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PCR
Reação em Cadeia de Polimerase
IV CURSO DE VERÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENÔMICA
MsC. Ingrid Thaís Beltrame Botelho – doutoranda
ingridthaisbb@hotmail.com
PCR

O que é PCR?
•  Amplificação de um segmento específico de
DNA dentro de um genoma (gene ou parte
dele, regiões supervariáveis, Junk DNA, etc.)

•  “Fotocopiadora” molecular

Fonte: www.genomics.agilent.com 
Cópias “in vitro” usando elementos básicos
do processo de replicação natural do DNA.
nucleotídeos
PCR

•  Inventada* por Kary
Mullis em 1983.

•  Primeira publicação em
1985 (Methods in Enzymology)

• Recebeu o Prêmio Nobel de
Química em 1993.
Em 2004...

Atualmente...

14983

2013: 3667

PCR
Ambiente adequado
PCR

Reagentes Necessários para a Reação
•  Água
•  Tampão
•  DNA molde
•  Iniciadores*
•  Nucleotídeos
•  Mg++
•  DNA Polimerase (Taq)*
PCR

1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador
automático
Ciclos de Temperatura
1. Temperatura de desnaturação do DNA

2. Temperatura de ligação dos iniciadores

3. Temperatura de extensão da fita de DNA

http://passel.unl.edu/pages/animation.php?a=PCR.swf

PCR
Desnaturação inicial: 4 minutos a 94ºC é suficiente para a
grande maioria dos casos.
Desnaturação: 1 minuto a 94ºC
Ligação: 1 minuto operando na temperatura de ligação
específica do primer, podendo ser aumentada até 90
segundos.

Extensão: Temperatura ótima da enzima. Para a Taq, utiliza-se 1
minuto a 72ºC, podendo ser aumentada até 2 minutos de acordo
com a quantidade utilizada, o número de ciclos e o tamanho do
produto desejado
Extensão Final: Após o término dos ciclos, costuma-se
acrescentar um passo de 4 minutos a 72ºC, como
oportunidade adicional para a polimerase agir
Final: Programa-se o termociclador para um hold, de 0 a 4ºC, para manter
as amostras conservadas até o momento de estocagem
PCR
Reagentes Necessários para a Reação
•  Água
•  DNA molde
•  Nucleotídeos
•  Iniciadores*
•  DNA Polimerase (Taq)*
•  Tampão
•  Mg++
Reagentes Necessários para a Reação
•  DNA molde

•  Quantidade mínima de DNA
•  Complexidade do DNA
–  De plasmídeos a genomas completos

•  Pureza
–  Proteínas, lipídeos, outro DNA, reagentes extração

•  Degradação
•  Inibidores
- EDTA, heparina
•  Contaminação
–  Produtos amplificados
PCR

Dissolvido em água (deionizada estéril)
tampão (TE = Tris-EDTA; HEPES;
NaOH 0,8M em água, etc.)
estocá-lo por longos períodos de tempo

–20ºC - por até 2 anos em tampão apropriado.
Desoxinucleotídeos – dNTP´s

PCR

(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
PSolução estoque de 10mM em
água e pH 8,1* sem pirofosfato
P Em

concentrações iguais*

P Concentração

final entre 20 e
200µM, dependendo do
tamanho do segmento e
duração da reação
P Altas

concentrações afetam
especificidade dos iniciadores
Inciadores / oligonucleotídeos/
primers
Reagentes Necessários para a Reação
Complementar a seqüência
do DNA molde
15 a 30 pares de base*
Conteúdo de C/G – 45 a 55%*
Normalmente sense e antisense/
Foward e reverse
Concentração ótima 0,1 a 0,5µM
Considerar:
•  Validade
•  Número de congelamentos e
descongelamentos
•  Contaminação
•  Quantidade
–  Pouco: pouca amplificação
–  Muito: pouca amplificação

PCR
Pcr
(c) Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’

“Desenhando” Iniciadores

3´ repetido
5´

5’-NNNNNNNNTATA-3’
3’-ATATNNNNNNNN-5’

