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eletroforese capilar

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  1. 1. 07/05/2012Eletrocromatografia Capilar- CECCapillary electrochromatographyHíbrido da CE com HPLC oferece algumas características do melhordas duas técnicas. Duas técnicas desenvolvidas a partir de 1980: Eletrocromatografia Capilar em coluna empacotada, e Eletrocromatografia Capilar eletrocinética micelar (MECC – MEKC) Vantagens CEC em comparação HPLC e CE: Pode ser aplicada a separação de espécies não carregadas como HPLC Permite a separação altamente eficientes de micro-volumes de solução, como CE, sem necessidade de sistema de bombeamento a alta pressão . 1Eletrocromatografia Capilar- CECCapillary electrochromatographyHistórico:1° expressão utilizando aplicação de Potencial elétrico em sistemascromatográficos 1974 Pretorios et.al. uso do FEO1° separação CEC Jorgenson e Lukacs 1981 Eletrodo grafite ,potencial 30 KV, capilar Ø int. 170 um, recheio de silica Partisil 10 ODS-2,detecção fluorescência, separando 9 metil antraceno e perileno, eficiência31000 e 23000 pratos teóricos. 2 1
  2. 2. 07/05/2012 Eletrocromatografia Capilar- CEC Capillary electrochromatography 3 A CEC: Difere da Cromatografia Eletrocinética Micelar pela utilização de uma fase estacionária verdadeira. O capilar [40-90 cm e Ø <= 100 um (efeito Joule↓)] é preenchido com uma fase estacionária e o solvente que se movimenta devido a eletrosmose. Fase Móvel mistura de tampão aquoso e solvente orgânico (acetonitrila e metanol) A CEC apresenta o dobro de pratos teóricos comparado ao HPLC para o mesmo tamanho de partícula e de coluna. Como não se usa pressão não há queda de pressão associada a particulas pequenas Uma fase móvel é transportada através do bombeamento eletrosmótico do fluxo ao invés do bombeamento mecânico sistema mais simples.O perfil do bombeamento é plano diferente do parabólico do HPLC conduzmenor alargamento da banda consequência maiores eficiências na separação. 4 2
  3. 3. 07/05/2012Eletrocromatografia em coluna empacotada: •Menos amadurecida de todas as técnicas Método Solvente polar é dirigido pelo FEO através de um capilar empacotado com uma fase estacionária, como HPLC Fluxo reverso. As separações dependem da distribuição das espécies entre a fase móvel e a fase estacionária líquida mantida no empacotamento. Aplicações : •Separação de Enatiômeros •“troca iônica” retenção se deve à atração entre os íons do soluto e os sítios carregados, ligado quimicamente à fase estacionária. •Análise de traços 5 6 3
  4. 4. 07/05/201278 4
  5. 5. 07/05/2012910 5
  6. 6. 07/05/20121112 6
  7. 7. 07/05/2012Eletrocromatografia Capilar: Cromatografia Eletrocinética CapilarCromatografia semelhante ao MIcelar:HPLC, exceto que a fase móvelse movimenta devido a Eletroforese com as micelaseletrosmose em vez de pressão atuando como uma fase pseudo estacionáriaDesvantagens da MEKC sobre CEC: Difícil trabalho com solutos muito polares retidos muito fortementenas micelas não há separaçãoLimitada capacidade de separação função do intervalo de tempo desaída do soluto não retido até o completamente retido Utilização de tensoativos que causam incompatibilidades com os sistemas de acoplados espectrometria de massa 13 Eletrocromatografia Capilar utiliza o melhor da CE e da HPLC: HPLC : o Maior seletividade ( capacidade de se nalisar uma classe de compostos de interesse sem efeito de interferências) e versatilidade de separação de compostos neutros. CE: o Maior eficiência de separação, oNão utiliza bombas de alta pressão, FEO promove perfil plano de fluxo pode existir interferência da fase estacionária CE Eletroferograma CEC Eletrocromatograma 14 7
  8. 8. 07/05/2012FE na Eletrocromatografia Capilar deve atender especificações : Interagir de maneira seletiva com varios tipos de moléculas desoluto, neutros ou não, proporcionando, assim como HPLC,diferentes taxas de migração através da coluna Apresentar porosidade, permitindo passagem do FEO edependendo do tipo de FE aumentado ou diminuindo cfme. odesejado 15 3 Tipos principais de colunas em CEC: Coluna Recheada material particulado geralmente poroso e esférico preenchimento até a janela de detecção FM passagem somente pelos poros. Colunas Tubulares abertas material cromatografico é apenas o revestimento polimérico interno no capilar e é ligado quimicamente ao mesmo. Coluna Monolítica mesmo material de fabricação das colunas tubulares abertas , porém presente radialmente em todo o comprimento do capilar 16 8
