meio desse procedimento o esfregaço apresenta a borda fina e o centro espesso. 5. Deixar secar à temperatura ambiente e, após, mergulhar a preparação em água corrente ou em solução salina a 0,85%, para que se produza a hemólise. Secar à temperatura ambiente.
  4. 4. Apostila Parasitologia Clínica 2009 4 EXAME DIRETO A FRESCO DE SUSPENSÃO DE FEZES 1. Suspender por meio de um palito, pequena porção de fezes em gota salina previamente colocada sobre uma lâmina. 2. Examinar ao microscópio TÉCNICA DE HOFFMANN 1. Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartável. 2. Acrescentar aproximadamente 20 ml de água morna aos poucos. 3. Homogeneizar as fezes totalmente com o auxílio de um palito. 4. Transferir para um cálice afunilado coando em filtro para fezes. 5. Acrescentar água da torneira até encher o cálice. 6. Deixar em repouso até a sedimentação (2 a 24 horas). 7. Com o auxílio de uma pipeta Pasteur recolher o sedimento, gotejar sobre uma lâmina e adicionar uma gota de lugol, homogeneizar o preparado com uma lamínula e cobrir com a própria lamínula. 8. Examinar ao microscópio.
  5. 5. Apostila Parasitologia Clínica 2009 5 TÉCNICA DE FAUST 1. Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartável. 2. Acrescentar aproximadamente 20 ml de água morna aos poucos. 3. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxílio de uma espátula. 4. Coar a suspensão de fezes em filtro próprio para fezes ou gaze. 5. Recolher o filtrado em tubo de centrífuga e centrifugar a 2500 rpm durante 01 minuto. 6. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em água 7. Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto e desprezar o sobrenadante, 8. Se necessário repetir a lavagem até que o sobrenadante fique claro. 9. Ressuspender o sedimento com sol. de sulfato de zinco (d= 1.180) completando o volume do tubo até 1 cm da boca do mesmo. 10.Centrifugar a 2500 rpm por 01 minuto. 11.Retirar a película da superfície delicadamente com o auxílio de uma alça dobrada em anel. 12.Colocar as gotas obtidas com a alça de anel para uma lâmina com lugol 13.Cobrir com uma lamínula 14.Examinar ao microscópio
  6. 6. Apostila Parasitologia Clínica 2009 6 TÉCNICA DE HEMATOXILINA FÉRRICA ( segundo Cláudio Santos Ferreira) 1. Fazer o esfregaço bem fino em lâmina misturando fezes com uma pequena gota de soro (usar de preferência muco e fezes líquidas para a pesquisa de trofozoítos). 2. Fixador de Bouin - 1 a 2 minutos. 3. Lavar em álcool. 4. Lavar em água corrente - 2 minutos. 5. Mordente (alúmen férrico a 2%) - 5 minutos. 6. Hematoxilina - ± 5 minutos. Controlar a coloração, observando o esfregaço até atingir a cor azul cinzenta. 7. Água corrente - 1 minuto. 8. Diferenciador (alúmen férrico a 2%) se necessário. 9. Água corrente. 10. Montar em Bálsamo do Canadá.
