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  1. 1. REPLICAÇÃO DO DNA EMPROCARIOTOS E EUCARIOTOS 1
  2. 2. O CICLO CELULAR E AREPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS Como acontece em procariotos? CARACTERÍSTICAS UNIVERSAIS DO MECANISMO DE REPLICAÇÃO DE DNA: SEMI-CONSERVATIVO BIDIRECIONAL SEMI-DESCONTÍNUO 2
  3. 3. MESELSON-STAHL (1958) Modelo de replicação semi-conservativo DEMONSTRAÇÃO DA BIDIRECIONALIDADE DOPROCESSO DE REPLICAÇÃO DO DNA A PARTIR DA ORIGEM DO SV40 3
  4. 4. A BOLHA E AS FORQUILHAS DE REPLICAÇÃO DO DNA PROCARIOTOS EUCARIOTOSGenoma pequeno e circular Genoma grande e linearÚnica origem de replicação Múltiplas origem de replicação biderecional biderecional Como são classificadas as enzimas envolvidas na síntese de DNA, chamadas “DNA-polimerases”? 4
  5. 5. TIPOS DE DNA POLIMERASES E SUAS RESPECTIVAS FUNÇÕESDNA POLIMERASE DNA-DEPENDENTEEnvolvida em replicação, reparo e recombinação do DNA. Catalisa a adição de um desoxi-ribonucleotídeo ao terminal 3´ de uma cadeia preexistente, utilizando uma cadeia de DNAcomplementar como molde . Portanto, depende de uma fita molde e de um primer.DNA POLIMERASE RNA-DEPENDENTETranscriptase reversaEnvolvida na replicação de retrovírus. Descoberta por Temein e Baltimore, em 1970. Não apresentaatividade exonuclease 3´-5´. Além da atividade DNA polimerase RNA dependente, apresenta tambémas atividades RNAse H e DNA polimerase DNA-dependente. Catalisa a adição de desoxi-ribonucleotídeos ao terminal 3´ de uma cadeia de DNA preexistente, utilizando uma cadeia de RNAcomplementar como molde e um primer exógeno específico. Num estágio seguinte, a fita híbrida DNA- DNARNA é convertida em DNA-DNA, por ação das atividades RNAse H e DNA polimerase DNA-dependente. Portanto, depende de uma fita molde e de um primer.TelomeraseEnvolvida na manutenção do tamanho dos telômeros. Catalisa a adição de um desoxi-ribonucleotídeoao terminal 3´ de uma cadeia pré existente, utilizando uma seqüência de RNA complementar interna(grupo prostético) como molde. Portanto, depende apenas de uma fita molde de DNA. Enzimaencontrada em células germinativas de eucariotos. PIADA DE BIOLOGISTA MOLECULAR 5
  6. 6. CARACTERÍSTICAS DAS DNA POLIMERASES (parte 1)1. Não são capazes de iniciar síntese de novo. Precisam de 3’ OH livre fornecido pelo iniciador (primer)2. Necessidades de íons de Mg2+3. Acrescentam nucleotídeos à fita recém sintetizada obedece do pareamento obedecendo o pa ea e to de bases com a fita molde. CARACTERÍSTICAS DAS DNA-POLIMERASES (parte 2) 4. Remoção de nucleotídeos: atividade exonuclease (5’→ 3’) replicação, reparo de mutações atividade exonuclease (3’→ 5’) revisão ( ) Enzima fi l com E i fiel frequência de erro de ~ 10-5 a 10-6 5’ 3’ 6
  7. 7. ATIVIDADES DA DNA POLIMERASE POLIMERASE 5’ – 3’ EXONUCLEASE 3’ – 5’Figure 5-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) REAÇÃO CATALISADA PELA DNA POLIMERASE PIROPHOSPHATASEFigure 5-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 7
  8. 8. A REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS 8
  9. 9. ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: INÍCIO ALONGAMENTO TÉRMINOO SITIO DE INICIO DE REPLICAÇÃO DO DNA, DENOMINADO “ORIGEM DE REPLICAÇÃO” (ori-C). (APRESENTA SEQUENCIAS CONSENSO ESPECÍFICAS) 9