3´

PCR

Primer-Dimers (anelamentos Sense/Antisense),
3´

5´

Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA

5´
3´
(c) Evitar las secuencias repetidas
3´

5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´

5´

5´-TATANNNNNNNN-3´
3´-NNNNNNNNATAT-5´

Dímero de primer

5´ repetido

Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA

5´
Self-Dimers (anelamentos3´Sense/Sense ou Antisense/Antisense)
PCR
3´

5´

(c) Evitar las secuencias repetidas
5´

5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’
3´
5´
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3´

5’-NNNNNNNNNNNGCA
3’-CGT

Formación no hay extensión
de horquillas

Hairpins (dobramentos da cadeia de um primer , fazendo com que
5´
PCR
3´
ela se pareie consigo mesma).
3´

5´

5´
3´

Productos de PCR no deseados
Fonte: http://www.lgcm.icb.ufmg.br/software/cursoBionumerics/Confeccao_oligonucleotideos_iniciadores.pdf
Taq DNA polymerase

PCR
5’ à 3’ / sem atividade corretiva!

Thermus
aquaticus

Thomas Brock - 1976

Estável até 117ºC
Taq DNA Polimerase
0,4 a 1U da enzima para reações de 25μl finais.
n  Para reações longas usar mais enzima ou
escolher mais estável
n  Em geral são forenecidas conjuntamente com
solução-tampão específica, cuja composição
varia com o fabricante.
n 
Non-Proofreading

PCR

Palguns erros na seqüência do fragmento final.
P adiciona

uma adenina (A) extra às extremidades 3´ do DNA **

Proofreading
P não adicionam nucleotídeos extras nas bordas das
cadeias-filhas
P Com atividade corretiva 3’ à 5’
Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus litoralis) Promega, Gold da PerkinElmer, Platinum da Life-Technologies, Vent da New England Biolabs, Pwo polimerase da
Boehring.
PCR

n 

Ao usar proofreads – usar maior concentração de dNTP’s
(mínimo 200μM de cada) para evitar destruição dos iniciadores.
n 

A incorporação de bases erradas (mismatch)em
enzimas sem atividade corretiva reduz a
estabilidade da interação enzima com o DNA
molde, o que pode favorecer a interrupção da
polimerização

Cuidar com Mg2+ e dNTP’s!
Inibidores da enzima Taq DNA
polimerase
Fenol
n  Proteinase K
n  Agentes quelantes em excesso (EDTA)
n  Hemoglobina
n  SDS
n  Elevadas concentrações de sal
n 
PCR

Solução-tampão
* Íons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros)
* Detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40)
* Proteínas estabilizantes (BSA)
* Substâncias que agem na denaturação da cadeia
molde de DNA (DTT = Dithiothreitol, βmercaptanoethanol), quebrando as pontes de
hidrogênio entre as bases.
PCR

Matriz dos 12 Tampões utilizados na otimização das reações de PCR
Tampão

Tris-HCl
pH 8,3

Tris- HCl
pH 8,8

Tris-HCl
pH 9,2

MgCl2

KCl

1

5mL (100mM)

-

-

750µL (15mM)

12,5mL (250mM)

2

5mL (100mM)

-

-

750µL (15mM)

37,5mL (750mM)

3

5mL (100mM)

-

-

1750µL (35mM)

12,5mL (250mM)

4

5mL (100mM)

-

-

1750µL (35mM)

37,5mL (750mM)

5

Atenção!

Concentrações de KCl maiores que
50mM inibem a atividade das
polimerases)
-

5mL (100mM)

-

750µL (15mM)

12,5mL (250mM)

-

5mL (100mM)

-

750µL (15mM)

37,5mL (750mM)

-

5mL (100mM)

-

1750µL (35mM)

12,5mL (250mM)

-

5mL (100mM)

-

1750µL (35mM)

37,5mL (750mM)

-

-

5mL (100mM)

750µL (15mM)

12,5mL (250mM)

10

-

-

5mL (100mM)

750µL (15mM)

37,5mL (750mM)

11

-

-

5mL (100mM)

1750µL (35mM)

12,5mL (250mM)

12

-

-

5mL (100mM)

1750µL (35mM)

37,5mL (750mM)

