Tecnologia enzimática livro

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Tecnologia Enzimática
Este site é baseado no livro de texto "Tecnologia Enzimática 'escrito por Martin Chaplin e Christopher Bucke (Cambridge University Press, 1990), que está atualmente fora de catálogo. Espera-se que ele será gradualmente editada e atualizada, mantendo-se neste site.

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Tecnologia enzimática livro

  1. 1. 1 Tecnologia Enzimática Este site é baseado no livro de texto "Tecnologia Enzimática 'escrito por Martin Chaplin e Christopher Bucke (Cambridge University Press, 1990), que está atualmente fora de catálogo. Espera-se que ele será gradualmente editada e atualizada, mantendo-se neste site. Capítulo 1 : Fundamentos da cinética enzimática  Por enzimas?  Nomenclatura de Enzimas  Unidades de enzima  O mecanismo de ação da enzima  Cinética simples de ação enzimática  Efeito do pH e da força iónica sobre a catálise enzimática  Efeito da temperatura e da pressão  Reacções reversíveis  A inibição de enzimas  Determinação da V max e K m  Resumo e Bibliografia do Capítulo 1 Capítulo 2 : preparação da enzima e uso  Fontes de enzimas  Triagem para novas enzimas  Mídia para a produção da enzima  Preparação de enzimas  Centrifugação  Filtration  Sistemas bifásicos aquosos  Ruptura celular  Ultrasonic rompimento celular  Homogeneizadores de alta pressão  A utilização de moinhos de esferas  Uso de Freeze-prensas  A utilização de métodos líticas  Preparação de enzimas a partir da solução clarificada  Tratamento térmico  Cromatografia  Cromatografia de troca Ion  A cromatografia de afinidade  Cromatografia de exclusão em gel  Preparação de enzimas para venda  Atendimento ao Cliente
  2. 2. 2  Segurança e aspectos regulatórios do uso de enzimas  Resumo e Bibliografia do Capítulo 2 Capítulo 3 : A preparação e a cinética de enzimas imobilizadas  O argumento econômico para a imobilização  Métodos de imobilização  A cinética de enzimas imobilizadas  Efeito de partição de soluto sobre a cinética de enzimas imobilizadas  Efeitos de difusão do soluto sobre a cinética de enzimas imobilizadas  Análise dos efeitos difusionais em suportes porosos  Resumo e Bibliografia do Capítulo 3 Capítulo 4 : A utilização em larga escala de enzimas em solução  A utilização em larga escala de enzimas em solução  A utilização de enzimas em detergentes  Aplicações de proteases na indústria de alimentos  O uso de proteases nas indústrias de couro e lã  A utilização de enzimas na hidrólise de amido  Produção de xarope de glucose  Produção de xarope contendo maltose  Enzimas na indústria de sacarose  Glicose a partir de celulose  O uso de lactase na indústria de lacticínios  Enzimas nas indústrias de sucos de frutas, vinho, cerveja e das destilarias  A glucose oxidase e catalase na indústria alimentar  Aplicações médicas de enzimas  Resumo e Bibliografia do Capítulo 4 Capítulo 5 : imobilizada enzimas e seus usos  Reactores enzimáticos  Reactores de membrana  Reactores de fluxo contínuo  Reactores de leito fixo  Fluxo de reactores de tanque agitado contínuo  Os reactores de leito fluidizado  Processos de enzima imobilizada  Xaropes de milho de alto -fructose (HFCS)  Uso de raffinase imobilizada  Uso de invertase imobilizada  A produção de ácidos aminados  Uso de lactase imobilizada  Produção de antibióticos
  3. 3. 3  Preparação de acrilamida  Resumo e Bibliografia do capítulo 5 Capítulo 6 : Biosensores  A utilização de enzimas em análise  Quais são biossensores?  Biossensores calorimetria  Biossensores potenciométricos  Biossensores amperométricos  Biossensores ópticos  Biossensores Piezo-elétrico  Imunossensores  Resumo e Bibliografia do Capítulo 6 Capítulo 7 : Os recentes avanços na tecnologia enzimática  As reacções enzimáticas em sistemas bifásicos líquidos  A estabilização de enzimas em sistemas aquosos-orgânicos bifásicos  Equilíbrio em sistemas bifásicos aquosos-orgânicos  Cinética de enzimas em sistemas aquosos-orgânicos bifásicos  O uso de sistemas aquosos de 2 fases  Exemplos práticos da utilização de enzimas 'ao contrário'  As glicosidases utilizadas em reacções sintéticas  A interesterificação de lípidos  Resumo e Bibliografia do Capítulo 7 Capítulo 8 : Perspectivas da tecnologia enzimática  Para onde a tecnologia enzimática?  O uso de substratos de "não naturais"  Engenharia Enzyme  Enzimas artificiais  Sistemas de regeneração Coenzima  Conclusões  Resumo e Bibliografia do Capítulo 8
  4. 4. 4 Tecnologia Enzimática Por enzimas? Catalisadores aumentar a velocidade das reações de outra forma lenta ou imperceptíveis sem sofrer qualquer alteração líquida em sua estrutura. O desenvolvimento inicial do conceito de catálise na 19 th século andava de mãos dadas com a descoberta de poderosos catalisadores de fontes biológicas. Estes foram chamados enzimas e foram mais tarde descobriu ser proteínas. Eles mediar todas as reações de síntese e de degradação realizados por organismos vivos. Eles são catalisadores muito eficientes, muitas vezes, muito superior aos catalisadores químicos convencionais, razão pela qual eles estão sendo utilizados cada vez mais na sociedade de alta tecnologia de hoje, como uma parte muito significativa da expansão biotecnológico. Sua utilização criou um negócio de bilhões de dólares, incluindo uma grande diversidade de processos industriais, produtos de consumo, e florescente campo de biossensores. Outras aplicações estão sendo descobertos constantemente. As enzimas têm um número de vantagens distintas sobre os catalisadores químicos convencionais. Entre tais são a sua especificidade e seletividade não só para as reações particulares, mas também em sua discriminação entre as partes semelhantes de moléculas (regioespecificidade) ou isômeros ópticos (estereoespecificidade). Eles apenas catalisar as reações de intervalos muito estreitos de reagentes (substratos), o qual pode consistir de um pequeno número de classes de compostos intimamente relacionados (por exemplo, tripsina catalisa a hidrólise de alguns pépticos e ésteres, em adição a maioria das proteínas), uma única classe de compostos (por exemplo, hexocinase catalisa a transferência de um grupo fosfato do ATP para várias hexoses), ou um único composto (por exemplo, glucose-oxidase de glucose oxida apenas entre os açúcares que ocorrem naturalmente). Isto significa que a reação pode ser catalisada escolhido para a exclusão de reações secundárias, eliminando subprodutos indesejáveis. Assim, as produtividades mais elevadas podem ser alcançadas, reduzindo os custos de material. Como um bônus, o produto é gerado em um estado não contaminada reduzindo assim os custos de purificação e a carga ambiental a jusante. Muitas vezes, um número menor de etapas podem ser necessários para produzir o produto final desejado. Além disso, certas reações Estero específicas (por exemplo, a conversão de glicose em frutose) não pode ser conseguida por métodos químicos clássicos sem um grande dispêndio de tempo e esforço. Enzimas trabalhar sob condições de processamento geralmente moderadas de temperatura, pressão e pH. Isto diminui os requisitos de energia, reduz os custos de capital devido ao equipamento de processo resistente à corrosão e reduz ainda mais a reações laterais indesejadas. As altas velocidades de reação e regulação catalítico simples obtidos em reações catalisadas por enzimas permitem um aumento da produtividade com redução de custos de produção, devido a salários e despesas gerais.
  5. 5. 5 Existem algumas desvantagens da utilização de enzimas que não pode ser ignorada mas que estão actualmente a ser tratadas e superar. Em particular, o custo elevado de isolamento e purificação da enzima ainda desencoraja a sua utilização, especialmente em áreas que têm actualmente um procedimento alternativo estabelecido. A natureza geralmente instável de enzimas, quando removido de seu ambiente natural, é também uma grande desvantagem para o seu uso mais extensivo. Tecnologia Enzimática Nomenclatura de Enzimas Todas as enzimas contêm um esqueleto da proteína. Em algumas enzimas esta é a única componente da estrutura. No entanto, existem porções adicionais não proteicos geralmente presentes que pode ou não participar na actividade catalítica da enzima. Grupos de hidratos de carbono ligadas covalentemente são comumente encontradas características estruturais que muitas vezes não têm relação direta com a atividade catalítica, embora eles podem muito bem afetar a estabilidade de uma enzima e solubilidade.Outros fatores frequentemente encontrados são íons metálicos ( co- fatores ) e baixa moléculas orgânicas de peso molecular ( coenzimas ). Estes podem ser vagamente ou fortemente ligados por forças não covalentes ou covalentes. Eles são frequentemente componentes importantes que contribuem tanto para a actividade e a estabilidade das enzimas. Este requisito para cofactores e coenzimas deve ser reconhecido se as enzimas devem ser utilizados de forma eficiente e é particularmente relevante em processos contínuos, onde pode haver uma tendência para que se separam da parte de proteína de uma enzima. As enzimas são classificadas de acordo com o relatório do Comitê de Nomenclatura nomeado pela União Internacional de Bioquímica (1984). Esta comissão enzima atribuído cada enzima um nome recomendado e um 4-part número distintivo. Deve notar-se que alguns nomes alternativos permanecem em uso comum, tais que eles vão ser utilizados, se for caso disso, no presente texto. A comissão enzima ( EC ) dividir números enzimas em seis grupos principais de acordo com o tipo de reacção que é catalizada: (1) Oxidorredutases que envolvem reações redox em que o hidrogênio ou oxigênio átomos ou elétrons são transferidos entre as moléculas. Esta classe extensa inclui as desidrogenases (transferência de hidreto), oxidases (transferência de elétrons ao oxigênio molecular), oxigenases (transferência de oxigênio do oxigênio molecular) e peroxidases (transferência electrónica de peróxido). Por exemplo: a glicose oxidase (EC 1.1.3.4, nome sistemático, -D-glucose: oxigênio 1-oxidoreductase).
  6. 6. 6 [1,1] -D-glicose + oxigénio D-glucono-1,5-lactona + peróxido de hidrogénio (2) Transferases que catalisam a transferência de um átomo ou grupo de átomos (eg acil-, alquil- e glycosyl-), entre duas moléculas, mas excluindo estas transferências como são classificados nos outros grupos (por exemplo, oxidoreductases e hidrolases). Por exemplo: aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1, nome sistemático, L-aspartato: aminotransferase 2-oxoglutarato, também chamado de transaminase glutâmico- oxalacética ou simplesmente GOT). [1,2] L-aspartato + 2-oxoglutarato oxaloacetato + L-glutamato (3) Hidrolases que envolvem reacções hidrolíticas e a sua reversão. Isto é actualmente a classe mais comum encontrado de enzimas dentro do campo da tecnologia de enzima e inclui as esterases, glicosidases, lipases e proteases. Por exemplo: quimosina (CE 3.4.23.4, nenhum nome sistemática declarado; também chamada renina).
