1. MANIPULAÇÃO DO DNA
Biotecnologia

2. • Atualmente, uma série de novas técnicas
permite ao pesquisador a análise detalhada da
estrutura molecular do DNA e, por
conseqüência, do material genético de um ser
vivo.
• Esta análise permite, por sua vez, o isolamento
e a amplificação de um segmento de DNA, o seu
seqüenciamento, identificação e manipulação.
• O Projeto Genoma, por exemplo, pretende,
através destas técnicas, identificar toda a
seqüência de cerca de 3 bilhões de pares de
bases do genoma humano - 50.000 a 100.000
genes!!

3. • Esta abordagem permitirá a identificação
de genes relacionados a doenças
genéticas específicas, a abre a
possibilidade de diagnóstico e até
tratamento estas doenças a nível
molecular.

4. Sequenciamento do DNA: Duas técnicas, surgidas no final dos
anos 70, são empregadas para o seqüenciamento de
fragmentos de nucleotídeos:
• Método Químico ou de Maxam-Gilbert Método
Enzimático ou de Singer Em ambos os casos, é
possível se definir com precisão a seqüência exata de
nucleotídeos de um segmento de DNA.
• Amplificação de um Segmento de DNA: O enorme
tamanho e a imensa variabilidade da molécula do
DNA são os principais obstáculos ao isolamento e
sequenciamento de genes.

5. • Assim, técnicas especiais são necessárias
para a seleção e amplificação de partes da
molécula do DNA, gerando fragmentos
menores e mais facilmente analisáveis.
• São duas as metodologias empregadas
atualmente:

6. A Reação em Cadeia da Polimerase - "Polimerase Chain Reaction",
ou PCR.
A Clonagem de Genes
• Este método - mais recente - de isolamento e
amplificação de um segmento de DNA -
envolve a produção "in vitro" de milhões de
cópias do segmento em estudo.
• O processo exige a utilização de "primers" que
isolam o segmento a ser amplificado, da
enzima DNA Polimerase, e ocorre em 3 etapas:

7. • A desnaturação da dupla fita do DNA, em alta
temperatura - 90oC O pareamento dos "primers", a
baixa temperatura - 37o C A duplicação do segmento
isolado através da reação da DNA polimerase.
• O processo é cíclico e pode ser repetido "n" vezes,
dependendo do grau de amplificação que se deseja.
• O "primer" pode ser sintetizado quimicamente, desde
que se conheça a seqüência a ser amplificada e a partir
desta, e é sempre adicionado em excesso ao meio de
reação.

8. • Se o segmento de DNA a ser amplificado não é
conhecido, ele pode ser clonado a um vetor cuja
seqüência de DNA adjacente ao recombinante seja
conhecida.
• A DNA Polimerase utilizada é termoestável, e isolada
do microorganismo Termus aquaticus (Taq
Polimerase).
• A tecnologia da PCR pode ser empregada nas
análises clínicas como um poderoso instrumento de
diagnóstico de viroses e infecções bacterianas, como
a AIDS e a tuberculose, por exemplo, com enorme
ganho em sensibilidade.

9. • Clonagem de Genes É um método mais complexo de
isolamento e amplificação de DNA que a PCR, mas
muito útil em certas situações.
• Envolve a utilização de endonucleases de restrição, a
criação de mapas de restrição e a utilização de vetores
para a recombinação e clonagem do gene em estudo.
Em etapas:
• As Endonucleases de Restrição fazem a clivagem da
molécula do DNA em seqüências específicas da
molécula, geralmente palindrômicas.

10. Exemplo
•G A A T T C
•C T T A A G

11. • A Criação do DNA Recombinante envolve a união de um
fragmento de DNA a uma molécula maior, utilizando-se
uma endonuclease de restrição e a DNA ligase.
• A clivagem do DNA com a mesma enzima de restrição cria
extremidades complementares adesivas que são unidas
pela ação da DNA ligase.
• Desta forma, um fragmento de DNA pode ser inserido em
uma molécula maior, que passa a ser recombinante.
• Assim, um determinado gene do genoma humano
pode ser inserido no genoma de uma bactéria, por
exemplo, e lá ser amplificado ou mesmo transcrito
várias vezes.