  10. 10. FORMAÇÃO DO COMPLEXO DE INICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO 10
  11. 11. DESNATURAÇÃO DO DNA E SÍNTESE DE UMA SEQUÊNCIA INICIADORA DE RNAETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: PROCARIOTOS INÍCIO ALONGAMENTO TÉRMINO 11
  12. 12. FORQUILHAS DE REPLICAÇÃO: 3` 5` 3` 3` FITA CONTÍNUA 5` 3` FITA DESCONTÍNUA 5` 5` 5’ 3’ 3` 3` 3` 3` ASSOCIAÇÃO DO DNA COM A DNA POLIMERASE III (gama-loader) (Beta-clamp) 12
  13. 13. O DÍMERO DE DNA POLIMERASE III NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO A REPLICAÇÃO SIMULTÂNEA DAS DUAS FITAS DE DNA PELO DÍMERO DE DNA POLIMERASE III 13
  14. 14. PAPEL DAS “SSDNA-BINDING-PROTEINS”Figure 5-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) SÍNTESE DESCONTÍNUA DA Í Í FITA ATRASADA DE DNA: papel da DNA-POL I papel da DNA LIGASEFigure 5-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 14
  15. 15. FORMAÇÃO DO “SUPERCOILING” POSITIVO NA FORQUILHA DE Ç REPLICAÇÃOFigure 5-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Super-helicoidização Super-helicoidização induzida por abertura 15
  16. 16. Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: PROCARIOTOS INÍCIO ALONGAMENTO TÉRMINO 16
  17. 17. SEQUÊNCIAS TERMINADORAS DA REPLICAÇÃO DO DNA RESOLUÇÃO DOSCONCATÂMEROS DE DNA 17
  18. 18. A REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOSEUKARYOTIC DNA POLYMERASES: PROPOSAL FOR A REVISED NOMENCLATURE. Peter M.J. Burgers et.al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, No. 47, Issue of November 23, pp. 43487–43490, 2001. PROPOSED GREEK HUGO OTHER CLASS MAIN NAME NAME NAMES FUNCTION DNA α (alpha) POLA B POL1 replication Base β (beta) POLB X excision repair Mitochondri γ (g (gamma) ) POLG A MIP1 al replication DNA δ (delta) POLD1 B POL3 replication DNA ε (epsilon) POLE B POL2 replication Bypass ζ (zeta) POLZ B REV3 synthesis Bypass η (eta) POLH Y RAD30, XPV synthesis θ (theta) POLQ A mus308, eta DNA repair Bypass ι (iota) POLI Y RAD30B synthesis Bypass κ (kappa) POLK Y DinB1, theta synthesis Base λ (lambda) POLL X POL4, beta2 excision repair Non- μ (mu) POLM X homologous end joining Sister ς (sigma) POLS X TRF4, kappa chromatid cohesion Bypass REV1L Y REV1 synthesis Antigen TDT X receptor diversity 18
  19. 19. ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS: INÍCIO ALONGAMENTO TÉRMINO ORIGENS (19) DE REPLICAÇÃO NO CROMOSSOMO III DE LEVEDURA UMA ORIGEM DE REPLICAÇÃO DE LEVEDURA ORC – origin recognition complex Abf1 – proteina que facilita a ligação de ORC 19
  20. 20. MECANISMO DE INÍCIO DA REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS: Única utilização de uma origem de replicação por ciclo celular Cdc6 e Cdt1 - Helicase loading proteinsFigure 5-36 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS: EUCARIOTOS INÍCIO ALONGAMENTO TÉRMINO 20
  21. 21. REPLICAÇÃO DO DNA DE SV40: papel de FEN 1 REPLICAÇÃO DO DNA DE SV40 21
  22. 22. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 "for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase" y Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak REPLICAÇÃO DO TELÔMERO PELA TELOMERASEFigure 5-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 22

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