  7. 7. 7 [1,3] -caseína + água Pará - -caseína + caseino macropéptido (4) liases que envolvem reacções de eliminação em que um grupo de átomos é removido a partir do substrato. Isto inclui as aldolases, descarboxilases, desidratases e alguns pectinases, mas não inclui hidrolases. Por exemplo: histidina amoníaco-liase (EC 4.3.1.3, nome sistemático, L-histidina amónia-liase; também chamado histidase). [1.4] L-histidina urocanate + amoníaco (5) Isomerases que catalisam isomerisations moleculares e inclui as epimerases, racemases transferases e intramoleculares. Por exemplo: xilose isomerase (CE 5.3.1.5, nome sistemático, D-xilose ketol-isomerase; comumente chamado isomerase glucose).
  8. 8. 8 [1,5] -D-glucopiranose -D-frutofuranose (6) As ligases , também conhecido como sintetases, formam um grupo relativamente pequeno de enzimas que envolvem a formação de uma ligação covalente juntar duas moléculas em conjunto, juntamente com a hidrólise de um nucleósido-trifosfato. Por exemplo: a glutationa-sintetase (EC 6.3.2.3, nome sistemático, -L-glutamil-L-cisteína: glicina ligase (ADP-formação); também chamado glutationa-sintetase). [1.6] ATP + -L-glutamil-L-cisteína + glicina + ADP + fosfato de glutationa Unidades de enzima A quantidade de enzima presente ou usado num processo é difícil de determinar, em termos absolutos (por exemplo gramas), como a sua pureza é frequentemente baixo e uma proporção pode estar em uma forma inactiva, ou parcialmente activa, estado. Parâmetros mais relevantes são a actividade da preparação de enzima e as actividades de enzimas quaisquer contaminantes. Estas actividades são habitualmente medida em termos da unidade de actividade ( U ) que é definida como a quantidade que irá catalisar a transformação de 1 micromole de substrato por minuto, em condições normalizadas.Tipicamente, isto representa 10 -6 - 10 -11 Kg de enzimas puras e 10 -4 -
  9. 9. 9 10 -7 Kg para as preparações de enzimas industriais. Outra unidade de actividade enzimática foi recomendada. Este é o katal ( kat ), que é definida como a quantidade que irá catalisar a transformação de uma mole de substância, por segundo (1 kat = 60 000 000 L). É uma unidade impraticável e ainda não recebeu ampla aceitação. Por vezes, as unidades de actividade não-padrão são usados, tais como Soxhet, Anson e Kilo Novo unidades, que são baseadas em modificações físicas, tais como a redução da viscosidade e supostamente melhor entendida pela indústria. Justamente, essas unidades são gradualmente caindo em desuso. A actividade é uma medida do conteúdo de enzimas que é claramente de grande interesse, quando a enzima é para ser utilizada em um processo. Por esta razão, as enzimas são geralmente comercializados em termos de actividade e não o peso. A actividade específica (por exemplo, L kg -1 ) é um parâmetro de interesse, alguma utilidade como um índice de pureza mas menor importância. Existe um grande problema com essas definições de actividade; a noção bastante vago de "condições normais". Estes destinam-se a referir-se a condições óptimas, especialmente no que diz respeito ao pH, força iónica, temperatura, concentração de substrato e a presença e concentração de cof actores e coenzimas. No entanto, estas condições óptimas assim-chamados variar tanto entre laboratórios e entre fornecedores. Eles também depender da aplicação particular em que a enzima é para ser utilizada. Além disso, as preparações da mesma actividade específica nocional pode ser diferente no que diz respeito à estabilidade e ser capaz de muito diferente catalítica total de produtividade (isto é o total de substrato convertido em produto, durante o tempo de vida do catalisador, sob as condições especificadas). Condições para a atividade inicial máximo não são necessariamente aqueles para a máxima estabilidade. Grande cuidado deve ser tomado a consideração desses fatores quando o catalisador mais eficiente para um fim específico deve ser escolhido O mecanismo da catálise enzimática A fim de que ocorra a reacção, as moléculas do reagente devem conter energia suficiente para atravessar uma barreira de energia potencial, a energia de activação . Todas as moléculas possuem diferentes quantidades de energia, dependendo, por exemplo, na sua história recente colisão mas, em geral, apenas alguns têm energia suficiente para a reacção. Quanto mais baixa for a barreira de energia potencial para reacção, os mais reagentes têm energia suficiente e, consequentemente, mais rápida é a reacção irá ocorrer. Todos os catalisadores, incluindo as enzimas, a função através da formação de um estado de transição, com os reagentes, de energia livre mais baixa do que seria encontrada na reacção não catalisada (Figura 1.1). Mesmo reduções bastante modestos neste barreira de energia potencial pode produzir grandes aumentos na taxa de reação (por exemplo, a energia de ativação para a repartição não catalisada de peróxido de hidrogênio em oxigênio e água é de 76 kJ M -1 que, na presença da enzima catalase, esta é reduzida para 30 kJ M -1 e a taxa de reacção é aumentada por um factor de 10 8 , suficiente para converter um tempo de reacção medido em anos em um medido em segundos).
  10. 10. 10 Figura 1.1. Um diagrama esquemático que mostra o perfil de energia livre do decurso da reacção catalisada por uma enzima que envolve a formação de enzima-substrato (ES) e da enzima de produtos complexos (PE), isto é, O caminho da reação catalisada passa pela transição Unidos TS c1 , TS c2 e TS c3 , com energia livre padrão de ativação G c * , ao passo que a reação não catalisada atravessa os TS estado de transição ucom energia livre padrão de ativação G u * . Neste exemplo, o passo limitante da velocidade seria a conversão de ES em PE. Reações envolvendo vários substratos e produtos, ou mais intermediários, são ainda mais complicada. O esquema de reação Michaelis-Menten [1.7] daria um perfil semelhante, mas sem a calha energia livre complexo EP-. O perfil esquemático para a reacção não catalisada é mostrado como a linha tracejada. Deve notar-se que o efeito catalítico apenas se refere à redução da energia livre de activação padrão de G u * a G c * e não tem efeito sobre a mudança total de energia livre (isto é. a diferença entre os pontos iniciais e finais ) ou a constante de equilíbrio relacionada.
  11. 11. 11 Há um número de mecanismos pelos quais esta diminuição da energia de activação pode ser conseguida.A mais importante delas envolve inicialmente a enzima de ligação do substrato (s), com a orientação correcta para reagir, perto dos grupos catalíticos no complexo enzima activo e quaisquer outros substratos. Desta forma, a energia de ligação é usado parcialmente, a fim de reduzir a contribuição da activação considerável entropia, devido à perda dos reagentes '(e grupos catalíticos') de translação e de rotação de entropia, no sentido da energia total de activação. Outros fatores que contribuem são a introdução de tensão em que os reagentes (permitindo mais energia de ligação a estar disponível para o estado de transição), a prestação de uma via alternativa e reativa a dessolvatação de reagir e catalisando grupos iônicos. As energias disponíveis para ligação de enzimas para os seus substratos é determinada principalmente pela complementaridade de estruturas (ou seja, um ajuste 3-dimensional boa mais forças de ligação iónicos e / ou não-covalentes hidrogénio óptimas). A especificidade depende repulsão estérica mínima, a ausência de cargas não solvatadas ou não emparelhados, e a presença de ligações de hidrogénio suficientes. Estas energias de ligação são capazes de ser muito grande. Como exemplos, constantes de dissociação antígeno-anticorpo são caracteristicamente perto de 10 -8 M (energia livre de ligação é de 46 kJ M -1 ), o ATP se liga a miosina com uma constante de dissociação de 10 -13 M (energia livre de ligação é de 75 kJ M -1 ) e biotina liga-se a avidina, uma proteína encontrada na clara do ovo, com uma constante de dissociação de 10 -15 M (energia livre de ligação é de 86 kJ M -1 ). No entanto, as enzimas não usar esta energia de ligação potencial simplesmente a fim de vincular o substrato (s) e formam complexos estáveis e duradouras. Se fosse este o caso, a formação do estado de transição entre ES e EP implicaria uma extremamente grande variação de energia livre, devido à quebra destas fortes forças de ligação, e a velocidade de formação de produtos seria muito lento. Eles devem usar essa energia de ligação para reduzir a energia livre do estado de transição. Isto é geralmente conseguido através do aumento da ligação para o estado de transição, em vez de os reagentes e, no processo, a introdução de uma estirpe energético no sistema e permitindo interacções mais favoráveis entre os grupos catalíticos da enzima e os reagentes. Cinética simples da ação da enzima Estabeleceu-se que as enzimas formar um complexo ligado aos seus reagentes (isto é, substratos ) durante o decurso da sua catálise e antes da libertação dos produtos. Isto pode ser simplesmente ilustradas, utilizando o mecanismo baseado no de Michaelis e Menten para uma reacção de um substrato, pela sequência de reacção: Enzima + Substrato (complexo enzima-substrato) Enzima + Produto
  12. 12. 12 [1,7] onde k 1 , k -1 e k 2 são as respectivas constantes de velocidade, tipicamente possuindo valores de 10 5 - 10 8 M -1 s -1 , 1 - 10 4 s -1 e 1 - 10 5 s -1 , respectivamente ; o sinal de os subscritos indicam a direcção em que a constante de velocidade está a actuar. Por razões de simplicidade a reacção inversa, relativa à conversão de substrato para produto não está incluído neste esquema. Este é (1) admissíveis para o início da reacção quando não há nenhuma, ou pouca, o presente produto, ou (2) quando a reacção é eficazmente irreversível. Reações reversíveis são tratadas com mais detalhes mais adiante neste capítulo.A velocidade da reacção (v) é a taxa à qual o produto é formado. (1,1) onde [] indica a concentração molar do material fechado (isto é, [ES] é a concentração do complexo enzima-substrato). A taxa de alteração da concentração do complexo enzima-substrato é igual à taxa de formação do seu menos a taxa do seu automóvel, para a frente para se obter o produto ou para trás para regenerar substrato. portanto: (1,2) Durante o curso da reacção, a enzima total no início da reacção ([E] 0 , no tempo zero) está presente quer como a enzima livre ([E]) ou o complexo ES ([ES]). ou seja, [E] 0 = [E] + [ES] (1.3) portanto: (1,4) Reunindo termos juntos, isto dá:
  13. 13. 13 (1,5) A equação diferencial de 1,5 é difícil de manusear, mas pode ser consideravelmente simplificado se pode presumir-se que o lado esquerdo é igual a [ES] sozinho. Este pressuposto é válido sob o estado estacionário aproximação suficiente mas desnecessariamente restritivo que a taxa de formação de ES é igual à sua velocidade de desaparecimento pela formação de produto e reversão para o substrato (ou seja, d [ES] / dt é zero). Além disso é válido quando a condição: (1,6) é válido. Isto ocorre durante uma parte substancial do curso de tempo de reacção ao longo de uma vasta gama de constantes cinéticas e concentrações de substrato e em baixo para concentrações enzimáticas moderadas. A variação em [ES], [d ES] / dt, [S] e [P], com o curso de tempo da reacção é mostrado na Figura 1.2, onde pode ser visto que a equação simplificada é válido durante a maior parte do reacção.