6
7
8
9

Adaptado do kit Opti-Primer® - Stratagene (Califórnia)
PCR

Mg2+

•  Co-fator essencial para a atividade
da Taq DNA polimerase
•  EDTA altera concentração do
magnésio livre na reação
•  Quantidade pode variar:
–  0.5 a 3.0 µM sugerido
–  Muito pouco: Taq não trabalha
–  Muito: “mispriming”, primersdimers
Curso UNIVILLE

PCR

Reagentes Necessários para a Reação

• Extras

•  Glicerol, DMSO (Dimetilsulfóxido)

•  0,1 a 10% na reação
- Estabiliza Taq,
- Ajuda na denaturação das
fitas DNA
–  Algumas Taq já vem
adicionadas com ele
•  BSA
Curso UNIVILLE

PCR

Parâmetros a serem avaliados
se algo der errado
Quantos ciclos?
Desnaturação a que temperatura?
Quanto tempo?
•  Taq perde atividade em altas T
°C:
–  Meia-vida a 95°C: 40 min
–  Meia-vida a 97.5°C: 5 min
PCR

•  Temperatura de Ligação dos Iniciadores
•  Baseia-se na Tm – padrão
•  Tentativa e erro
–  Muito alta: nenhum produto
–  Muito baixa: produtos
inespecíficos

•  Gradiente de temperatura
•  Necessário principalmente nos
primeiros ciclos
PCR

Gradiente de Temperatura
SC58

SC61

TM

Macias

Macias

Choachi

H8GS

D3493

Palma 2

Palma 2

H14

Caneleta

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

TºC

45,9

46,7

48

49,9

52,1

54,4

56,9

59,3

61,4

63

64,2

65
PCR

O que fazer?
•  Hot-Start PCR
–  Taq é adicionada somente após passo de
desnaturação inicial

•  Touchdown PCR
–  Temperatura de ligação dos iniciadores é
reduzida progressivamente
PCR

Mais Ciclos = Mais DNA
Size	

 Number of cycles	

Marker	

 0 10 15 20 25 30
PCR

Tipos de reação
de PCR
PCR

PCR Multiplex
•  Mais de um segmento genômico é
amplificado numa única reação,
cada um com seu par de primers
específico.
Onde usar? Investigação de paternidade
Diagnóstico de doenças
Identificação de transgênicos
PCR

Multiplex PCR:
•  Detecta vários genes de uma só vez
–  Identificação de trnasgênicos
•  Controle interno
PCR

PCR Multiplex : Exemplo
•  Três pares de iniciadores

Effect Gene
Marker Gene
Control Gene

Qual é o transgênico?
Nested PCR

PCR

Duas etapas (rounds) de amplificação

concomitantemente ou em duas reações separadas

Semi-Nested PCR
Melhorar especificidade e eficiência da reação
PCR
PCR

RT-PCR
(Reverse Transcriptase Chain Reaction):
RNA, que é convertido em cDNA (DNA complementar)

Ferramenta útil em estudos de expressão gênica
PCR
PCR

Por que usar PCR?
•  PCR pode amplificar quantidade incrível de DNA
(visível em gel de eletroforese) em ~2 horas.
•  Trabalha com amostras mínimas de DNA,
extraídas de pequenas quantidades de sangue,
pele, folículos pilosos, esperma, culturas ou até
mesmo de fragmentos de fósseis
•  O produto de PCR pode ser digerido com
enzimas de restrição, sequenciado ou clonado.
PCR

Aplicações
Diagnóstico de infecções: bactérias, vírus, fungos, protozoários
Quantificação de DNA ou RNA viral/célula hospedeira
Diagnóstico de mutações gênicas
Diagnóstico de doenças genéticas
Estudo da expressão gênica: detecção e quantificação de RNA
em:
diferentes tipos celulares
ao longo do desenvolvimento
PCR

Aplicações
Engenharia Genética
Diagnóstico de paternidade
Medicina Forense
Seqüenciamento de DNA
PCR

Amplificação do gene do spliced-leader de

NC

H-4

H-3

H-2

H-1

Lc

Lb

La

MW

diferentes cepas de Leishmania spp.

bp
587 458 298 236 Grisard et al., 2000
PCR
PCR

Identificação de mutações pontuais através da eliminação/criação de sítios de
restrição e geração de fragmentos de digestão com polimorfismo de
comprimento a partir de produtos de PCR (PCR/RFLP).
PCR

