O documento descreve técnicas de manipulação de DNA, incluindo desnaturação e renaturação de DNA, utilização de enzimas de restrição para cortar DNA em locais específicos, e uso de vetores como plasmídeos e fagos para clonagem de DNA estrangeiro. Vetores como pUC18, BACs e YACs são discutidos como opções para clonagem de fragmentos grandes de DNA.

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
Manipulação de DNA
O DNA pode ser desnaturado, quebra de pontes de H, por alteração dos valores pH,
temperatura que suporta. Mas também pode ser renaturado, se eu tiver as duas cadeias
completamente separadas entre si, a renaturação ocorre em dois passos: primeiro as cadeias
encontram-se, por colisões, e formam um pequeno sitio de complementariedade entre bases.
(first step, relatively slow- nucleation). Numa segunda fase mais rápida, há emparelhamento e
as duas cadeias ‘’zippper’’ between them.
 A interacção entre nucleótidos da cadeia dupla, diminui a absorção de luz UV.
 É a maior a absorção numa solução com nucleótidos livres.
 Efeito hipocrómico: quando tens a cadeia dupla que tem menor capacidade de
absorção
 Efeito hipercrómico: fala-se deste quando há desnaturação da dupla-hélice: os
nucleótidos livres tem maior absortividade.
 Cada espécie de DNA tem uma temperatura característica de desnaturação ( melting
point).G---C qt maior for o conteúdo destas bases como estão fortemente ligadas =>
maior é Tm (melting temperature)
 A concentração de sal também influencia: quanto maior a concentração de sal, maior a
força iónica, o que acontece é que a concentração de iões mascara as cargas
diminuindo as repulsões, estabilizando a estrutura. ‘’Daí, ser necessário ceder mais
energia para desnaturar a cadeia. ‘’
Hibridização : desnaturo as cadeias de DNA por aquecimento, misturo as cadeias soltas (tinhas
DNA de espécies diferentes) arrefeço a temperatura tal que as cadeias vão emparelhar, com
base na complementariedade entre si. Posso formar híbridos.
Quero incorporar DNA estrangeiro no genoma de um hospedeiro.
1. Cortar o DNA em locais bem definidos
Usas endonucleases de restrinção que reconhecem e cortam o DNA em sequências específicas
Type II restriction endonuclease é um grupo muito usado de endonucleases, a este pertence
EcoRI, HindIII (…)
 As enzimas de restrição (ou endonucleases de restrição) são enzimas que cortam o
DNA em locais específicos. As enzimas reconhecem determinadas sequencias
nucleotídicas do DNA e fragmentam a molécula sempre que identificam essa
sequência, produzindo extremidades coesivas ou cegas : muitas enzimas de restrinção
cortam em ziguezague e ficamos com uma cauda. Estas caudas são complementares a
outras bases. No caso das extremidades cegas, algumas enzimas clivam ambas as
cadeias de DNA no mesmo ponto, e não obtenho caudas.
Margarida Rodrigues

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
Repara que, se obténs caudas o processo é muito mais especifico, pois a sequência de DNA
clivada para emparelhar de novo tem que encontrar similitude para a cauda proeminente
Há menos erros, pois há maior especificidade.
Nas cegas, a complementariedade a garantir é muito menor : todos os nucleótidos das
extremidades estão já emparelhados.
a. Extremidades coesivas : EcoRI ; BamHI ; HindIII;
b. Extremidades cegas: SmaI ; Atu I
Os operadores podem inserir sequências especificas num vector, fragmentos sintéticos de DNA
(linkers) entre as pontas que estão a ser ligadas. Estes fragmentos tem múltiplos locais de
reconhecimento para endonucleases- polylinkers.
Polylinkers são importantes : são marcos para a seguir se poder adicionar DNA por quebra e
ligação. É um sitio de interacção com enzimas de restrinção, adicionado por engenharia
genética. Para clonar, escolhe-se uma enzima que corte em um ou dois destes locais. Facilita a
linearização da cadeia ( o vector é circular) para depois se poder clonar. Daí polylinker ou
multiple-cloning-site.
 Clonagem direccional : clonagem direccional significa que o fragmento de DNA será
inserido no plasmídio em apenas um sentido.
2. Selecção do Vetor
 Plasmideos como vectores de clonagem, pela replicação independente, tamanho
pequeno, numero múltiplo de cópias, presença de marcas de seleção
Plasmídeos são moléculas circulares duplas de DNA capazes de se reproduzir
independentemente do DNA cromossómico. Ocorrem geralmente em bactérias e por
vezes também em organismos eucarióticos unicelulares (ex: o anel de 2-micra em
Saccharomyces cerevisiae).
Os plasmídeos contém geralmente um ou dois marcadores seleccionáveis que conferem
uma vantagem selectiva à bactéria que os abriga, por exemplo, a capacidade de construir
uma resistência a antibióticos. A resistência advém da presença de pelo menos um gene
que codifique uma enzima capaz de neutralizar um determinado antibiótico.
Todos os plasmídeos contém pelo menos uma sequência de DNA que serve como uma
"origem de replicação" ou ori (um ponto inicial para a replicação de DNA), e que permite
ao DNA do plasmídeo replicar-se independentemente do DNA cromossómico. A ori é uma
Margarida Rodrigues