  14. 14. 14 . Figura 1.2 Simulação computacional das curvas de progresso da d [es] / dt (0-10 -7 escala M), [ES] (0-10 -7 escala M), [S] (0-10 -2 escala M ) e [P] (0 - 10 -2 M escala) por uma reacção de obedecer a uma cinética de Michaelis-Menten, com k 1 = 10 6 M -1 s -1 , k -1 = 1000 s -1 , k 2 = 10 s -1 , [E] 0 = 10 -7 M e [S] 0 = 0,01 M. A simulação mostra três fases distintas para o curso de tempo de reacção, de uma fase transiente inicial, que tem a duração de cerca de um milésimo de segundo, seguido por um período mais fase de estado estacionário de cerca de 30 minutos, quando [ES] permanece constante, mas apenas uma pequena proporção do substrato reage. Isto é seguido pela fase final, tendo cerca de 6 horas, durante o qual o substrato é completamente convertido em produto. é muito menos do que [ES] durante ambas as duas últimas fases. A equação de Michaelis-Menten (abaixo) é simplesmente derivadas a partir das equações 1.1 e 1.5, substituindo K m para . K m é conhecida como a constante de Michaelis com um valor tipicamente no intervalo de 10 -1 - 10 -5 M. Quando k 2 << k - 1 , K m é igual à constante de dissociação ( k-1 / k 1 ) do complexo de substrato da enzima.
  15. 15. 15 (1,7) ou, mais simplesmente (1,8) onde V max é a taxa máxima de reacção, o que ocorre quando a enzima está completamente saturada com substrato (ou seja, quando [S] é muito maior do que K m , V max é igual a k 2 [E], 0 , como o valor máximo [ ES] pode ter é [E] 0 quando [E] 0 é menor que [S] 0 ). Equação 1.8 pode ser rearranjada para mostrar a dependência da taxa de reacção na proporção de [S] para K m , (1,9) bem como a natureza da hipérbole retangular do relacionamento, tendo asymptotes na v = V max e [S] = -K m , (V max -v) (K m + [S]) = V max K m (1,10) A concentração de substrato nestas equações é a concentração real no momento e, num sistema fechado, apenas será aproximadamente igual à concentração inicial de substrato ([S] 0 ), durante a fase inicial da reacção. Por isso, é usual utilizar estas equações para relacionar a velocidade inicial da reacção com a concentração inicial de substrato, e facilmente predeterminado, (figura 1.3). Isto evita também qualquer problema que possa ocorrer através da inibição do produto ou reversibilidade de reacção (ver mais tarde).
  16. 16. 16 Figura 1.3. Uma trama normalizada da taxa inicial (v 0 ) em função da concentração inicial de substrato ([S] 0 ) para uma reacção de obedecer a cinética de Michaelis-Menten (equação 1.8). A trama foi normalizada a fim de torná-lo mais geralmente aplicável traçando a taxa relativa de reacção inicial (v 0 / V max ) em função da concentração inicial de substrato em relação à constante de Michaelis ([S] 0 / K m , mais vulgarmente designado a como  , a concentração de substrato sem dimensão). A curva é uma hipérbole retangular com asymptotes em v 0 = V max e [S] 0 = - K m . A tangente à curva na origem passa pelo ponto (v 0 = V máx ), ([S] 0 = K m ). A relação V max / K m é um parâmetro importante cinética que descreve a especificidade relativa de uma quantidade fixa de enzima para o seu substrato (mais precisamente definida em termos de k cat / K m ). A concentração do substrato, o que dá uma taxa de metade da velocidade máxima de reacção, é igual a K m . Tem sido demonstrado que alguns enzimas seguir à equação de Michaelis-Menten longo de uma larga gama de condições experimentais. No entanto, continua a ser, de longe, a equação mais geralmente aplicáveis para descrever reações enzimáticas. Na verdade, pode ser aplicada de forma realista a um número de reacções que têm um mecanismo muito mais complexa do que a descrita aqui. Nestes casos Km permanece uma quantidade importante, característica da enzima e do substrato, correspondente à concentração do substrato necessária para metade das moléculas de enzima para se ligar ao substrato (e, portanto, fazendo com que a reacção prossiga a metade da sua
  17. 17. 17 velocidade máxima) mas o significado cinética preciso derivado anterior não podem ser titulares e pode ser enganosa. Nestes casos, o K m é provável que igualam uma relação muito mais complexa entre as várias constantes de taxa envolvidos no esquema de reacção. Mantém-se independente das concentrações da enzima e do substrato e indica o grau de ligação entre a enzima e o seu substrato para uma dada concentração de substrato, um K inferiorm indicando um maior grau de ligação. V max depende claramente da concentração de enzima e, para alguns, mas não todas, as enzimas podem ser em grande parte independente do substrato específico utilizado. K m e V max tanto pode ser influenciada pela carga e conformação da proteína e do substrato (s) que são determinados pelo pH, temperatura, força iónica e outros factores . É muitas vezes preferível substituir k cat para k 2 , onde V max = k gato [E], 0 , como o significado preciso de k 2 , acima, podem também ser enganadora. k cat também é conhecido como o número de turnover como ele representa o número máximo de moléculas de substrato que a enzima pode 'virar' para produtos em um tempo definido (por exemplo, os números de volume de negócios de amilase, glucoamilase e glicose isomerase são 500 s -1 , 160 s -1 e 3 s - 1 , respectivamente; uma enzima com uma massa molecular relativa de 60000 e actividade específica 1 mg L -1 tem um número de turnover de 1 s - 1 ). A relação k cat / K m determina a taxa relativa de reacção a concentrações baixas de substrato, e é conhecida como a constante de especificidade . É também aparente a 2 nd constante de velocidade de ordem a baixas concentrações de substrato (ver Figura 1.3), onde (1.11) Muitas aplicações de enzimas envolvem sistemas abertos, onde a concentração de substrato permanece constante, devido à reposição, ao longo do curso de tempo de reacção. Isto é, é claro, a situação que prevalece frequentemente in vivo . Nestas circunstâncias, a equação de Michaelis-Menten é obedecida uma gama ainda maior de concentrações de enzima do que o permitido em sistemas fechados, e é comumente usado para modelar sistemas cinéticos da enzima imobilizada (ver Capítulo 3). As enzimas têm evoluído ao maximizar k cat / K m (ou seja, a constante de especificidade para o substrato) mantendo K m aproximadamente idêntica à concentração de substrato encontrados naturalmente. Isto permite que a enzima para operar de forma eficiente e ainda exercer algum controlo sobre a velocidade da reacção. A constante de especificidade é limitada pela taxa na qual os reagentes encontram um ao outro sob a influência de difusão. Para uma reacção de um único substrato, a taxa de encontro entre o substrato e a enzima é de cerca de 10 8 - 10 9 M -1 s -1 . A constante de especificidade de algumas enzimas abordar este valor, ainda que o intervalo dos valores determinados é muito larga (por exemplo, k cat / K m para a catalase é de 4 x 10 7 M -1 s - 1 , enquanto que é 25 M -1 s -1 durante isomerase da glicose, e para outras enzimas varia de menos de 1 M -1 s -1 a superior a 10 8 M -1 s -1 ).