12. • Os Vetores: Um vetor é uma molécula de DNA
à qual o fragmento de DNA a ser clonado está
ligado.
• Os principais vetores utilizados são
plasmídeos, e vírus de animais.
• Os plasmídeos são os mais utilizados para a
clonagem de pequenos fragmentos de DNA;
são geralmente obtidos a partir de células
bacterianas, facilmente reintroduzidos nestas
células e possuem capacidade autônoma de
replicação.

13. • Um exemplo amplamente utilizado de
plasmídeo é o pBR322, que possui os genes de
resistência à tetraciclina e à ampicilina.
• Alguns tipos de vírus, como o bacteriófago l ,
são utilizados na clonagem de fragmentos
maiores de DNA.
• Os Cosmídeos são estruturas híbridas que
possuem características do bacteriófago
associadas à do plasmídeo pBR322, e são
utilizadas para a clonagem dos maiores
segmentos de DNA.

14. Bibliotecas de DNA:
Bibliotecas de DNA: Uma biblioteca de
DNA é uma coleção de fragmentos de
DNA obtidos a partir da ação das
endonucleases de restrição, ligados aos
vetores apropriados e clonados.
Quando a biblioteca inclui a totalidade do
genoma de uma célula ou organismo, ela é
dita "Biblioteca Genômica".

15. • Quando a biblioteca inclui apenas moldes
de cDNA, obtidos por ação de uma
transcriptase reversa, esta biblioteca é
dita "Biblioteca de DNA Complementar".
• A detecção de um determinado
segmento de DNA em uma biblioteca
genômica é feita com a utilização de
sondas de DNA.

16. SONDAS
Sondas: As sondas de DNA são seqüências de fita única de
DNA que hibridizam - pareiam - com a seqüência de interesse,
destacando-as do restante da biblioteca.
Estas sondas podem ser marcadas com um isótopo radioativo,
um anticorpo, uma substância fluorescente ou outro método
de detecção.
A utilização em conjunto das sondas e de enzimas de restrição
permitiram o desenvolvimento de técnicas de detecção de
DNA muito precisas, como o "Southern Blot".

17. • No "Southern Blot", um determinado gene
pode ser identificado entre milhões de
fragmentos por separação eletroforética em
gel com posterior identificação dos
fragmentos através de sondas específicas.
• Variações deste método permitem hoje a
identificação de fragmentos de RNA -
Northern Blot - e de proteínas - Western Blot,
este último utilizando um anticorpo no lugar
da sonda.

18. São enormes e promissoras as aplicações
desta tecnologia:
• 1 - Na identificação e tratamento de doenças condicionadas
geneticamente;
• 2 - No diagnóstico muito sensível de doenças infecciosas;
• 3 - No diagnóstico pré-natal;
• 4 - Na manipulação terapêutica de genes;
• 5 - Na criação de organismos híbridos e transgênicos na medicina,
agricultura e pecuária;
• 6 - Na indústria farmacêutica;
• 7 - Em estudos evolutivos e de descendência;
• 8 - Na medicina legal, etc.

19. CLONAGEM

20. Clonagem
• A clonagem (do grego Klon = broto vegetal) é
processo natural ou artificial onde são
produzidos organismos geneticamente
idênticos.
• Trata-se de um tipo de reprodução
assexuada pois não envolve troca de gametas
entre indivíduos.