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
sequência específica de cinquenta a cem pares de bases e a sua presença é obrigatória
para que ocorra a replicação do plasmídeo.
 Os epissomas são plasmídeos que se conseguem integrar no DNA cromossómico do
hospedeiro. Por esta razão, podem permanecer intactos durante muito tempo, ser
duplicados em cada divisão celular do hospedeiro, e transformar-se numa parte básica
da sua constituição genética.
I. Pbr322
Tem locais importantes de restrinção: diferentes locais de reconhecimento que
são alvos para para endonucleases de restrinção, contribuindo com sítios onde o
plasmídeo pode mais tarde ser cortado p inserir o DNA estranho.
Tem resistência à ampicilina e à tetraciclina: ele tem genes que conferem
resistência a estes dois diferentes antibióticos, por isso, serve como marca de
seleção
Ori
4363 pares de bases.. facilita a entrada do plasmídeo nas células e a manipulação
bioquímica. ( pois é pequeno)
II. pAT153
conseguido por melhoramento do plasmídeo anterior : por remoção, e cortes.
É mais pequeno;
Perdeu ainda mais a capacidade de se transferir por conjugação : o que é positivo,
pois assim o operador tem o controlo pleno, evitando a disseminação do
plasmídeo com o DNA transferido.
III. Puc18 e puc19 são muito pequenos, 2686pb, são idênticos, contêm polilynkers em
sítios diferentes.
Rep: responsável pela replicação do plasmídeo-este plasmídeo foi aqui modificado
também para conseguirem maiores números de cópias
Bla gene: coding for beta lactamases, também foi modificado relativamente ao
pBR32
“It has one ampR gene (ampicillin resistance gene), and an N-terminal fragment of
β-galactosidase (lac Z) gene of E. coli. The multiple cloning site (MCS) region is split
into the lac Z gene (codons 6–7 of lac Z are replaced by MCS), where various
restriction sites for many restriction endonucleases are present.
The ori site or replicon, rep is derived from pMB1 vector. pUC vector is small but
has a high copy number. The high copy number of pUC plasmids is a result of the
lack of the rop gene and a single point mutation in rep of pMB1. The lac Z gene
codes for α-galactosidase. The recognition sites for HindIII, SphI, PstI, SalI, XbaI,
BamHI, SmaI, KpnI, SacI and EcoRI restriction enzymes have been derived from the
vector M13mp19.”
Margarida Rodrigues