  18. 18. 18 Efeito do pH e da força iónica As enzimas são moléculas anfotéricos contendo um grande número de grupos ácidos e básicos, situada principalmente na sua superfície. Os encargos sobre estes grupos podem variar, de acordo com as suas constantes de dissociação de ácido, com o pH do ambiente ( Tabela 1.1 ). Isto irá afectar o custo total líquido das enzimas e a distribuição de carga na sua superfície exterior, para além da reactividade dos grupos cataliticamente activas. Estes efeitos são especialmente importantes no bairro dos sítios ativos.Tomadas em conjunto, as alterações nas taxas de pH com afectar a actividade, solubilidade e estabilidade estrutural da enzima. Tabela 1.1 . pK um s um e calores de ionização b dos grupos ionizantes comumente encontrados em enzimas. Grupo Usual pK umintervalo Custo aproximado de pH 7 Heats de ionização (kJ mol -1 ) Carboxilo (C- terminal, ácido glutâmico, ácido aspártico) 3-6 -1.0 5 Amónio (N-terminal) (lisina) 7-9 1,0 +45 9-11 1,0 +45 Imidazolilo (histidina) 5-8 0,5 +30 Guanidilo (arginina) 11-13 1,0 +50 Fenólicos (tirosina) 9-12 0.0 +25 Tiol (cisteína) 8-11 0.0 +25 um O pK um (definida como -Log 10 (K um )) é o pH ao qual metade dos grupos são ionizados. Note-se a semelhança entre o K um de um ácido e de K m de uma enzima, que é a concentração do substrato em que metade das moléculas de enzima ter ligado substrato. ( Voltar ) b Por convenção, o calor (entalpia) de ionização é positiva quando o calor é retirado da solução circundante (isto é, a reacção é endotérmica) pela dissociação dos iões de hidrogénio. ( Voltar )
  19. 19. 19 Haverá um pH, característica de cada enzima, em que a carga líquida na molécula é zero. Isto é chamado de ponto isoeléctrico (pi), na qual a enzima geralmente possui uma solubilidade mínima em soluções aquosas. De uma maneira semelhante ao efeito sobre as enzimas, a distribuição de carga e carga sobre o substrato (s), o produto (s) e coenzimas (onde aplicável) também será afectado por alterações de pH. O aumento da concentração de iões de hidrogénio será, além disso, aumentar a competição bem sucedida dos iões de hidrogénio para qualquer locais na enzima de ligação catiónico de metal, reduzindo a concentração de catião metálico ligado. Uma redução na concentração de iões de hidrogénio, por outro lado, leva a aumento da concentração de iões hidroxilo que competir com ligandos para as enzimas 'divalentes e trivalentes causando a sua conversão em hidróxidos e, em concentrações elevadas, hidroxilo, a remoção completa da enzima. A temperatura também tem um efeito marcado sobre ionisations, cuja extensão depende dos calores de ionização dos grupos particulares em causa ( Tabela 1.1 ). A relação entre a variação no pK um e a mudança de temperatura é determinada por um derivado da equação de Gibbs-Helmholtz: (1.12) em que T é a temperatura absoluta (K), R é a constante da lei de gás (8,314 JM -1 K - 1 ), H é o calor de ionização e a constante numérica (2,303) é o logaritmo natural de 10, como pKa um 's são baseados em logaritmos com base 10. Esta variação é suficiente para deslocar o pI de enzimas até uma unidade de pH no sentido de um menor aumento da temperatura de 50C. Estas variações de carga, além de quaisquer consequentes alterações estruturais, pode ser refletido em mudanças na ligação do substrato, a eficiência catalítica e a quantidade de enzima ativa. Ambos V max e de K m vai ser afectada devido às modificações resultantes para as constantes cinéticas de k 1 , k -1 e k cat(k 2 no mecanismo de Michaelis-Menten), e a variação da concentração de enzima activa . O efeito do pH sobre a V max de uma reacção enzimática catalisada pode ser explicado com o uso, geralmente verdade, pressuposto de que apenas uma forma carregada de enzima é optimamente catalítica e, portanto, a concentração máxima do intermediário enzima- substracto não pode ser maior do que o concentração desta espécie. Em termos simples, assumir EH - é a única forma activa do enzima, [ 1,8 ] A concentração de EH - é determinada pelas duas dissociações [ 1,9 ]
  20. 20. 20 [ 1.10 ] com (1.13) e (1,14) No entanto, (1,15) portanto: (1.16) Como a velocidade da reacção é dada por k 2 [EH - S] e esta é máxima quando [EH - S] é máximo (ou seja, quando [EH. - S] = [EH - ] 0 ): (1,17) O V max será maior quando (1,18) portanto: (1,19) Esta derivação envolveu uma série de simplificações sobre a situação real; ignora o efeito da ionização de substratos, os produtos e os complexos enzima-substrato e presume EH - é uma única espécie ionizado quando ela pode conter uma mistura de grupos ionizados diferente mas com carga global idêntica, embora o processo de
  21. 21. 21 ligação do substrato tenderá para fixar as espécies iônicas necessárias. Ele, no entanto, produzir uma variação de taxa máxima com pH que dá a curva comumente encontrado 'em forma de sino "( Figura 1.4 ). Quando o esquema de reacção real é mais complexa, pode haver uma relação mais complexa entre V max e pH. Em particular, pode haver uma mudança no passo determinante da velocidade com o pH. Deve ser reconhecido que K m pode mudar com o pH de uma forma independente do V max , uma vez que geralmente envolve outros, ou adicionais, grupos ionizáveis. É claro que em menores concentrações de substrato não saturando as mudanças de actividade com pH pode ou não refletir as mudanças na V max . Deve também notar-se a partir da discussão anterior que a variação da actividade com o pH depende do sentido de reacção sob consideração. O pH óptimo pode muito bem ser diferente na direcção para a frente do que mostrado pela reacção inversa. Isto é particularmente visível quando as reações que liberam ou utilizam prótons são considerados (por exemplo, desidrogenases) onde não podem muito bem ser superior a 2 pH unidades diferença entre o pH ideal mostrado pelas taxas de frente e reações reverter. Figura 1.4. Um diagrama esquemático de aplicação geral da variação na taxa de uma reacção catalisada por enzima (V max ) com o pH da solução. O centro (pH ótimo) e amplitude dessa "forma de sino 'curva depender das constantes de dissociação de ácido dos grupos relevantes na enzima. Deve notar-se que algumas enzimas têm perfis de pH da actividade que mostram pouca similaridade com este diagrama. A variação da actividade com o pH, dentro de um intervalo de 2-3 unidades de cada lado da pi, é normalmente um processo reversível. Os extremos do pH, no entanto, provocar um tempo e dependente da temperatura, essencialmente irreversível, a desnaturação. Em solução alcalina (pH> 8), pode haver destruição parcial dos resíduos
  22. 22. 22 cisteína devido a catalisada por base reacções -eliminação, enquanto que, em soluções ácidas (pH <4), a hidrólise das ligações peptídicas lábeis, por vezes encontrada ao lado de resíduos de ácido aspártico , pode ocorrer. A importância do conhecimento sobre a variação da atividade com pH não pode ser mais enfatizado. No entanto, um número de outros factores pode significar que o pH óptimo do V max diagrama -pH pode não ser a escolha do pH em um processo tecnológico envolvendo enzimas. Estes incluem a variação de solubilidade do substrato (s) e produto (s), mudanças na posição de equilíbrio para uma reacção, a supressão da ionização de um produto para facilitar a sua divisão e recuperação para um solvente orgânico, e a redução da susceptibilidade a oxidação ou a contaminação microbiana. O principal factor de tal é o efeito do pH sobre a estabilidade da enzima. Esta relação é ainda mais complicada pela variação do efeito do pH com tanto a duração do processo e a temperatura ou perfil de temperatura-tempo. O parâmetro importante derivada destas influências é a produtividade da enzima (ou seja, a quantidade de substrato que é capaz de converter em produto). A variação de pH com a produtividade pode ser semelhante à do V max relação -pH mas as mudanças na composição da corrente e o tempo de contacto do substrato pode também fazer alguma contribuição. Em geral, a variação deve ser determinado de acordo com as condições do processo industrial. É possível alterar os perfis de pH da actividade de enzimas. A ionização dos ácidos carboxílicos envolve a separação dos grupos libertados de carga oposta. Este processo é incentivada dentro das soluções de maior polaridade e reduzido por soluções menos polares. Assim, reduzindo a constante dieléctrica de uma solução aquosa através da adição de um co-solvente de polaridade baixa (por exemplo, dioxano, etanol), ou por imobilização (ver Capítulo 3 ), aumenta o pKa de um dos grupos de ácido carboxílico. Este método é, por vezes, útil, mas geralmente não aplicável aos enzima reações catalisadas, pois pode causar uma mudança drástica na produtividade de uma enzima devido a desnaturação (mas veja Capítulo 7 ). O pK umdos grupos básicos não são igualmente afetados, pois não há separação de cargas, quando grupos básicos ionizar. No entanto, os grupos básicos protonados que são estabilizadas por grupos vizinhos carregados negativamente será estabilizado (ou seja, ter reduzido pK um ) por soluções de baixa polaridade. As alterações na força iónica (  ) da solução pode também ter algum efeito. A força iónica é definida como metade da soma total da concentração (c i ) de todas as espécies iónicas (I) na solução vezes o quadrado da sua carga (z i ); isto é.  = 0,5 (c i z i 2 ). Por exemplo, a força iónica de uma solução 0,1 M de CaCl 2 é 0,5 x (0,1 x 2 2 + 0,2 x 1 2 ) = 0,3 M. Na maior solução iónica força, cobrar separação é estimulado com uma concomitante redução do ácido carboxílico pK um s. Estas alterações extensivas, como eles podem ser, têm pouco efeito sobre a carga total da molécula de enzima em pH neutro e, portanto, só é susceptível de exercer uma pequena influência sobre o ponto isoeléctrico da enzima. Métodos de derivatização química estão disponíveis para converter cargas superficiais do positivo para o negativo e vice-versa. Verificou-se que uma única mudança na carga tem pouco efeito sobre o perfil de pH da actividade, a menos que seja no local activo. No entanto, se todas as lisinas são convertidos em carboxilatos (por
  23. 23. 23 exemplo, por reacção com anidrido succínico) ou se todos os carboxilatos são convertidas em aminas (por exemplo, por acoplamento de etileno diamina por meio de uma carbodiimida, ver Capítulo 3 ) o perfil pode ser deslocado sobre um pH unidade na direcção de pH mais elevado ou inferior, respectivamente. A causa desses desvios é principalmente a estabilização ou desestabilização das taxas no local activo durante a reacção, e os efeitos são mais evidentes a baixa força iónica. Alguns, mais poderoso, métodos para mudar o perfil de pH-atividade são específicas de enzimas imobilizadas e descrito no Capítulo 3 . A força iónica da solução que é um parâmetro importante que afecta a actividade da enzima. Isto é especialmente perceptível em catálise depende do movimento de moléculas carregadas em relação ao outro. Assim, tanto a ligação de substratos cobradas para enzimas e o movimento de grupos carregados dentro do sítio catalítico "ativo" será influenciada pela composição iônica do meio. Se a velocidade da reacção depende da abordagem de porções carregadas da seguinte relação aproximada pode segurar, (1.20) onde k é a constante de velocidade real, k 0 é a constante de velocidade a zero, a força iónica, z Uma ez Bsão as cargas electrostáticas das espécies reagentes, e Ié a força iónica da solução. Se as cargas sejam opostas, em seguida, há uma diminuição na taxa de reacção com o aumento da força iónica enquanto que, se as cargas são idênticos, um aumento na taxa de reacção irá ocorrer (por exemplo, o passo de controlo da velocidade do mecanismo catalítico de quimotripsina envolve a abordagem de dois grupos carregados positivamente, 57 histidina + e 145 de arginina + causando um aumento significativo em k cat no aumento da força iónica da solução). Mesmo se uma relação mais complexa entre as constantes de velocidade e a força iónica se mantém, é claramente importante para controlar a força iónica das soluções em paralelo com o controlo de pH. Efeito da temperatura e da pressão Taxas de todas as reacções, incluindo aquelas catalisada por enzimas, sobem com o aumento da temperatura de acordo com a equação de Arrhenius. (1,21) onde k é a constante de velocidade cinética para a reacção, A é a constante de Arrhenius, também conhecido como o factor de frequência, L * é a energia livre padrão de activação (kJ M -1 ) que depende da factores de entalpia e entropia, R é a constante de lei dos gases e T é a temperatura absoluta.Energias livres padrão típicos de ativação (15-70 kJ M -1 ) dá origem a aumentos na taxa por fatores entre 1,2 e 2,5 para cada 10C aumento da temperatura. Este factor para o aumento da velocidade de
  24. 24. 24 reacção para cada aumento de 10 ° C na temperatura é geralmente indicada pelo termo Q 10 (isto é, neste caso, Q10 está dentro do intervalo 1,2-2,5). Todas as constantes de velocidade que contribuem para o mecanismo catalítico irá variar independentemente, resultando em alterações tanto K m e V max . Daqui resulta que, numa reacção exotérmica, a reacção inversa (tendo uma energia de activação superior) aumenta mais rapidamente com a temperatura de reacção para a frente. Isto, não só altera a constante de equilíbrio (ver equação 1,12), mas também reduz a temperatura óptima para a conversão máxima medida que a reacção progride. O inverso aplica-se para reacções endotérmicas, tais como a de isomerase de glucose (verreacção [1,5] ), onde a proporção de frutose em glucose, no estado de equilíbrio, aumenta de 1,00 para 1,17 a 55C em 80C. Em geral, é preferível a utilização de enzimas em altas temperaturas, a fim de fazer uso deste aumento da taxa de reacção mais a protecção contra ela proporciona a contaminação microbiana. As enzimas, porém, são proteínas e sofrem essencialmente irreversível desnaturação (isto é. a alteração conformacional que implica uma perda de actividade biológica), a temperaturas acima daquelas a que se encontram normalmente expostos no seu ambiente natural. Estas reacções de desnaturação têm energias livres de padrão de activação de cerca de 200-300 kJ mol -1 (Q 10 no intervalo de 6-36), o que significa que, acima de uma temperatura crítica, há uma rápida taxa de perda de actividade ( Figura 1.5 ) . A perda real da atividade é o produto dessa taxa ea duração da incubação ( Figura 1.6 ). Isso pode ser devido a alterações covalentes, tais como a desaminação de resíduos de asparagina ou alterações não covalentes, tais como o rearranjo da cadeia de proteína. Inactivação por desnaturação pelo calor tem um efeito profundo sobre a produtividade enzimas ( Figura 1.7 ). Figura 1.5. Um diagrama esquemático que mostra o efeito da temperatura sobre a actividade de uma enzima reacção catalisada. curto período de incubação; ----- longo
  25. 25. 25 período de incubação. Note-se que a temperatura à qual parece haver actividade máxima varia com o tempo de incubação. Figura 1.6. Um diagrama esquemático que mostra o efeito da temperatura sobre a estabilidade de uma enzima reacção catalisada. As curvas mostram a atividade percentual restante como o período de incubação aumenta. Do alto que representam aumentos iguais na temperatura de incubação (50C, 55C, 60C, 65C e 70C). Figura 1.7. Um diagrama esquemático que mostra o efeito da temperatura sobre a produtividade de uma reacção catalisada por enzima. 55C; 60C; 65C. A produtividade óptima é visto a variar com o tempo do processo, o que pode ser determinado por outros factores adicionais (por exemplo, custos gerais). É muitas vezes difícil conseguir um controlo preciso da temperatura de um processo catalisado enzima e, sob estas circunstâncias, pode ser visto que é prudente errar no lado de baixa temperatura.