21. HISTÓRICO
• Em 1903 o botânico Herbert J. Webber criou o termo
clonagem.
• Mas ela ficou mundialmente conhecida com a clonagem
da ovelha Dolly, que nasceu dia 5 de julho de 1996, feita
pelo cientista escocês Ian Wilmut.
• Em 2001 um médico italiano, chamado Severino Antinori
teve a intenção de clonar num ser humano, o que
causou grande agito na sociedade cientifica.
• Outros cientistas até anunciaram que havia clonado um
ser humano, porem esses fatos nunca foram provados.

22. Clonagem reprodutiva
• A clonagem reprodutiva se refere à produção se seres vivos
geneticamente idênticos, ou seja, produção cópias idênticas de
seres vivos, sejam eles animais, vegetais ou humanos.
• Neste processo, normalmente o núcleo de uma célula
reprodutiva é retirado e esta recebe uma célula somática, que irá
se fundir e se dividir, comportando-se como um embrião normal.
• Este embrião é implantado em uma mãe de aluguel.
• O organismo formado é geneticamente idêntico ao organismo
doador da célula somática.
• Assim que a ovelha Dolly foi clonada.
• A célula somática utilizada é de uma glândula mamária.

23. Clonagem terapêutica
• O objetivo desta técnica é produzir células-tronco para o tratamento de
doenças e produção de órgãos para transplante.
• Esta técnica é a esperança de muitas pessoas portadoras de doenças como
diabetes, Parkinson e Alzheimer.
• Esta técnica esbarra em muitos preconceitos e parâmetros éticos.
• O processo de produção de uma célula é muito parecido com a clonagem
reprodutiva, porem a célula não é implantada no útero.
• As células-tronco embrionárias podem se diferenciar em todos os tipos de
tecidos e são chamadas de multifuncionais, já as adultas não possuem esta
capacidade, cada uma dá origem ao mesmo órgão.

24. Benefícios da clonagem
• Os cientistas têm muitas esperanças com relação à clonagem na cura de
doenças, porem esbarram em parâmetros éticos.
• Mas acreditam que no futuro a clonagem possa produzir células de
órgãos ou até órgãos inteiros, salvando a vida de muitas pessoas e
diminuindo a fila dos transplantes.
• Que também possa utilizar células do próprio organismo no lugar de
implantes mamários, clonando as células de gordura, por exemplo.
• A clonagem de seres humanos poderá solucionar os casos de infertilidade
e até evitar que crianças nasçam com defeitos genéticos.
• Espécies de animais com risco de extinção podem ser clonados.

25. Riscos da clonagem humana
• Muitos médicos “espertinhos” podem querer lucrar
muito com esta técnica, clonando seres humanos,
cobrando muito dinheiro por isso.
• Como ocorreu na ovelha Dolly, os clones podem ter
envelhecimento precoce, uma vez que são originados
de uma célula adulta.
• A individualidade do organismo passa a ser invadida,
pois ele será ou terá uma cópia andando por aí.
• Muitas pessoas clonadas podem ser alvos de
preconceito.

26. Aspectos éticos
• Todos nos sabemos que a clonagem pode acabar se
tornando um grande comércio no futuro e acabar
fugindo do controle.
• O custo desta técnica é e será cada vez mais caro e
poucas pessoas terão acesso a ela.
• “A ciência precisa seguir em frente no seu objetivo de
antecipar-se ao futuro, com prudência e controle
democrático sobre suas aplicações práticas”. (Revista
Scientifc American, Ano 2, nº 14).

27. Revista Scientifc American
• Segundo a reportagem “Prós e contras da clonagem
humana”, ela pode sim ser realizada, porem necessita
de limites e um equilíbrio, respeitando os valores morais
e éticos.
• Uma legislação deve ser construída democraticamente
com a participação de todos garantindo uma tecnologia
segura a serviço da humanidade, que respeite os valores
humanos e ao mesmo tempo possa desenvolver novas
tecnologias.

29. SERIA BRINCAR DE SER DEUS?

30. PHOENIXSPORTFITNESS.BLOGSPOT.COM.BR