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
LacI gene : lac repressor protein [na aula : gene que permite a regulação do lacZ? ]
 É importante as marcas de selecção: tem de ser possível distinguir entre as células
que recebem o plasmídeo das que não recebem. Toma um exemplo da aula:
Por exemplo vou usar o puk18 para transferir DNA estranho, este plasmídeo contêm
uma resistência à ampicilina, e lacZ –codifica para β-galactosidase .
Ao inserir o gene no plasmídeo entre o lacZ a célula deixa de ser capaz de degradar a
lactose. Porque não consegue produzir a β-galactosidase. Trato a célula com um
composto semelhante à lac. O X-gal que quando está hidrolisado cora de azul, e é
incolor quando não está hidrolisado. Num meio de cultura as células que estiverem
azuis degradaram o composto, isto é, conseguiram hidrolisar o X-Gal. Logo como se
pretende as células cujo o processo de incorporação do plasmídeo recombinante foi
eficaz, essas serão as que permanecem incolor (incapazes de degradar o X-Gal).
Fazes distinção entre três vectores:
 Vetores de clonagem
Típico ( o que foi visto até aqui)
 Vectores vai-vem
Vectores de clonagem capazes de replicar em organismos geneticamente distintos.
Margarida Rodrigues

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
São escolhidos porque conseguem ser incorporados em células procariontes( E.coli)
mas também são , ao mesmo tempo, usados para infetar células eucariontes, usa-se
em leveduras.
Encontras marcas de selecção para eucariotas, e (e.g.) t/pa : transcrição de sinais para
terminação/poli-adenilação.
E duas ori : oriY e oriC
CEN- sequencia do centrómero
 Vectores de expressão
Plasmídeo desenhado para expressão proteica na célula. O vetor é usado para
introduzir um gene numa célula alvo, tal que, consiga controlar o mecanismo para a
síntese proteica da proteína codificada pelo gene. O plasmídeo é desenhado para
conter uma sequência regulatória que actue como potenciador, promotor.. O
objectivo é produzir mRNA estável, e depois proteínas.
Superprodução de uma proteína recombinada (proteína-r) de forma
controlada
Margarida Rodrigues
 Origem de replicação + marcas genéticas de selecção
 Região promotora reconhecida pelo hospedeiro
 Codão de iniciação ATG
 Terminador de transcrição, a jusante da sequência codificante para
evitar a formação de m RNA longo
 Uma região ( Shine-Dalgarno) que garante uma ligação efectiva do m
RNA ao ribo
 Um ou mais codões STOP p a terminação da tradução
Expressão de proteínas recombinantes:
 Expressão em E. coli:
Vantagem: simplicidade e baixo custo
 Expressão em células eucariotas
Vantagens: quase sempre as proteínas são expressas no compartimento subcelular correto e
corretamente processadas.
Desvantagem: difícil produzir em larga escala (células de mamíferos, por ex.)Produção em
levedura é eficiente
O gene para ser expresso é inserido numa zona de restrinção do polylinker, perta do promotor.
Ocorre a transcrição do gene inserido. O operador permite a regulação por meio de
repressores. E encontra-se no mRNA uma sequência Shine-Delgarno que favorece a actividade
óptima dos ribo. : eles ligam-se a esta sequência, geralmente está localizada até ~8bases antes
do codão iniciação. Ajuda a recrutar o ribossoma p iniciar a síntese proteica
 pSE420- vetor de expressão controlada

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
Trc promotor: strong E.coli promotor
T1 e T2- terminadores da transcrição
 Outros vectores de clonagem
 Bacteriofagos
Um fago (também chamado bacteriófago) é um tipo de vírus que infecta apenas bactérias.
Muito usado pois, ~1/3 do seu genoma codifica para DNA não essencial, pelo que, pode
ser substituído por DNA estranho.
Os vectores desenvolvidos podem ser separados em três partes, 2 que contêm partes
essenciais e uma não. Qd o vetor é usado para clonagem, a terceira parte é descartada e
DNA essencial é colocado. O objectivo é que seja possível produzir fagos viáveis. Nota na
imagem:
Margarida Rodrigues