  26. 26. 26 A desnaturação térmica de uma enzima pode ser modelada pela seguinte esquema de desactivação de série: [1.11] onde k d1 e K d2 são os coeficientes da taxa de desactivação de primeira ordem, E é a enzima nativa, que pode, ou não, ser uma mistura de equilíbrio de um número de espécies, caracterizada a estrutura ou actividade, e E 1 e E 2 são moléculas de enzima de actividade específica média em relação a E de A 1 e A2 . A 1 pode ser maior ou menor que a unidade (isto é, E 1 pode ter actividade mais elevada ou mais baixa do que E) Um passo que 2 é normalmente muito pequena ou zero. Este modelo permite que os raros casos que envolvem a enzima livre (por exemplo, a tirosinase) e os casos que envolvem um pouco plebeu enzima imobilizada (ver Capítulo 3), onde há uma pequena ativação inicial ou período de graça que envolve a perda insignificante discernível de atividade durante períodos de incubação curto, mas antes a desactivação mais tarde. Supondo que, no início da reacção: (1,22) e: (1,23) No instante t, (1,24) Decorre o esquema de reacção [1.11] , (1,25) Integrando a equação 1.25 usando a condição de contorno na equação 1.22 dá: (1,26) A partir do esquema de reacção [1,11],
  27. 27. 27 (1,27) Substituindo [E] a partir da equação 1.26, (1,28) Integrando a equação 1.27 usando a condição de contorno na equação 1.23 dá: (1,29) Se o termo "atividade fraccionada» (A f ) é introduzido onde, (1.30) em seguida, substituindo [E 2 ] a partir da equação 1.24, dá: 1.31 portanto: 1,32 Quando ambos A 1 e A 2 são iguais a zero, os simples de primeira ordem resultados de expressão velocidade de desactivação (1.33) A meia-vida (t 1/2 ) de uma enzima é o tempo que leva para a actividade para reduzir à metade da actividade original (i, e. Uma f = 0,5). Se a inactivação do enzima obedece a equação 1,33, a meia-vida pode ser derivada simplesmente, (1,34) portanto: (1,35)
  28. 28. 28 Neste caso simples, a semi-vida da enzima é mostrada a ser inversamente proporcional à taxa de desnaturação. Muitas preparações de enzimas, ambos gratuitos e imobilizados, parecem seguir este esquema de desativação do tipo série. No entanto, porque os dados de confiança e reprodutível é difícil de obter, os dados de inactivação deverá, em geral, ser considerada como sendo um pouco propensa a erros. Não é de estranhar que esses dados podem ser feitas para ajustar um modelo envolvendo quatro parâmetros determinados (A 1 , A 2 , k d1 e k D2 ). Apesar dessa possível reserva, equações 1.32 e 1.33 permanecem bastante útil e a teoria possui a vantagem definitiva da simplicidade. Em alguns casos, o tipo série de desactivação pode ser devido a micro-heterogeneidade estrutural, em que a preparação de enzima é constituída por uma mistura heterogénea de um grande número de formas estruturais afins. Estas podem ter sido formados durante o história passada da enzima durante a preparação e armazenagem devido a uma série de reacções secundárias, tais como a desamidação de um ou dois resíduos de asparagina ou glutamina, ou a proteólise limitada de intercâmbio de dissulfureto. Alternativamente, pode ser devido ao equilíbrio de estrutura quaternária ou a presença de variantes genéticas distintas. Em qualquer caso, a maior variabilidade ainda mais evidente será a cinética de inactivação do tipo série. O efeito prático disto é que geralmente k d1 é aparentemente muito maior que k d2 e A 1 é menor que a unidade. A fim de minimizar a perda de actividade em armazenamento, mesmo temperaturas moderadas devem ser evitados. A maioria das enzimas são estáveis durante meses, se refrigerado (0 - 4C). Arrefecimento abaixo de 0 ° C, na presença de aditivos (por exemplo, glicerol), que evitar o congelamento, em geral, pode aumentar esta estabilidade de armazenamento ainda mais. Soluções enzimáticas de congelamento é melhor evitar, uma vez que muitas vezes provoca desnaturação devido ao estresse e pH variação causada pela formação de gelo cristal. As constantes de primeira ordem de desactivação são muitas vezes significativamente menor no caso de enzima-substrato, enzima-inibidor e complexos enzima-produtos que ajuda a explicar os efeitos estabilizadores substanciais de ligandos adequados, especialmente a concentrações onde existe pouco enzima livre (por exemplo, [S] >> K m ). Outros factores, tais como a presença de anti-oxidantes de tiol, pode melhorar a estabilidade térmica, em casos particulares. Verificou-se que a desnaturação pelo calor de enzimas é essencialmente devido às interacções das proteínas com o ambiente aquoso. Eles são geralmente mais estáveis no concentrado, em vez de diluir, soluções. Em um estado predominantemente seco ou desidratado, eles permanecem ativos por períodos consideráveis, mesmo em temperaturas acima de 100C. Esta propriedade tem uma grande importância tecnológica e está sendo explorada pelo uso de solventes orgânicos (ver Capítulo 7 ). As alterações de pressão também afetará as reações catalisadas enzima. Claramente qualquer reação envolvendo gases dissolvidos (por exemplo Oxigenases e descarboxilases) serão particularmente afectados pelo aumento da solubilidade do gás
  29. 29. 29 em altas pressões. A posição de equilíbrio da reacção também será deslocado devido a qualquer diferença nos volumes molares entre os reagentes e produtos.No entanto, um, se bastante pequena, a influência adicional é devido às mudanças de volume que ocorrem durante enzimática de ligação e catálise. Algumas misturas de enzimas- reagentes podem sofrer reduções no volume, no montante de até 50 ml toupeira - 1 durante a reação devido a restrições de conformação e as mudanças na sua hidratação. Este, por sua vez, pode conduzir a uma duplicação da kcat , e / ou uma redução para metade na K m para um aumento de 1000 vezes na pressão. Os efeitos relativos em k cat e K m depender das variações de volume e de ligação relativa durante a formação dos estados de transição da reacção. Reacções reversíveis Uma reacção enzimática reversível (por exemplo, a conversão de glicose em frutose, catalizada pela isomerase da glucose) pode ser representado pelo seguinte esquema de reacção onde a atravessa os estágios reversíveis de enzima-substrato (ES) a formação do complexo, a conversão enzima-produto (EP ) complexo e, finalmente, a dessorção do produto. Nenhuma etapa de controlo de taxa está completamente. [1.12] Os pares de equações simétricas podem ser obtidas pela alteração na concentração dos intermediários com o tempo: (1,36) (1,37) Assumindo que não há nenhuma desnaturação, a concentração total de enzima deve permanecer constante e: (1.38a) portanto: (1.38b) coleta de termos [ES]
  30. 30. 30 (1.39a) (1.39b) e, (1.38c) agrupando termos [EP] (1.40a) (1.40b) Sob condições semelhantes às discutidas anteriormente para o mecanismo de Michaelis-Menten (por exemplo, sob as premissas de estado estacionário quando ambos d [ES] / dt e d [EP] / dt é zero, ou mais exactamente quando (1,41) e (1,42) são ambas verdadeiras. As seguintes equações podem ser derivados a partir da equação 1.39b utilizando a aproximação, dada por equações 1,41 e termos colectores. (1.43a) (1.43b)
  31. 31. 31 (1.43c) Além disso, as seguintes equações (simétricas ao acima) pode ser derivada a partir da equação 1.40butilizando a aproximação, dada pela equação de 1,42 , e recolhendo termos. (1.44a) (1.44b) (1.44c) Substituindo [ES] da equação 1.44c na equação 1.43a (1.43d) (1.43E) (1. 43f) Removendo condições idênticas a partir de ambos os lados da equação: (1,43 g) Juntando todos os termos [EP]: (1.43h) (1.43i)
  32. 32. 32 Além disso, a substituição de [EP] a partir da equação 1.43c na equação 1.44a (1.44d) (1.44e) ( 1.44f) Removendo condições idênticas a partir de ambos os lados da equação: ( 1,44 g) Juntando todos os termos [ES]: (1.44h) (1.44i) A taxa de líquido de reacção (isto é. Taxa à qual o substrato é convertido no produto menos a taxa à qual o produto é convertido ao substrato) pode ser denotado por v onde, (1,45) Substituindo a partir de equações 1.43i e 1.44i (1.46a) Simplificando:
  33. 33. 33 (1.46b) Portanto, (1,47) onde: (1,48) (1,49) (1,50) (1,51) Em equilíbrio: (1,52) e, porque o numerador da equação de 1,47 deve ser igual a zero, (1,53) onde [S] e [P] são as concentrações no equilíbrio do substrato e produto (em tempo infinito). Mas, por definição, (1,54) Substituindo a partir da equação 1.53
  34. 34. 34 (1,55) Este é o Haldane relação. Portanto: (1,56) Se K m S e K m P são aproximadamente iguais (por exemplo, a isomerase comercial imobilizada glicose, Sweetase, tem K m (glucose) de 840 mm e K m (frutose) de 830 mM a 70 ° C), e notando que o total quantidade de substrato e produto em qualquer altura, deve ser igual à soma do substrato e do produto no início da reacção: (1,57) Portanto: (1,58) Portanto: (1,59) onde: (1,60) K 'não é um verdadeiro constante cinética, uma vez que só é constante se o substrato inicial, bem como a concentração do produto é mantido constante. Além disso, (1,61)