  7. 7. Apostila Parasitologia Clínica 2009 7 Sol. de Alúmen Férrico. Mordente Alúmen de ferro puro.....................................................2.0 g. (Sulfato de amônio e ferro III) Água destilada..............................................................100 ml. Diferenciador Alúmen de ferro puro.....................................................0.5 g. Água destilada...............................................................100 ml. Triturar em almofariz e dissolver a frio. A sol. se conserva por períodos curtos, por isso deve-se preparar pequenas quantidades de cada vez. Guardar em frasco âmbar. Solução de Hematoxilina Cristais puros de hematoxilina...............................................0.5 g. Álcool a 95%...........................................................................10 ml. Água destilada q.s.p. .............................................................100ml. Deixar em recipiente de boca larga, tampado com gaze durante alguns dias ( no mínimo 2 dias). Completar até o volume original. Acrescentar 0.02 g. de ác. cítrico puro. TÉCNICA DE WILLIS
  8. 8. Apostila Parasitologia Clínica 2009 8 • Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartável. • Acrescentar aproximadamente 20 ml de água morna aos poucos. • Homogeneizar totalmente as fezes com o auxílio de um palito. • Transferir para um cálice afunilado coando em filtro próprio para fezes. • Transferir para um tubo de centrífuga e centrifugar a 2500 rpm por 02 minutos. • Desprezar o sobrenadante • Ressuspender o sedimento em sol. saturada de NaCl, completando o volume do tubo com esta solução até formar um menisco. • Colocar uma lâmina sobre a boca do tubo. • Deixar em repouso durante 15 a 45 minutos (não ultrapassar os 45 minutos, pois os ovos começam a descer). • Retirar a lâmina virando bruscamente. • Examinar ao microscópio.
  9. 9. Apostila Parasitologia Clínica 2009 9 TÉCNICA DE KATO (modificado por KATZ e cols.) • Preparar uma sol. de verde de malaquita (esse produto tem a finalidade de conservar e clarificar as fezes a serem examinadas ) usando as seguinte fórmula: glicerina............................................100 ml água dest. ........................................100 ml verde de malaquita a 3%..................1 ml • Cortar papel celofane semi-permeável (molhável) em pedaços de 24 mm por 30 mm e deixá-los mergulhados na sol. de verde de malaquita por 24 horas. • Colocar sobre um pedaço de papel higiênico uma porção de fezes a ser examinada. • Comprimir a parte superior com um pedaço de tela metálica. Nessa malha só passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles. • Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferí- las com o auxílio de uma espátula, para um cartão retangular, contendo no seu centro um orifício de 6 mm de diâmetro ( as fezes são colocadas nesse orifício). • Após encher completamente o orifício, retirar o cartão cuidadosamente deixando as fezes sobre a lâmina de vidro. • Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane, comprimindo-a após tê-la invertido contra uma folha de papel absorvente. • Aguardar 1 a 2 horas e examinar ao microscópio (todos os campos) • O número de ovos encontrados no esfregaço fecal, multiplicado por 23 corresponderá ao número de ovos por grama de fezes.
  10. 10. Apostila Parasitologia Clínica 2009 10 EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES (ROTINA do LAC -USP) Técnicas de Hoffmann, Ritchie, Faust 1. Enumerar o material 2. Colocar aproximadamente 5 g de fezes no copo descartável 3. Acrescentar aproximadamente 50 ml de água morna aos poucos 4. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxílio de uma espátula 5. Transferir para um cálice afunilado coando em filtro próprio para fezes 6. Acrescentar água de torneira até 2/3 do cálice 7. Transferir para 2 tubos de centrífuga quantidade suficiente do filtrado para atingir aproximadamente 1 cm abaixo da borda do tubo. Um dos tubos será utilizado para execução da técnica de Faust (1) e o outro tubo será utilizado para a execução da técnica de Ritchie (2) 8. Acrescentar água de torneira no cálice até atingir o volume inicial ( 2/3 do cálice), a fim de executar a técnica de Hoffmann 9. Deixar em repouso até a sedimentação - de 2 a 24 horas 10.Com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur, recolher o sedimento e gotejar sobre uma lâmina e adicionar uma gota de lugol, homogeneizar o preparado com uma lamínula e cobrir com a mesma 11.Examinar ao microscópio ( 1 ) 1. Tarar o tubo e centrifugar a 2500 rpm durante 1 minuto 2. Decantar o sobrenadante e agitar até que o sedimento se desprenda do fundo do tubo. 3. Lavar o sedimento com água até que o sobrenadante fique claro. 4. Ressuspender o sedimento com sol. de sulfato de zinco (d= 1.180) completando o volume até 1 cm da boca do tubo e centrifugar a 2500 rpm por 01 minuto. 5. Retirar a película da superfície delicadamente com o auxílio de uma alça dobrada em anel. 6. Passar a gota do anel para uma lâmina com lugol
  11. 11. Apostila Parasitologia Clínica 2009 11 7. Cobrir com uma lamínula 8. Examinar ao microscópio ( 2) 1. Tarar o tubo e centrifugar a 2500 rpm durante 2 minutos 2. Decantar e agitar até que o sedimento se desprenda do fundo 3. Adicionar ao sedimento 5 ml de formol a 10% 4. Deixar em repouso por no mínimo 5 minutos 5. Adicionar 2 ml de éter 6. Tapar o tubo e agitar vigorosamente 7. Tarar os tubos e centrifugar a 2500 rpm durante 2 minutos 8. Decantar e agitar para desprender o sedimento do fundo do tubo 9. Adicionar 2 gotas de lugol e agitar novamente Preparar uma lâmina do sedimento e examinar
  12. 12. Apostila Parasitologia Clínica 2009 12 TÉCNICA DE STOLL É uma técnica quantitativa , na qual as fezes são ressuspensas em NaOH 0,1N que tem a finalidade de desagregar e clarificar o material. A suspensão é feita em um frasco tipo Erlenmeyer , cujo gargalo traz duas marcas, uma indicando 56 cm e a outra 60 cm . TÉCNICA: 1. Encher o frasco até a marca 56 com NaOH 0,1N. 2. Colocar fezes até o nível atingir a marca 60. 3. Introduzir no frasco cerca de 10 pérolas de vidro, tampar com rolha de borracha e em seguida agitar vigorosamente, para se obter uma suspensão homogênea. 4. Retirar 0,15 ml da suspensão e colocar em uma lâmina. Cobrir com uma lamínula e examinar ao microscópio , sob o aumento de 100 vezes. 5. Contar o número de ovos em toda a preparacão. 6. O número de ovos contados multiplicado por 100, dá o número de ovos por grama de fezes.
  13. 13. Apostila Parasitologia Clínica 2009 13 TÉCNICA DE RITCHIE 7. Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartável. 8. Acrescentar aproximadamente 20 ml de água morna aos poucos. 9. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxílio de um palito. 10.Transferir para um cálice afunilado coando em filtro para fezes. 11.Transferir para um tubo de centrífuga e centrifugar a 2.500 rpm durante 2 min. 12.Decantar e agitar até que o sedimento se desprenda do fundo do tubo. 13. Acrescentar 5 ml de formol a 10%. 14. Acrescentar 2 ml de éter. 15.Tapar o tubo e agitar vigorosamente. 16.Centrifugar novamente a 2.500 rpm durante 2 min. 17.Decantar e agitar até que o sedimento se desprenda do fundo do tubo. 18. Adicionar 2 gotas de lugol e agitar novamente. 19. Preparar uma lâmina do sedimento e examinar ao microscópio.
  14. 14. Apostila Parasitologia Clínica 2009 14 TÉCNICA DE RUGAI 1. Remover a tampa do recipiente contendo as fezes e envolver em pedaço de gaze dupla (dobrada em duas partes) repuxando as bordas para trás. 2. Embocar os recipientes no interior de um cálice cônico, fixando-o por pressão contra as paredes, em posição levemente inclinada. 3. Colocar água morna pelas paredes do cálice aproveitando a abertura restante da posição inclinada do recipiente metálico. O líquido deve alcançar toda a extensão da abertura do recipiente. Evitar a formação de bolhas de ar. 4. Deixar em repouso por 90 min. 5. Sem retirar o recipiente, introduzir uma pipeta até o fundo do cálice. Retirar o sedimento e colocar em uma lâmina ou vidro relógio. 6. Examinar ao microscópio.