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
In vitro packaging in phage
coats ~~ empacotado se o
seu comprimento for 40000 e
53000 pares de bases
Nota que: aqui fala-se muito em vectores de substituição porque como tens uma parte
de DNA q não é essencial, essa porção é removida em detrimento do DNA que se quer
incorporar. Assim, aumento as possibilidades de inserir seções de DNA no fago
***Charon 40 ; EMBL 4
Existem vectores de inserção : o DNA é inserido sem ocorrer remoção de DNA que já
estava presente. Sempre obedecendo aos limites.
 BAC (bacterial artificial cromossome)
Vetores de clonagem com origem bacteriana, foram desenhados para a clonagem de grandes
segmentos de bases. Geralmente incluem resistências ao antibiótico clorofenicol, tal como
uma origem de replicação muito estável. Que mantêm o plasmídeo entre uma a duas cópias
por célula.Isto é importante, porque limita a oportunidade de combinações indesejadas que
poderiam alterar o DNAclonado. O DNA é introduzido na bactérias por eletroporação.
 YAC(yeast artificial cromossome)
Contêm todos os elementos para manter o cromossoma eucariótico no núcleo da
levedura : uma origem, duas marcas de selecção(X, e Y) um centromere (CEN), two
telomeres (TEL)
Don’t Forget: é um processo artificial.
Margarida Rodrigues

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Usas o gene URA3 como marca de selecção : URA3 encodes Orotidine 5'-phosphate
decarboxylase (ODCase), which is an enzyme that catalyzes one reaction in the
synthesis of pyrimidine ribonucleotides (a component of RNA). O hospedeiro tem uma
mutação neste gene e não sintetiza o uracilo, tem de ser implementado, quando
transfiro o YAC que leva o gene URA3 o organism deixa de ter q ser implementado com
uracilo e passa a ser Ura+ !!!!!!!!!
3. Ligação DNA estrangeiro ao vector
Usamos a ligase para ligar o fragmento estrangeiro ao vector, liga um pedaço de DNA digerido
por uma dada endonuclease e ligamos ao vector que também foi digerido pela mesma
endonuclease. A DNA ligase catalisa a formação de novas ligações fosfodiester numa reacção
em que usa ATP como cofactor( também pode usar NAD+) (ligações covalentes) .As sticky ends
facilitam este processo.
 T4 DNA ligase: produzida pelo bacteriófago T4 liga quer extremidades coesivas, quer
cegas.
 DNA ligase E.Coli: liga apenas extremidades coesivas
O DNA a ser inserido deve ser cortado com as mesmas duas enzimas, para ter extremidades
compatíveis com o vetor.
4. Transferência do DNAr para célula hospedeira
Amplificação
 Transformação: as células e os plasmideos são incubados juntos numa temperatura
0ºC numa solução de cloreto de cálcio, e depois submetidas a um choque térmico até
37/43ºC , nestas condições algumas bactérias acolhem o plasmídeo. Há transferência
de informação genética a partir de moléculas de DNA livres. Nem todas as bactérias
são consideradas competentes de incorporar o DNA livre no seu interior.
Neste método, recorre-se a uma alternativa: aumenta-se a permeabilidade celular por pulso
eléctrico- Eletrotransformação
A transferência torna-se cada vez mais difícil se for usar um plasmídeo grande !!!!
 Transdução: transferência de genes de um hospedeiro para uma outra célula, mediada
por um vírus. Ao fim do fago infectar, se entrar em ciclo lítico vai se proliferar dentro
da célula levando à lise celular. E espalha os fagos contendo a partícula dadora.
 Conjugação: processo de transferência de genes de uma célula proc. Para outra, por
um mecanismo que envolve o contacto físico entre os participantes.
Margarida Rodrigues

