O documento descreve vários métodos para avaliar a toxicidade e efeitos de nanomateriais em culturas celulares, incluindo testes de citotoxicidade, proliferação celular, genotoxicidade e expressão gênica. Os testes de citotoxicidade incluem exclusão de Trypan Blue, MTT e LDH. Ensaios como Ames, aberrações cromossômicas e micronúcleo são usados para avaliar a genotoxicidade. Técnicas como Northern blot, RT-PCR e microarrays analisam alterações na expressão gênica causadas por nan

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE ENGENHARIA TECIDUAL
PROFESSORA FERNANDA NEDEL
Carolina Ximendes
Caroline Lucas
25 de Abril de 2011
Nanomateriais e cultivo celular
1

2. NANOMATERIAIS
 Potenciais efeitos adversos na saúde humana
 Testes de toxicidade
 Material é colocado em contato com a cultura
 Busca de alterações celulares por diferentes mecanismos
2
Introdução

3. CULTIVO CELULAR
3
Introdução
Células epiteliais Células mesoteliais
Confluência
de 80-90%

4. 4
Introdução

5. ENSAIOS IN VITRO
 Citotoxicidade
 Proliferação celular
 Genotoxicidade
 Expressão gênica
5
Introdução

6. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
 Detectar o potencial de um material em produzir efeitos
letais ou subletais
 Importante no desenvolvimento de produtos para uso
em humanos e animais
 Aplicado à biomateriais
 Liberação de substâncias tóxicas
 Lesão celular ou redução da taxa de crescimento 6

7. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
 Teste de exclusão de Trypan Blue
 Microcultura de tetrazólio
 Ensaio da Lactato Desidrogenase
7

8. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Teste de exclusão de Trypan Blue
8
Controle
Identifica o número de
células viáveis

9. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Teste de exclusão de Trypan Blue
9
Nanopartículas Tipo celular Resultado
Amianto crocidolita Células mesoteliais Citotóxico
PLA para entrega de
genes
Células epiteliais
Não citotóxico
(até 4mg/mL)
Diferentes metais e
nanotubos de
carbono
Células do pulmão
CuO - Citotóxico
Ferro - Pouca toxicidade
NTCs - Citotóxicos
Hillegas et al; Bejjani et al; Karlsson et al

10. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Microcultura de tetrazólio (MTT)
 Ensaio metabólico colorimétrico
 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium
bromide]
 Enzima desidrogenase
10

11. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Microcultura de tetrazólio (MTT)
11
Adição do
tetrazólio
Controle: Cultivo +
tetrazólio

12. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Microcultura de tetrazólio (MTT)
12
Nanopartículas Tipo celular Resultado
Nanopartícula para
entrega de fármaco
Células mesoteliais
Aumento da
citotoxicidade
PLGA + Paclitaxel Células do pulmão
Diminuição da
viabilidade celular
Hillegas et al; Fonseca et al

13. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Lactato desidrogenase (LDH)
 Enzima citosólica
 Indicadora de morte celular
 Integridade da membrana
13

14. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Lactato desidrogenase (LDH)
14
Nanopartículas Tipo celular Resultado
Albumina e
polialquilcianoacrilato
Células de pulmão
Albumina – Não apresentou
aumento de LDH
Polialquil – Aumento de LDH
Diferentes metais Células do fígado
Diâmetro maior – Mais
liberação de LDH
Brzoska et al; Hussain et al

15. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
 Ensaios para avaliar a multiplicação celular
 Métodos histoquímicos e imunohistoquímicos
15

16. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
 Conteúdo de DNA
 Incorporação de timidina
 Ki-67
 Detecção por PCNA
16

17. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
Conteúdo de DNA
 Observação e contagem de células em mitose
 Quantificar e identificar agentes inibidores ou indutores
 Resultado: divisão do número de células em mitose pelo
número total de células em uma população
17

18. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
Incorporação de timidina
 Indicativo do número de células em proliferação
 Técnica dispendiosa
 Exige treinamento e instalações especiais
 Longo período de incubação
18

19. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
Antígenos nucleares
Ki-67
 Presente em todas as fases do ciclo celular
PCNA
 Associados com síntese e reparação do DNA
19

20. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
 Nanomateriais com propriedades físico-químicas
distintas.
 Propriedades de superfície estão diretamente
relacionadas com o potencial genotóxico.
 Análise dos efeitos diretos no DNA fornecem
informações preliminares sobre o potencial de
genotoxicidade.
20

21. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
 Teste de Ames em Salmonella typhimurium e
Escherichia coli.
 Identificação de mutações no DNA por avaliação da
oxidação de guanina
 Análise de cariótipos- Ensaio de aberrações
cromossômicas e Teste do micronúcleo
 Ensaio cometa 21

22. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
 Ames e colaboradores desenvolveram uma forma de
simular o metabolismo humano no sistema bacteriano.
 Realizado em presença ou ausência de sistema de
metabolização exógeno (mistura S9).
 Incorporação de enzimas do fígado de mamífero no
sistema de teste em bactérias.
22

23. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
 Ocorrência de uma mutação genética que não causa
exigência a um determinado nutriente, que antes era
indispensável ao microrganismo.
 S. typhimurium- histidina
 E. coli- triptofano
23

24. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
Salmonella typhimurium
24

25. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
Nanopartículas Bactérias Resultado
Partículas de
UF·TiO2
S. typhimurium cepas TA98,
TA100, TA1535, e TA1537 e E. coli
cepa
WP2uvrA
Não
mutagênica
Fulerenos
S. typhimurium strains TA98,
TA100, TA1535, e TA1537 e E. coli
cepa
WP2uvrA
Não
mutagênica
Amianto crocidolita
ferro dependente
S. typhimurium TA102 Mutagênica
25

26. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste de Ames
 Possíveis diferenças na captação celular das nanopartículas
e complexidade genômica entre procariontes e eucariontes.
 O ensaio de Ames deve ser complementado por outros
estudos.
26

27. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Identificação de mutações no DNA por avaliação da
oxidação de guanina
 Mutações pontuais podem ser identificadas mediante a
análise da oxidação de guanina.
 Formação de (8-OHdG) e (oxo-dG).
 Potencial do nanomaterial para gerar ROS.
27

28. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Identificação de mutações no DNA por avaliação da
oxidação de guanina
Nanopartícula Tipo celular
Níveis de (8-OHdG) e
(oxo-dG)
Liga de cromo-cobalto (∼30 nm)
Fibroblastos
humanos
Não ocorreu aumento de
(8-OHdG)
Sílica luminescente (∼50 nm)
Células de
adenocarcinoma de
pulmão (A549)
Mesmo níveis de (oxo-dG)
no grupo exposto e no
controle.
28

29. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Ensaio de aberrações cromossômicas (CA)
 Avalia efeitos no número e na integridade dos
cromossomos através da análise de cariótipos.
 Técnicas de coloração e microscopia.
 Tratamento durante a fase S.
29

30. AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE
Ensaio de aberração cromossômica (CA)
Nanopartícula Concentração (μg/mL)
CA e aumento no
número de
cromossomos
UF·TiO2 (≤60 nm) 209.7 a 5000 Não
UF·TiO2 (∼140 nm) 25 to 2500 Não
Fulerenos 5000 5% das células testadas
30

31. AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE
Teste do micronúcleo
 Micronúcleos se formam pela extrusão de cromossomos
inteiros ou seus fragmentos durante a divisão celular.
 Permite identificar eventual aumento na frequência de
mutações em células.
31

32. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Teste do Micronúcleo
Nanopartículas Linhagem celular
Formação de
micronúcleos
UF·TiO2 (≤20 nm)
Fibroblastos de embriões de
hamster sírio.
Aumentou
UF·TiO2
(<100 nm)
Linfócitos humanos do sangue
periférico.
Aumentou
UF·TiO2 (<100 nm) WIL2-NS Aumentou
TiO2, liga cobalto-
cromo (∼30 nm)
Fibroblastos humanos Aumentou 32

33. AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE
Ensaio Cometa
 Identificação de quebras simples e duplas no DNA.
 Células com maior quantidade de danos no DNA
apresentam migração mais rápida do material genético.
 Extensão do dano avaliada pelo deslocamento do material
genético (cauda do cometa formada) em relação ao núcleo.
33

34. AVALIAÇAO DE GENOTOXICIDADE
Ensaio cometa
34

35. AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE
Ensaio Cometa
Nanopartículas Células
Tempo de
exposição
OTM
TiO2 (<100 nm)
Linfócitos humanos do
sangue periférico
0-24 h
Aumento dose e tempo
dependente
UF·TiO2 (<100 nm WIL2-N - Aumento de 5 vezes
Fulereno C60 - - Aumentou
Liga de cobalto-cromo
(∼30 nm)
Fibroblastos humanos 24 h Aumentou
Silica luminescente
(∼50 nm)
A549 -
Não ocorreu mudança
significativa
35

36. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
Técnicas para avaliação da expressão gênica
 Northern blotting
 Ensaio de proteção à ribonuclease (RPA)
 Ensaios de PCR- RT-PCR e Real-Time PCR
 Microarrays
36

37. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
Northern blotting
 Analisa a localização e a quantidade de mRNA.
 Compara padrão de expressão gênica entre duas amostras.
 Desnaturação do RNA e corrida em gel de agarose.
 Trasferência para membrana por ação capilar.
 Sondas de RNA ou DNA para hibridizar.
37

38. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
Ensaio de proteção a ribonuclease (RPA)
 Detecta e quantifica transcrições específicas de mRNA.
38

39. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
Real-time PCR
 Método quantitativo para detecção do número de
cópias do fragmento alvo.
 Quantificação realizada a cada ciclo, baseada na
detecção e quantificação de fluorescência emitida
durante a reação.
 Detecção específica e não específica
39

40. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
RT-PCR
 Reação da transcriptase reversa, seguida pela PCR.
 A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza
uma cadeia de DNA complementar (cDNA).
 Amplamente utilizada para verificar a expressão gênica.
40

41. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
 Microarrays
 Arranjo pré-definido de moléculas de DNA
quimicamente ligadas à uma superfície sólida.
 Detecção e quantificação de ácidos nucleicos (mRNA na
forma de cDNA ou DNA genômico) provenientes de
amostras biológicas.
41

42. ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA
Ensaio Células Resultado
Partícula magnética coberta
por ferritina x tratamento sem
partícula magnética
Fibroblasto
Humano
Diferença de expressão de 1718 mRNA , genes
responsáveis pela organização do citoesqueleto e
sinalização celular
PLA-PEG
Células
hepáticas de
camundongos
Super expressão de transportadores ABC e baixa
expressão de Glutationa-S-transferase P1
Inalação de TiO2 -
Efisema e indução da expressão de genes
relacionados com o ciclo celular, apoptose e
expressão de quimiocinas.
TiO2 revetido por BSA -
Expressão do fator inibidor da migração de
macrógafos (MIF)
Partículas submicrométricas
de titânio
-
Indução do fator estimulador de
colônia de macrófago (M-CSF) em osteoblasto.s
Nanopartículas de carbono A549 Aumento da transcrição da heme oxigenase-1
Nanopartículas de cobalto
Fibroblastos de
camundongos
Ativação de vias celulares de defesa e de
mecanismos de reparo. 42

43. CONCLUSÃO
 As técnicas podem ser utilizadas para avaliar a toxicidade das
nanopartículas, porém um número significativo de falsos
sinais positivos são gerados.
 Mais de um ensaio e tipo celular devem ser empregados.
 Realizar completa caracterização da variação de tamanho,
área superficial e composição química dos nanomateriais.
 Utilizar novas tecnologias, sistemas e métodos emergentes.
43

44. REFERÊNCIAS
 Jedd M Hillegass, Arti Shukla, Sherrill A Lathrop,
Maximilian B MacPherson, Naomi K Fukagawa, Brooke T
Mossman. Assessing nanotoxicity in cells in vitro. Wiley
interdisciplinary reviews Nanomedicine and
nanobiotechnology, 2010.
 S.M. Hussain, K.L. Hess, J.M. Gearhart, K.T. Geiss, J.J.
Schlager. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat
liver cells. Elsevier, 2005.
 Arora S, Jain J, Rajwade JM, Paknikar KM. Inter- actions
of silver nanoparticles with primary mouse fibroblasts
and liver cells. Toxicol Appl Pharmacol, 2009. 44

45. REFERÊNCIAS
 Bejjani RA, BenEzra D, Cohen H, Rieger J, Andrieu C, et
al. Nanoparticles for gene delivery to retinal pigment
epithelial cells. Mol Vis, 2005.
 Shukla A, Macpherson MB, Hillegass J, Ramos-Nino ME,
Alexeeva V, et al. Alterations in gene expression in
human mesothelial cells correlate with mineral
pathogenicity. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009.
 Eva Herzog, Alan Casey, Fiona M. Lyng, Gordon
Chambers, Hugh J. Byrne, Maria Davoren. A new
approach to the toxicity testing of carbon-based
nanomaterials—The clonogenic assay. Elsevier, 2007. 45

46. OBRIGADA!
46