  9. 9. 07/05/2012 17 Coluna Recheada com partículas de silica •Ø das partículas de sílica de 1,5 a 5 um quimicamente modificadas. •Separação por interações hidrofílicas, hidrofóbicas, troca iônica e bioafinidade.Segato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009. 18 9
  10. 10. 07/05/2012 Colunas capilares abertas: •Recobrimento capilar com filme de Fase Estacionária (FE) •FE 4 tipos: Quimicamente ligadas Ligações orgânicas à superfície sílica reações silanização e hidrosililação ( adição de grupos silanos) Fisicamente adsorvidas interações eletrostáticas superfície da sílica e o ligante ( ex. surfactantes) A base de polimeros orgânicos ( polimerização in situ) Revestidas com processo sol-gel ( alcóxidos) Vantagens: Facilidade de preparação das colunas ↑ área superficial camadas poliméricas Utilização para verificação interações farmacos e proteínasSegato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009. 19 Coluna monolítica:Recheadas com leito contínuo de FE, altamente poroso, contendo rede decanais interconectados para passagem da Fase Móvel (FM)2 Tamanhos de poros : macroporos (2-50 nm) e mesoporosos (< 2 nm)1° aplicação 1970 Ross e Jefferson 1989 ↑ interesse Hjerten et. Al. geisde poliacrilamida com ↓grau de intercruzamento para separação proteínas.FE 2 categorias:Monolitos de Sílica fusão/sinterização, sol gel e polimierizaçãoMonolitos à base de polimeros orgânicos (base poliestireno, poliacrilamida,polimetacrilato)Utilização : + usados monolitos à base políemeros organicos ↑ facilpreparação, + robusto e ↑ tempo de vida. 20Segato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009. 10
  11. 11. 07/05/2012 21 Fases estacionárias: Baseadas nas FE HPLC fase reversa e iônica Fases reversas protonação da sílica em pH abaixo de 3 ↓ FEO análises mais lentas e analitos carregados podem ser fortemente retidos. Moléculas pequenas carregadas ideal troca iônica Modo misto estão sendo mais utilizadas ( grupos iônicos e cadeias hidrofóbicas) ↑↑FEO em larga faixa de pH. 22Segato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009. 11
  12. 12. 07/05/2012 Aplicações: 23 Alimentos 24Segato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009. 12
  13. 13. 07/05/2012 Explique: ordem de eluição componente 1 Tempo de eluição? HPLC CEC 25Ordem de eluição é em função das disferentes fases móveis, que geramdiferentes ordens de eluição, se as fases fossem iguais teríamos a mesma ordemde eluição.O tempo de eluição é em função do baixo FEO.Se ajustarmos a fase móvel obtemos a seguinte eluição: Capillary Electrochromatography, Smith N., Beckman Coulter, Londres, Reino Unido 26 13
  14. 14. 07/05/2012 Análises de hidrocaronetos poliaromáticos é realizada por HPLC e CEC obtem resolução de 180.000 pratos teóricos. 27Capillary Electrochromatography, Smith N., Beckman Coulter, Londres, Reino Unido Separação de isômeros do antibiótico Cefalosporin, foi requerida uma coluna capilar de 40 cm, seria impraticável esta separação por HPLC nesta coluna em função da pressão que seria necessária. 28Capillary Electrochromatography, Smith N., Beckman Coulter, Londres, Reino Unido 14
  15. 15. 07/05/2012 29Eletrocromatografia Capilar (CEC)Capillary Eletrochromatography é um híbrido da eletroforese capilarcom o HPLC e oferece algumas das melhores caracteristicas decada uma das técnicas:•Como HPLC pode ser aplicada as espécies não carregadas,•Como CE permite separações altamente eficientes de microvolumesde solução de amostra sem necessidade de sistema debombeamento de amostra em alta pressão.•Na eletrocromatograia, uma fase móvel é transportada através deuma fase estacionária pelo bombeamento eletrosmóticodo fluxo aoinvés do sistema mecânico com perfil plano e não parabólico. A faceplana do fluxo leva a um menor alargamento de banda Maioreficiência na separação!!•Pode ser realizada com colunas empacotadas e capilar. 30 15

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