  35. 35. 35 Substituindo na equação 1,54 , (1,62) Deixe [S # ] igualar a diferença de concentração entre a concentração real de substrato e a concentração de equilíbrio. (1,63) Portanto: (1,64) Substituindo na equação 1.47 (1,65) Reorganizando a equação 1.55 , (1.66) Portanto: (1,67) Portanto: (1,68) Onde
  36. 36. 36 (1,69) Portanto: (1,70) Portanto: (1,71) e: (1,72) Tal como no caso de K 'na equação 1.59 , K não é um verdadeiro constante cinética, uma vez que varia com [S] e, por conseguinte, a soma de [S] 0 e [P] 0 . É apenas se constante a concentração de substrato inicial mais produto é mantido constante. Por um argumento semelhante, mas simétrica, a taxa líquida de reação inversa, (1,73) com constantes definidas como anteriormente, mas por simetricamente troca de K m P com K m S , V e r com V f . Ambas as equações ( 1.59 ) e ( 1.68 ) são úteis na modelagem de reações reversíveis, particularmente a reação tecnologicamente importante catalizada pela isomerase glucose. Eles podem ser mais desenvolvidas para dar estimativas de tempo de produtividade e para uso na comparação de diferentes configurações de reatores (ver capítulos 3 e 5 ). Embora nunca uma enzima pode alterar a posição de equilíbrio de uma reacção catalisada, pois não tem qualquer efeito sobre o padrão de variação de energia livre envolvidos, que podem favorecer a reacção numa direcção, em vez de o seu inverso. Ele consegue isso por apenas obrigatório o produto (s) fracamente da ligação forte, como complexos enzima-reagente, os reagentes nesta direção preferencial, mas. A enzima está ligada com o reagente (s), favorecendo a sua reacção, deixando
  37. 37. 37 pouco livre para catalisar a reacção no sentido inverso. É pouco provável, portanto, que a mesma preparação de enzima seria óptimo para catalisar uma reacção reversível em ambas as direcções. A inibição de enzimas Um certo número de substâncias podem causar uma redução da taxa de reacção catalisada por uma enzima. Alguns destes (por exemplo, ureia) desnaturantes de proteínas não-específicos. Outros, que actuam geralmente de forma bastante específica, são conhecidos como inibidores. A perda de actividade pode ser reversível, em que a actividade pode ser restabelecida por remoção do inibidor, ou irreversível, que a perda de actividade é dependente do tempo e não pode ser recuperado durante a escala temporal de interesse. Se a enzima inibida é totalmente inactivo, a inibição irreversível comporta-se como uma perda dependente do tempo da concentração de enzima (isto é. Baixa V max ), em outros casos, envolvendo inactivação incompleta, pode haver alterações dependentes do tempo em ambos K m e V max .Íons de metais pesados (por exemplo, mercúrio e chumbo) geralmente deve ser impedido de entrar em contato com as enzimas como eles costumam causar tal inibição irreversível através da ligação forte com a estrutura de aminoácidos. Mais importante para a maioria dos processos catalisados por enzimas é o efeito de inibidores reversíveis.Estes são geralmente discutidos em termos de uma extensão simples para o esquema de reacção de Michaelis-Menten. [1.13] em que I representa o inibidor reversível e o inibidor (dissociação) Constantes de K i e K i são dadas por ' (1,74) e, (1,75)
  38. 38. 38 Para os presentes fins, presume-se que nem E eu nem ES I pode reagir para formar o produto. Equilíbrio entre E I e ES I é permitido, mas não faz nenhuma contribuição líquida para a equação da taxa de como deve ser equivalente ao equilíbrio estabelecido por meio de: [1.14] A ligação de inibidores pode mudar com o pH da solução, conforme discutido anteriormente para o substrato de ligação, e resultar na variação independente de ambos K i e K i 'com o pH. A fim de simplificar a análise substancialmente, é necessário que a taxa de formação de produto (k 2 ) é lento em relação ao estabelecimento do equilíbrio entre as espécies. Portanto: (1,76) também: (1,77) onde: (1,78) portanto: (1,79) Substituindo a partir das equações (1.74), (1.75) e (1,76), seguido por simplificação, dá: (1,80) portanto:
  39. 39. 39 (1,81) Se a concentração total de enzima é muito menos do que a concentração total de inibidor (isto é, [E] 0 << [I ] 0 ), em seguida: (1,82) Esta é a equação utilizada geralmente para a inibição mista envolvendo tanto E I e ES I complexos (Figura 1.8a ). Um número de processos simplificados existir. A inibição competitiva K i "é muito maior do que a concentração total de inibidor e o ES eu complexo não é formado. Isto ocorre quando tanto o substrato e inibidor competem para a ligação ao local activo da enzima. A inibição é mais perceptível a baixas concentrações de substrato, mas pode ser superada em concentrações suficientemente elevadas de substrato como o V max permanece não afectada ( Figura 1.8b ). A equação de taxa é dada por: (1,83) em que K m app é a aparente K m para a reacção, e é dada por: (1,84) Normalmente, o inibidor competitivo tem alguma semelhança estrutural com o substrato, e muitas vezes é um produto da reacção ( inibição do produto , por exemplo, inibição de lactase por galactose), que podem causar uma perda substancial de produtividade quando são requeridos elevados graus de conversão. A equação de velocidade para a inibição produto é obtido a partir das equações (1,83) e (1,84). (1,85)
  40. 40. 40 Um efeito similar é observado com substratos concorrentes, bastante situação comum em conversões industriais, e especialmente relevante para hidrólises macromoleculares onde um número de diferentes substratos podem coexistir, todos com diferentes parâmetros cinéticos. A reação envolvendo dois co-substratos pode ser modelado pelo regime. [1.15] Ambos os substratos competem para o mesmo sítio catalítico e, por conseguinte, a sua ligação é mutuamente exclusivas e que se comportam como inibidores competitivos das reacções uns dos outros.Se as taxas de formação de produto são muito mais lenta do que a obtenção de equilíbrio (isto é, k 2 e k 4são muito menos do que k -1 k e -3 , respectivamente), a taxa de formação de P 1 é dada por : (1,86) e a taxa de formação de P 2 é dada pela (1,87) Se as concentrações de substrato são pequenos em relação aos seus K m valores: (1,88) Portanto, em uma situação competitiva usando o mesmo enzima e com ambos os substratos na mesma concentração: (1,89)
  41. 41. 41 onde e > neste caso simplificado. As taxas relativas de reacção estão na razão das constantes de especificidade. Se ambas as reacções produzem o mesmo produto (por exemplo, algumas hidrólises): (1,90) portanto: (1,91) Inibição não competitiva K i é muito maior do que a concentração total de inibidor e o complexo EI não é formado. Isto ocorre quando o inibidor se liga a um sítio que só se torna disponível após o substrato (S 1 ) foi ligado ao sítio activo da enzima. Esta inibição é mais comumente encontrados em reacções de multi-substrato, onde o inibidor é competitivo em relação a um substrato (por exemplo, S 2 ), mas não competitiva em relação ao outro (por exemplo, S 1 ), em que o esquema de reacção pode ser representada pela [1.16] A inibição é mais notável em concentrações elevadas de substrato (ou seja, S 1 no esquema acima) e não pode ser ultrapassado tanto como o V max e de K m são igualmente reduzidos ( Figura 1.8c ). A equação da taxa é: (1,92) onde V max app e K m app são a V aparente max e K m dada por: (1,93) e
  42. 42. 42 (1,94) Neste caso, a constante de especificidade não é afectada pela inibição. Normalmente, o inibidor não competitivo também tem alguma semelhança estrutural com um dos substratos e, novamente, é muitas vezes um produto de reacção. . Figura 1.8 . Um diagrama esquemático que mostra o efeito de inibidores reversíveis da velocidade de reacções catalisadas por enzimas nenhuma inibição, (a) a inibição mista ([I] = K i = 0,5 K i '); inferior V max app (= 0,67 V max ), maior K m app (K = 2 m ). (B) a inibição competitiva ([I] = K i ); V max app inalterada (= Vmax ), maior K m app (K = 2 m ). (C) inibição não competitiva ([I] = K i '); inferior V max app (= 0,5 V max ) e Km app (K = 0,5 m ). (D) inibição não competitiva ([I] = K i = K i '); inferior V max app (= 0,5 V max ), inalterada Km app (= K m ). Um caso especial de inibição não competitiva é inibição pelo substrato que ocorre em concentrações elevadas de substrato de cerca de 20% de todas as enzimas conhecidas (por exemplo, invertase é inibida por sacarose). Ela é causada principalmente por ligação mais do que uma molécula de substrato para um local activo destinado a apenas um, frequentemente por diferentes partes das moléculas de substrato que se ligam a diferentes sublocais dentro do local de ligação ao substrato. Se o complexo resultante é inactiva neste tipo de inibição provoca uma redução na velocidade da reacção, em concentrações elevadas de substrato. Ele pode ser modelada pela seguinte esquema
  43. 43. 43 [1.17] onde: (1,95) A suposição é feita que ESS não pode reagir para formar o produto. Segue-se a partir da equação ( 1.82 ) que: (1,96) Mesmo os valores bastante elevados para K S levam a uma estabilização da taxa de reação em concentrações elevadas de substrato, e menores K S valores causar uma inibição substancial ( Figura 1.9).