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I. Plasmídeo conjugativo (P) : P+ dadora, e P- receptora
Útil, mais à frente, para a técnica de
Northern Blot
Margarida Rodrigues
Ao fim da emissão do pilis sexual, e haver transferência para a célula
receptora de uma cadeia simples de P , ambas as células se tornam P :
potencialmente dadoras.
Metodos alternativas para inserir rDNA na célula ( eucarióticas)
 Transfeção : introdução de material genético para a célula hospedeira
Eletroporação /protoplastos: para tratar uma célula vegetal tenho que passar a parede
celular, e penetrar na membrana : trabalhar no protoplasto.
Micro-injeção: introdução do material DNA dentro do núcleo da célula hospedeira,
usando micro-pipetas…
Biobalística: micropartículas recobertas c o gene q se pretende difundir. Há um gás
comprimido, é solto e projecta as micropipetas a altas velocidades que penetram na
célula. Pode ter ou não sucesso
5. Seleção das células hospedeiras que contêm o DNA r
Foste vendo ao longo.
*Purificar DNA, quebro o compartimento (detergentes…), desproteinização, separação entre
os ácidos nucleicos, medição absorbância UV (260 vs 280). P fazer o DNA precipitar podes usar
álcool
*como isolar mRNA  fazendo uma cromo. Em coluna em que usas cromatografia de
afinidade,usas uma matriz de celulose com desoxitimidinas covalentemente ligadas, o que vai
acontecer é que quando colocas a solução de RNA o mRNA c a sua ponta 3’ poli-adenilada vai
interagir com as timidinas , colocas ainda NaCl para mascarar o efeito das cargas e intensificar
o processo da ligação do mRNA à matriz. Voltas a eluir com NaCl e desprende-se o r RNA t
RNA. Para separar o mRNA da matriz, elui-se com água: a agua vai formar pontes de
hidrogénio mais fortes. O mRNA solta-se.
 Detetar e quantificar fragmentos de DNA ou RNA
*hibridação de Southern blot
Quero saber se o DNA em estudo tem uma sequencia especifica X, vou hibridá-lo com outros
fragmentos complementares a essa sequência, e esperar que ocorra ligação.
 Digestão do DNA com enzimas de restrinção
 Fragmentos separados por tamanho numa eletroforese

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
 Uso na electroforese gel de agarose , como é Termo reversível não posso desnaturar a
cadeia com base em aumento de T ( sabendo que tenho que desnaturar a cadeia, pois
se pretendo hibridar assim o obriga) uso uma técnica de tratamento alcalino, adiciono
OH aumento o pH e quebro pontes de hidrogénio
 Passagem para uma membrane de nylon : the membrane is immersed in a solution
containing a radioactive DNA probe. O probe é complementar à sequência que ando à
procura, se ela existe na amostra ligar-se-á ao probe.
Northern Blot  ‘’o se existe e quanto ? ‘’
Estudo RNAm, quero saber se um dado gene é muito ou pouco expresso, não há melhor
maneira de o fazer a não ser estudar o RNAm. O RNAm produzido há de ser complementar
ao gene em questão!! Então aqui estudo o RNAm e depois coloco-o juntamente com o
probe , se houver ligação quer dizer que no RNAm está a sequencia génica expressa.
o O processo de desnaturação também é levado a cabo, para hibridizações perfeitas.
o Separo os mRNA na electroforese em função de tamanho.
o Hibridização com probes, numa membrana de nylon
o Pretendo quantificar nives de transcrição: consigo c isto estimar a quantidade e o
tamanho do transcrito ( analise das bandas)
Se quero clonar um gene de uma célula eucariótica tenho que usar o seu mRNA já processado,
porque ao inserir num vetor um típico DNA a cel. Proc. Não consegue processor o mRNA e o
processo não tinha efeito. O que acontece então é a partir do mRNA processado obter DNA, ao
qual chamo de DNA complementar.
Purifico o RNA, fazendo o processo que já vimos: cromatografia de coluna por afinidade.
Usa-se uma transcriptase reversa para produzir DNA a partir de mRNA .
Como primer, sei que o RNA processado tem uma cauda adenilada, logo faz sentido que o
primer seja complementar a cauda  poly (dT) adiciona-se transcriptase reversa, e inicia-se a
síntese de uma cadeia de DNAc obtem-se um ‘’hairspin?’’ uma redonda lá no fundo em 3’,
chama-se Klenow fragment e é o primer para a outra cadeia de cDNA . Basta DNA poli para
sintetizar esta última cadeia. No final o Klenow fragment é removido por nucleases.
Margarida Rodrigues

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Apontamentos de Biotecnlogia Alimentar II : manipulação DNA
PCR
Técnica em cadeia da polimerase, a ideia é fazer em poucas horas muitas cópias de um gene.
o Sequência de DNA p amplificar
o Primers adequados
o DNApolimerase termoestável
o Nucléotidos disponíveis
A partir da dupla cadeia, é separada por aquecimento. Adição de primers que se ligam à
zona a amplificar. Novo DNA é sintetizado por polimerização, usamos uma DNA poli- TaqI
que é estável a elevadas T, e não é desnaturada
Margarida Rodrigues