RAPD PCR
Randomly Amplified Polymorphic DNA
Uma PCR com um primer só...e amplificando qualquer
DNA
Primer (10 a 15 bases)
Temperatura de pareamento ou annealing < 45°C
Número de bandas superior a 4 e polimórficas (isto é,
com diferentes migrações) para indivíduos diferentes
PCR
PCR

O RAPD permite não apenas discriminar
entre populações diferentes de
organismos, mas inferir sua correlação
filogenética
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  • 1. PCR Reação em Cadeia de Polimerase IV CURSO DE VERÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENÔMICA MsC. Ingrid Thaís Beltrame Botelho – doutoranda ingridthaisbb@hotmail.com
  • 2. PCR O que é PCR? •  Amplificação de um segmento específico de DNA dentro de um genoma (gene ou parte dele, regiões supervariáveis, Junk DNA, etc.) •  “Fotocopiadora” molecular Fonte: www.genomics.agilent.com 
  • 3. Cópias “in vitro” usando elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. nucleotídeos
  • 4. PCR •  Inventada* por Kary Mullis em 1983. •  Primeira publicação em 1985 (Methods in Enzymology) • Recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1993.
  • 7. PCR Reagentes Necessários para a Reação •  Água •  Tampão •  DNA molde •  Iniciadores* •  Nucleotídeos •  Mg++ •  DNA Polimerase (Taq)*
  • 8. PCR 1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador automático
  • 9. Ciclos de Temperatura 1. Temperatura de desnaturação do DNA 2. Temperatura de ligação dos iniciadores 3. Temperatura de extensão da fita de DNA http://passel.unl.edu/pages/animation.php?a=PCR.swf PCR
  • 10. Desnaturação inicial: 4 minutos a 94ºC é suficiente para a grande maioria dos casos. Desnaturação: 1 minuto a 94ºC Ligação: 1 minuto operando na temperatura de ligação específica do primer, podendo ser aumentada até 90 segundos. Extensão: Temperatura ótima da enzima. Para a Taq, utiliza-se 1 minuto a 72ºC, podendo ser aumentada até 2 minutos de acordo com a quantidade utilizada, o número de ciclos e o tamanho do produto desejado Extensão Final: Após o término dos ciclos, costuma-se acrescentar um passo de 4 minutos a 72ºC, como oportunidade adicional para a polimerase agir Final: Programa-se o termociclador para um hold, de 0 a 4ºC, para manter as amostras conservadas até o momento de estocagem
  • 11. PCR
  • 12. Reagentes Necessários para a Reação •  Água •  DNA molde •  Nucleotídeos •  Iniciadores* •  DNA Polimerase (Taq)* •  Tampão •  Mg++
  • 13. Reagentes Necessários para a Reação •  DNA molde •  Quantidade mínima de DNA •  Complexidade do DNA –  De plasmídeos a genomas completos •  Pureza –  Proteínas, lipídeos, outro DNA, reagentes extração •  Degradação •  Inibidores - EDTA, heparina •  Contaminação –  Produtos amplificados
  • 14. PCR Dissolvido em água (deionizada estéril) tampão (TE = Tris-EDTA; HEPES; NaOH 0,8M em água, etc.) estocá-lo por longos períodos de tempo –20ºC - por até 2 anos em tampão apropriado.
  • 15. Desoxinucleotídeos – dNTP´s PCR (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) PSolução estoque de 10mM em água e pH 8,1* sem pirofosfato P Em concentrações iguais* P Concentração final entre 20 e 200µM, dependendo do tamanho do segmento e duração da reação P Altas concentrações afetam especificidade dos iniciadores
  • 17. Reagentes Necessários para a Reação Complementar a seqüência do DNA molde 15 a 30 pares de base* Conteúdo de C/G – 45 a 55%* Normalmente sense e antisense/ Foward e reverse Concentração ótima 0,1 a 0,5µM
  • 18. Considerar: •  Validade •  Número de congelamentos e descongelamentos •  Contaminação •  Quantidade –  Pouco: pouca amplificação –  Muito: pouca amplificação PCR