  15. 15. Apostila Parasitologia Clínica 2009 15 TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE KYNION PARA PESQUISA DE CRYPTOSPORIDIUM PARVUM E ISOSPORA BELLI 1a fase Material utilizado -Solução de formalina tamponada a 10%, pH 7.2 em PBS -Gaze ou coador de nylon -Copo descartável e cálice Descrição - Homogeneizar ± 1 g. de fezes em 4 ml. de solução de formalina tamponada -Filtrar em gaze ou coador de nylon -Transferir o material filtrado para os cálices e manter em geladeira por 24 horas, no mínimo
  16. 16. Apostila Parasitologia Clínica 2009 16 2a fase Material utilizado -Centrífuga -Tubos de centrífuga -Tampas de borracha -Éter sulfúrico Descrição - Colocar no tubo de centrífuga 4 ml do material contido nos cálices e adicionar 2 ml de éter sulfúrico -Agitar o tubo ( tampado) vagarosamente -Centrifugar por 8 minutos a 1500 rpm -Desprezar o sobrenadante e limpar os detritos superficiais com um bastonete -Fazer o esfregaço com o sedimento Coloração -Deixar secar o esfregaço -Fixar com metanol por 5 minutos -Cobrir o esfregaço com sol. de fucsina carbólica de Kynioun por 30 minutos à temperatura ambiente
  17. 17. Apostila Parasitologia Clínica 2009 17 -Lavar com água -Lavar com álcool ácido por 2 minutos. Caso o esfregaço tenha ficado muito espesso e a coloração vermelha não tenha sido removida, repetir o procedimento -Lavar com água -Cobrir toda a lâmina com azul de metileno ou verde de malaquita por 1 a 2 minutos, lavar com água e deixar secar Reagentes Formalina Formol....................................................................................10 ml PBS pH 7.2 q.s.p. ..................................................................100ml Fucsina carbólica de Kynioun Fucsina básica.....................................................................4 g. Cristais de fenol ou ác. fênico.............................................8 g. Álcool 95%...........................................................................20 ml Água dest. q.s.p. .................................................................100 ml Álcool- Ácido Ácido sulfúrico conc............................................................5 ml Álcool 70% q.s.p. ...............................................................100 ml
  18. 18. Apostila Parasitologia Clínica 2009 18 Verde de malaquita Verde de malaquita ............................................................3 g. Água dest. ..........................................................................100 ml Azul de metileno Azul de metileno..................................................................1 g. Água dest. ..........................................................................100 ml
  19. 19. Apostila Parasitologia Clínica 2009 19 MÉTODO DO SWAB DE VASELINA E PARAFINA (VASPAR) 1. Mergulhar o swab de algodão em mistura de quatro partes de vaselina e uma parte de parafina (4:1). 2. Colocar o swab de algodão revestido com uma camada de vaselina- parafina em tubo de ensaio fechado com uma bucha de algodão. Armazenar no refrigerador . 3. Esfregar sutilmente o swab na superfície perianal e introduzir pequena porção no orifício anal. 4. Repor o swab no tubo. 5. Encher 1/3 do tubo com xilol ou com quantidade suficiente para cobrir o swab. Deixar em repouso por 5 minutos. 6. Remover o swab e centrifugar (500 x g/1min) 7. Com a pipeta capilar, colher o sobrenadante. Transferir várias gotas para uma lâmina de microscopia. Não é necessário cobrir a preparação com lamínula. Para evitar a expansão do material em uma grande área, colocar as gotas no centro de um anel desenhado com lápis de cera e examinar imediatamente. O anel pode ser dissolvido com xilol. Observação: Este exame deve ser realizado pela manhã, antes do paciente defecar ou banhar-se.
  20. 20. Apostila Parasitologia Clínica 2009 20 BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA PARA ESTUDO DE CARLI, G. A. Parasitologia Clínica. Seleção de métodos e técnicas de laboratório para o diagnóstico das parasitoses humanas. Ed. Atheneu, 2001. HENRY, J.B. Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais. São Paulo: Manole, 2007. MELO, A. L., LINARDI, P.M., VITOR, R.W.A. Parasitologia Humana. 11ª Edição. Ed. Atheneu, 2005. Pranchas para o Diagnóstico de Parasitas Intestinais. Organização Mundial de Saúde. Ed. Livraria Santos, 2005.

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