  44. 44. 44 Figura 1.9. O efeito de inibição pelo substrato na taxa de uma reacção catalisada por enzima. Uma comparação é feita entre a inibição causada pelo aumento K S relativamente a K m . nenhuma inibição, KS / K m >> 100; K S / K m = 100; K S / K m = 10 ; K S / K m = 1. Pela natureza da ligação fazendo com que esta inibição, que é pouco provável que K S / K m <1. Inibição não-competitiva Ambos os complexos e EI ESI são formadas igualmente bem (ou seja, K i é igual a K i '). Isto ocorre quando o inibidor se liga a um local afastado do local de ligação ao substrato, causando uma redução da taxa catalítica. É muito raramente encontrada como um caso especial de inibição mista. A inibição fraccionada é idêntico em todas as concentrações de substrato e não pode ser superada pelo aumento da concentração do substrato, devido à redução em V max ( Figura 1.8d ). A equação de taxa é dada por: (1,97) onde V max app é dada por: (1,98) A diminuição na velocidade de reacção com o pH, descrito anteriormente, pode ser considerado como um caso especial de inibição não-competitiva; o inibidor ser o ião hidrogénio no lado ácido da óptimo ou o ião hidróxido no lado alcalino. Determinação da V max e K m É importante ter um conhecimento tão completa quanto possível das características de desempenho das enzimas, se eles são para ser utilizados mais eficientemente. A cinética parâmetros V max , K m , k cat / Km deve, portanto, ser determinado. Existem duas abordagens para este problema usando a curva de progresso da reacção (método integral) ou se as velocidades iniciais de reacção (método diferencial). Uso de qualquer um dos métodos depende do conhecimento prévio do mecanismo para a reacção e, pelo menos aproximadamente, as condições óptimas para a reacção. Se o mecanismo é conhecido e complexo, em seguida, os dados devem ser reconciliados com o modelo adequado (hipótese), geralmente por uso de uma análise computer-aided envolvendo um ponderados mínimos quadrados. Muitos desses programas de computador estão disponíveis no momento e, se não, a habilidade de programação envolvida é geralmente
  45. 45. 45 bastante baixo. Se o mecanismo não é conhecido, as tentativas iniciais são geralmente feitos para ajustar os dados para o modelo de cinética de Michaelis- Menten. Combinando as equações ( 1.1 ) e ( 1.8 ), (1.99) que, na integração, usando a condição de contorno que o produto está ausente no tempo zero e substituindo [S] por ([S] 0 - [P]), se torna (1.100) Se a conversão fraccionada ( X ) é introduzida, onde (1.101) então a equação (1.100) pode ser simplificada para dar: (1.102) A utilização da equação ( 1.99 ) envolve a determinação da taxa inicial de reacção sobre uma ampla gama de concentrações de substrato. As taxas iniciais são utilizados, de modo que [S] = [S] 0 , a predeterminada e conhecida com precisão a concentração do substrato no início da reacção. A sua utilização também assegura que não há nenhum efeito de reversibilidade da reacção ou inibição produto que pode afectar o método integral com base na equação ( 1.102 ). A equação ( 1.99 ) pode ser utilizado directamente, utilizando um programa de computador, que envolve um dos mínimos quadrados ponderados encaixar, onde os parâmetros para determinar a relação hiperbólica entre a velocidade inicial da reacção e da concentração inicial de substrato (isto é. de K m e V max ) são escolhidos a fim de minimizar os erros entre os dados e o modelo, e é feita a suposição que os erros inerentes aos dados praticamente determinadas são normalmente distribuídas em torno do seu valor médio (livre de erros). Em alternativa, o enredo linear direta pode ser usado ( Figura 1.10 ). Este é um método estatístico não paramétrico poderoso que depende da suposição de que quaisquer erros nos dados experimentalmente derivados são tão propensos a ser positivo (ou seja, muito alta) como negativo (ou seja, muito baixo). É prática comum para mostrar os dados obtidos pelos métodos estatísticos acima num dos três lotes linearizadas, derivadas a partir da equação ( 1.99 ) ( Figura 1.11 ). Destes, o lote duplo recíproco é o
  46. 46. 46 preferido para testar a correção qualitativa de um mecanismo proposto, eo enredo Eadie-Hofstee é o preferido para a descoberta de desvios de linearidade. Figura 1.10. O enredo linear direta. Um gráfico da taxa inicial da reacção em função da concentração inicial de substrato, também mostra a maneira como as estimativas podem ser feitas directamente do K me V max . Cada par de pontos de dados pode ser utilizada para fornecer uma estimativa independente destes parâmetros (ou seja, n (n-1) / 2 estimativas de pontos de dados com n diferindo [S] 0 ). Estas estimativas são determinadas a partir das interseções das linhas que passam pelos pontos (x, y) (- [S] 0 , 0) e (0 v,); cada intersecção formando uma estimativa separada do K m e V max . Os cruzamentos são classificados separadamente, a fim de valor de ambos K aumentando m e V max e os valores medianos tomadas como base as melhores estimativas para esses parâmetros. O erro nestas estimativas podem ser simplesmente determinadas a partir de sub-intervalos de estas estimativas, a largura da sub-gama depende da precisão necessária para o erro e o número de pontos de dados na análise. Neste exemplo, existem sete pontos de dados e, portanto, 21 Estimativas para ambos K m e V max . A lista de classificação das estimativas para K m (MM) é 0.98,1.65, 1,68, 1,70, 1,85, 1,87, 1,89, 1,91, 1,94, 1,96, 1,98 , 1,99, 2,03, 2,06, 1,12, 2,16, 2,21, 2,25, 2,38 , 2,40, 2,81, com um valor médio de 1,98 mM. O K m deve estar entre as 4 (1,70 mM) e 18 (2,25 mM) estimativa em um nível de confiança de 97% (Cornish- Bowden et al. , 1978).A lista das estimativas para V max (  m.min -1 ) é classificada separadamente como 3,45, 3,59, 3,80, 3,85, 3,87, 3,89, 3,91, 3,94, 3,96, 3,96, 3,98 , 4,01, 4,03, 4,05, 4,13, 4,14, 4,18, 4,26, 4,29, 4,35, com um valor médio de
  47. 47. 47 3,98  m.min -1 . O V max deve estar entre as 4 (3,85  m.min -1 ) e 18 (4,18  m.min -1 ) estimativa em um nível de confiança de 97%. Pode ser visto que as estimativas periféricas têm pouca ou nenhuma influência sobre os resultados. Esta é uma grande vantagem sobre os procedimentos estatísticos menos quadrados, onde os pontos de dados falsos causam efeitos fortemente tendenciosas. Figura 1.11. Três formas em que a relação hiperbólica entre a velocidade inicial da reacção e da concentração de substrato inicial podem ser reorganizadas para dar parcelas lineares. Os exemplos são desenhados usando K m = 2 mM e V max = 4 M min -1 . (A) Lineweaver-Burk (double-recíproca) lote de 1 / v contra 1 / [S] 0 dando intercepta em 1 / V max e -1 / Km (1.103) (B) Eadie-Hofstee lote de v contra v / [S] 0 dando intercepta na V max e V max / K m
  48. 48. 48 (1.104) c) Hanes-Woolf () lote de meio recíproca de [S] 0 / v contra [S] 0 intercepta dando a K m / V max e K m . (1,105)
  49. 49. 49 A curva de progresso da reacção ( Figura 1.12 ) pode ser usado para determinar a constante de especificidade (k cat / K m ), fazendo uso da relação entre o tempo de reacção e conversão fraccionada (ver equação ( 1.102 ). Isto tem a vantagem sobre a utilização das taxas iniciais (acima) em que há menos determinações precisam de ser feito, possivelmente apenas uma curva de progresso é necessária, e por vezes a velocidade inicial da reacção é bastante difícil de determinar devido à sua rápida descida. Se apenas a parte inicial de a curva do progresso, ou um seu derivado, é utilizado na análise, este procedimento pode ser utilizado mesmo em casos em que há inibição competitiva pelo produto, ou em que a reacção é reversível.
  50. 50. 50 Figura 1.12. Um gráfico esquemático que mostra a quantidade de produto formado (produtividade) contra o tempo de reacção, num sistema fechado. A constante de especificidade pode ser determinada por um ajuste ponderada menos ao quadrado dos dados para a relação dada pela equação (1.102). O tipo de inibição e as constantes de inibição pode ser determinada a partir do efeito de diferentes concentrações de inibidor sobre a aparente K m , V max e k cat / K m , embora algumas parcelas mais especializados não existem (por exemplo, Cornish-Bowden, 1974 ). Resumo e Bibliografia do Capítulo 1 a. Enzimas são catalisadores específicos de vasto alcance e utilidade. b. A sua actividade é regulada pela sua estrutura e do ambiente físico. c. Cuidados devem ser tomados em relação à interpretação de unidades reportados de atividade enzimática e as condições necessárias para a máxima produtividade. d. As enzimas podem perder a sua atividade catalítica reversível ou irreversivelmente devido a desnaturação ou inibição, dependente das condições e. Os valores de K m , V max , constantes de especificidade, o pH óptimo e a velocidade de desnaturação térmica são todos de importância e utilidade para enzima tecnologia Referências e Bibliografia 1. Bender, ML, Kezdy, JF & Gunter, CR (1964). A anatomia de uma catálise enzimática: . quimotripsina Journal of the American Chemical Society , 86 , 3714-21.