  • 20. (c) Evitar las secuencias repetidas 5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ “Desenhando” Iniciadores 3´ repetido 5´ 5’-NNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’ 3´ PCR Primer-Dimers (anelamentos Sense/Antisense), 3´ 5´ Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA 5´ 3´ (c) Evitar las secuencias repetidas 3´ 5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´ 5´-TATANNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´ Dímero de primer 5´ repetido Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA 5´ Self-Dimers (anelamentos3´Sense/Sense ou Antisense/Antisense) PCR 3´ 5´ (c) Evitar las secuencias repetidas 5´ 5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 3´ 5´ 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3´ 5’-NNNNNNNNNNNGCA 3’-CGT Formación no hay extensión de horquillas Hairpins (dobramentos da cadeia de um primer , fazendo com que 5´ PCR 3´ ela se pareie consigo mesma). 3´ 5´ 5´ 3´ Productos de PCR no deseados
  • 22. Taq DNA polymerase PCR 5’ à 3’ / sem atividade corretiva! Thermus aquaticus Thomas Brock - 1976 Estável até 117ºC
  • 23. Taq DNA Polimerase 0,4 a 1U da enzima para reações de 25μl finais. n  Para reações longas usar mais enzima ou escolher mais estável n  Em geral são forenecidas conjuntamente com solução-tampão específica, cuja composição varia com o fabricante. n 
  • 24. Non-Proofreading PCR Palguns erros na seqüência do fragmento final. P adiciona uma adenina (A) extra às extremidades 3´ do DNA ** Proofreading P não adicionam nucleotídeos extras nas bordas das cadeias-filhas P Com atividade corretiva 3’ à 5’ Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus litoralis) Promega, Gold da PerkinElmer, Platinum da Life-Technologies, Vent da New England Biolabs, Pwo polimerase da Boehring.
  • 25. PCR n  Ao usar proofreads – usar maior concentração de dNTP’s (mínimo 200μM de cada) para evitar destruição dos iniciadores.
  • 26. n  A incorporação de bases erradas (mismatch)em enzimas sem atividade corretiva reduz a estabilidade da interação enzima com o DNA molde, o que pode favorecer a interrupção da polimerização Cuidar com Mg2+ e dNTP’s!
  • 27. Inibidores da enzima Taq DNA polimerase Fenol n  Proteinase K n  Agentes quelantes em excesso (EDTA) n  Hemoglobina n  SDS n  Elevadas concentrações de sal n 
  • 28. PCR Solução-tampão * Íons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) * Detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40) * Proteínas estabilizantes (BSA) * Substâncias que agem na denaturação da cadeia molde de DNA (DTT = Dithiothreitol, βmercaptanoethanol), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases.
  • 29. PCR Matriz dos 12 Tampões utilizados na otimização das reações de PCR Tampão Tris-HCl pH 8,3 Tris- HCl pH 8,8 Tris-HCl pH 9,2 MgCl2 KCl 1 5mL (100mM) - - 750µL (15mM) 12,5mL (250mM) 2 5mL (100mM) - - 750µL (15mM) 37,5mL (750mM) 3 5mL (100mM) - - 1750µL (35mM) 12,5mL (250mM) 4 5mL (100mM) - - 1750µL (35mM) 37,5mL (750mM) 5 Atenção! Concentrações de KCl maiores que 50mM inibem a atividade das polimerases) - 5mL (100mM) - 750µL (15mM) 12,5mL (250mM) - 5mL (100mM) - 750µL (15mM) 37,5mL (750mM) - 5mL (100mM) - 1750µL (35mM) 12,5mL (250mM) - 5mL (100mM) - 1750µL (35mM) 37,5mL (750mM) - - 5mL (100mM) 750µL (15mM) 12,5mL (250mM) 10 - - 5mL (100mM) 750µL (15mM) 37,5mL (750mM) 11 - - 5mL (100mM) 1750µL (35mM) 12,5mL (250mM) 12 - - 5mL (100mM) 1750µL (35mM) 37,5mL (750mM) 6 7 8 9 Adaptado do kit Opti-Primer® - Stratagene (Califórnia)
  • 30. PCR Mg2+ •  Co-fator essencial para a atividade da Taq DNA polimerase •  EDTA altera concentração do magnésio livre na reação •  Quantidade pode variar: –  0.5 a 3.0 µM sugerido –  Muito pouco: Taq não trabalha –  Muito: “mispriming”, primersdimers
  • 31. Curso UNIVILLE PCR Reagentes Necessários para a Reação • Extras •  Glicerol, DMSO (Dimetilsulfóxido) •  0,1 a 10% na reação - Estabiliza Taq, - Ajuda na denaturação das fitas DNA –  Algumas Taq já vem adicionadas com ele •  BSA
  • 32. Curso UNIVILLE PCR Parâmetros a serem avaliados se algo der errado Quantos ciclos? Desnaturação a que temperatura? Quanto tempo? •  Taq perde atividade em altas T °C: –  Meia-vida a 95°C: 40 min –  Meia-vida a 97.5°C: 5 min
  • 33. PCR •  Temperatura de Ligação dos Iniciadores •  Baseia-se na Tm – padrão •  Tentativa e erro –  Muito alta: nenhum produto –  Muito baixa: produtos inespecíficos •  Gradiente de temperatura •  Necessário principalmente nos primeiros ciclos
  • 34. PCR Gradiente de Temperatura SC58 SC61 TM Macias Macias Choachi H8GS D3493 Palma 2 Palma 2 H14 Caneleta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 TºC 45,9 46,7 48 49,9 52,1 54,4 56,9 59,3 61,4 63 64,2 65
  • 35. PCR O que fazer? •  Hot-Start PCR –  Taq é adicionada somente após passo de desnaturação inicial •  Touchdown PCR –  Temperatura de ligação dos iniciadores é reduzida progressivamente
  • 36. PCR Mais Ciclos = Mais DNA Size Number of cycles Marker 0 10 15 20 25 30
  • 38. PCR PCR Multiplex •  Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. Onde usar? Investigação de paternidade Diagnóstico de doenças Identificação de transgênicos
  • 39. PCR Multiplex PCR: •  Detecta vários genes de uma só vez –  Identificação de trnasgênicos •  Controle interno
  • 40. PCR PCR Multiplex : Exemplo •  Três pares de iniciadores Effect Gene Marker Gene Control Gene Qual é o transgênico?
  • 41. Nested PCR PCR Duas etapas (rounds) de amplificação concomitantemente ou em duas reações separadas Semi-Nested PCR Melhorar especificidade e eficiência da reação
  • 42. PCR
  • 43. PCR RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): RNA, que é convertido em cDNA (DNA complementar) Ferramenta útil em estudos de expressão gênica
  • 44. PCR
  • 45. PCR Por que usar PCR? •  PCR pode amplificar quantidade incrível de DNA (visível em gel de eletroforese) em ~2 horas. •  Trabalha com amostras mínimas de DNA, extraídas de pequenas quantidades de sangue, pele, folículos pilosos, esperma, culturas ou até mesmo de fragmentos de fósseis •  O produto de PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado.
  • 46. PCR Aplicações Diagnóstico de infecções: bactérias, vírus, fungos, protozoários Quantificação de DNA ou RNA viral/célula hospedeira Diagnóstico de mutações gênicas Diagnóstico de doenças genéticas Estudo da expressão gênica: detecção e quantificação de RNA em: diferentes tipos celulares ao longo do desenvolvimento
  • 47. PCR Aplicações Engenharia Genética Diagnóstico de paternidade Medicina Forense Seqüenciamento de DNA
  • 48. PCR Amplificação do gene do spliced-leader de NC H-4 H-3 H-2 H-1 Lc Lb La MW diferentes cepas de Leishmania spp. bp 587 458 298 236 Grisard et al., 2000
  • 49. PCR
  • 50. PCR Identificação de mutações pontuais através da eliminação/criação de sítios de restrição e geração de fragmentos de digestão com polimorfismo de comprimento a partir de produtos de PCR (PCR/RFLP).
  • 51. PCR RAPD PCR Randomly Amplified Polymorphic DNA Uma PCR com um primer só...e amplificando qualquer DNA Primer (10 a 15 bases) Temperatura de pareamento ou annealing < 45°C Número de bandas superior a 4 e polimórficas (isto é, com diferentes migrações) para indivíduos diferentes
  • 52. PCR
  • 53. PCR O RAPD permite não apenas discriminar entre populações diferentes de organismos, mas inferir sua correlação filogenética