  51. 51. 51 2. Chaplin, MF (1986). Estrutura da proteína e a actividade da enzima . Oxford, UK: IRL Press Ltd. (Este é um pacote de software CAL / simulação adequado para IBM ou da BBC micocomputers) 3. Cornish-Bowden, A. (1974). Um método gráfico simples para determinar as constantes de inibição de inibidores mistos, não competitivas e não- competitivas. Biochemical Journal , 137 , 143-4. 4. Cornish-Bowden, A. (1976). Os princípios da cinética da enzima . London: Butterworth. 5. Cornish-Bowden, A. & Endrenyi, L. (1986). Regressão robusta de dados cinéticos da enzima.Biochemical Journal , 234 , 21-9. 6. Cornish-Bowden, A., Porter, WR & Trager, WF (1978). Avaliação dos limites de confiança de distribuição gratuita para os parâmetros cinéticos da enzima. Journal of Theoretical Biology , 74 , 163-75. 7. Crompton, IE & Waley, SG (1986). A determinação das constantes de especificidade em reacções catalisadas por enzimas. Biochemical Journal , 239 , 221-4.Eisenthal, R. & Cornish-Bowden, A. (1974). O enredo linear direta. Biochemical Journal , 139 , 715-20. 8. Fersht, A. (1985). A enzima e estrutura mecanismo , 2a ed, Nova Iorque: WHFreeman & Co.Henderson, PJF (1978). A análise estatística dos dados cinéticos da enzima. Techniques nas ciências da vida, Bioquímica vol. B1 / 11, Técnicas em proteínas e enzimas bioquímica - parte 2. pp B113 / 1-41, Amsterdam: Elsevier / North-Holland Biomedical Press. 9. Henley, JP & Sadana, A. (1985). Categorização de desativações de enzimas que utilizam um mecanismo do tipo série. Enzyme e Microbial Tecnologia , 7 , 50-60. 10.Hill, CM, Waight RD & Bardsley, WG (1977). Será que qualquer enzima seguir a equação de Michaelis-Menten? Molecular e Cellullar Biochemistry , 15 , 173-8. 11.Koshland, DE Jr. (1962). A comparação das velocidades de reação não enzimáticas e enzimáticos.Journal of Theoretical Biology , 2 , 75-86. 12.Michaelis, L. & Menten, ML (1913). A cinética da ação invertin. Biochemische Zeitschrift , 49 , 333-69. Fontes de enzimas Biologicamente enzimas activas podem ser extraídos a partir de qualquer organismo vivo. Uma ampla gama de fontes são usadas para a produção de enzima comercial de Actinoplanes para Zymomonas , do espinafre para veneno de cobra. Dos cem ou mais enzimas sendo usado industrialmente, mais de metade são de fungos e leveduras e mais de um terço são de bactérias com o restante dividido entre animais (8%) e planta (4%) fontes ( Tabela 2.1 ). Uma muito maior número de enzimas podem ser utilizados na análise química e diagnóstico clínico. As fontes não microbianas proporcionar uma proporção maior destas, no momento presente. Os micróbios são preferidos para plantas e animais, como fontes de enzimas, porque: 1. eles são geralmente mais baratos de produzir.
  52. 52. 52 2. seu conteúdo de enzimas são mais previsíveis e controláveis, 3. fornecimento regular de matéria-prima de composição constante são mais facilmente arranjado, e 4. tecidos vegetais e animais contêm materiais mais nocivos do que os micróbios, incluindo phecompostos nolic (de plantas), inibidores de enzimas endógenas e proteases. Estão sendo feitas tentativas para superar algumas destas dificuldades com o uso de cultura de células animais e vegetais. Tabela 2.1 . Algumas enzimas industriais importantes e suas fontes. Enzyme um Número CEb Fonte Intra / extra CELULARESc Escala de produção d Utilização industrial Enzimas de Animais Catalase 1.11.1.6 Fígado Eu - Comida Chymotrypsin 3.4.21.1 Pâncreas E - Couro Lipase e 3.1.1.3 Pâncreas E - Comida Coalho f 3.4.23.4 Abomaso E + Queijo Tripsina 3.4.21.4 Pâncreas E - Couro Enzimas de plantas Actinidin 3.4.22.14 Kiwis E - Comida amilase 3.2.1.1 Cevada maltada E +++ Preparação -amilase 3.2.1.2 Cevada maltada E +++ Preparação Bromelina 3.4.22.4 Latex Pineapple E - Preparação -glucanase g 3.2.1.6 Cevada maltada E ++ Preparação Ficina 3.4.22.3 Latex Fig E - Comida Lipoxigenase 1.13.11.12 Soja Eu - Comida Papaína 3.4.22.2 Latex Mamão E ++ Carne Enzimas bacterianas amilase 3.2.1.1 Bacilo E +++ Amido -amilase 3.2.1.2 Bacilo E + Amido Asparaginase 3.5.1.1 Escherichia coli Eu - Saúde A glicose isomerase h 5.3.1.5 Bacilo Eu ++ Xarope de frutose A penicilina amidase 3.5.1.11 Bacilo Eu - Farmacêutico Proteasei 3.4.21.14 Bacilo E +++ Detergent Pullulanasej 3.2.1.41 Klebsiella E - Amido Fungal enzymes
  53. 53. 53 amilase 3.2.1.1 Aspergillus E ++ Baking Aminoacylase 3.5.1.14 Aspergillus Eu - Farmacêutico Glucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus E +++ Amido Catalase 1.11.1.6 Aspergillus Eu - Comida Cellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - Waste Dextranase 3.2.1.11 Penicillium E - Comida Glucose oxidase 1.1.3.4 Aspergillus Eu - Comida Lactasel 3.2.1.23 Aspergillus E - Dairy Lipase e 3.1.1.3 Rhizopus E - Comida Rennetm 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ Queijo Pectinasen 3.2.1.15 Aspergillus E ++ Drinks Pectin lyase 4.2.2.10 Aspergillus E - Drinks Proteasem 3.4.23.6 Aspergillus E + Baking Raffinaseo 3.2.1.22 Mortierella Eu - Comida Yeast enzymes Invertasep 3.2.1.26 Saccharomyces I/E - Confectionery Lactasel 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E - Dairy Lipase e 3.1.1.3 Candida E - Comida Raffinaseo 3.2.1.22 Saccharomyces Eu - Comida a Os nomesde usocomum são dadas.Comoa maioriadasenzimasindustriaissãoconstituídospormisturasde enzimas,estesnomespodemvariarem relaçãoaosnomesrecomendadosde seucomponenteprincipal.Sempreque necessário,osnomesrecomendadosdestecomponente principalé dadoabaixo. B, o númeroCE do componente principal. c I - enzimaintracelular;E- enzimaextracelular. d +++> 100 ton ano-1; ++> 10 ton ano-1;+> 1 ton ano-1;- <1 ton ano-1. e triacilglicerol lipase; f quimosina;
  54. 54. 54 g endo-1,3(4) -b-glucanase; h xilose isomerase; i subtilisina; j-dextrinaumaendo-1,6-a-glucosidase; k 1,4-glucanoum-glicosidase; l b-galactosidase; m proteinase aspárticamicrobiana; n poligalacturonase; o a-galactosidase; p b-frutofuranosidase. Na prática,a grande maioriadasenzimasmicrobianasvirde umnúmeromuitolimitadode géneros,espéciesde Aspergillus,que asespéciesde Bacilluse Kluyveromyces(tambémchamadoSaccharomyces) espéciespredominantes. A maioriadasestirpesutilizadas,quertenhamsidoempregadaspelaindústriade alimentospormuitosanosouque tenhamsidoderivadosdessascepaspormutaçãoe seleção.Existemmuitopoucosexemplosdautilizaçãoindustrialde enzimasque têmsidodesenvolvidosparaumatarefa.Brilhantesexemplosde taisempreendimentossãoa produção de xarope de alta frutose utilizandoisomerase glucose e àutilizaçãode pullulanasenahidrólisedoamido. Os produtoresde enzimasindustriaise seusclientesirãocompartilharosobjetivoscomunsdaeconomia,eficáciae segurança.Elesvãoquererter estirpesde altorendimentode micróbiosque fazemaenzimaconstitutivae segregam- loem seumeiode crescimento(enzimasextracelulares).Se aenzimanãoé produzidaconstitutivamente,de indução temde serrápidae barata. Produtoresprocuraráutilizarcepasde micróbioque sãoconhecidosporseremgeralmente
  55. 55. 55 seguro.Osusuáriosvãopagar poucoemconta a maneiraemque a enzimaé produzida,masvai insistiremter preparaçõesque têmumaactividade conhecidae manteressaatividadeporlongosperíodos,armazenadosà temperaturaambiente oucomrefrigeraçãode rotina.Elesdãopoucaatençãopara a pureza da preparaçãode enzima, desde que ele nãocontémmateriais(ouenzimas) que nãointerfiramcomoseuprocesso.Osprodutorese os usuários vão quererteras enzimasemformasque apresentamumriscomínimopara aquelesque manipulam-losouconsumir seuproduto. O desenvolvimentode enzimascomerciaisé umaempresaespecializadaque é geralmenterealizadaporumpunhado de empresasque têmaltashabilidadesem o rastreiode enzimasnovase melhoradas, de fermentaçãoparaa produçãoda enzima, purificaçõesgrandesenzimaescala, formulaçãode enzimasparavenda, ligaçãodo cliente,e lidandocomas autoridadesreguladoras. Triagem para novas enzimas Se a reacção é termodinamicamente possível, é provável que exista uma enzima que é capaz de catalisar ele. Uma das principais habilidades de empresas de enzimas e laboratórios acadêmicos devidamente financiados é a triagem rápida e eficaz em termos de custos de culturas microbianas para atividades enzimáticas. Amostras naturais, geralmente solo ou material de composto encontrado perto altas concentrações de substratos susceptíveis, são usados como fontes de culturas. Não é incomum em congressos internacionais de tecnólogos de enzimas para ver representantes de empresas de enzimas coletando amostras de solo a ser exibido mais tarde, quando eles retornam para seus laboratórios. A primeira fase do processo de triagem para as enzimas comerciais é o despiste de ideias, isto é, para determinar a necessidade comercial potencial para uma nova enzima, para estimar a dimensão do mercado e decidir, aproximadamente, a quantidade de potenciais utilizadores do enzima será capaz para dar ao luxo de pagar por isso. Em alguns casos, a determinação do valor potencial de uma enzima não é fácil, por exemplo, quando pode ser utilizado para produzir uma substância totalmente inovadora. Em outros casos, por exemplo quando a nova enzima poderia ser usado para melhorar um processo existente, o seu valor potencial podem ser avaliadas em
  56. 56. 56 termos de forma muito precisa. Em ambos os casos, um fluxo de caixa acumulado deve ser estimado, equilibrando a triagem e de capitais de investimento custos iniciais incluindo juros, responsabilidade fiscal e depreciação, contra os lucros esperados a longo prazo.Conta total deve ser feita de inflação, da variação de preço de matéria- prima e fonte, publicidade e outros custos projetados. Além disso, a probabilidade de concorrência de mercado potencial e as mudanças nos fatores políticos ou legais devem ser considerados. Normalmente, a sensibilidade do projecto para mudanças em todas estes factores devem ser estimado, por conjecturas informado, a fim de avaliar o factor de risco envolvido. Re-avaliação financeira deve ser frequentemente realizadas durante o processo de desenvolvimento para verificar se ele ainda constitui uma utilização eficiente dos recursos. Se o acordo for alcançado, provavelmente depois de discussões com potenciais utilizadores, que o trabalho experimental seria comercialmente justificável, a próxima etapa envolve a localização de uma fonte da enzima necessária. O trabalho do laboratório é caro em mão de obra de forma tão clara, vale a pena usar todas as bases de dados disponíveis para procurar menção da enzima na literatura acadêmica e patentes. As culturas podem então ser procurada de todas as fontes de modo reveladas. Algumas preparações de enzimas comerciais são fontes muito ricas de outros do que a enzima que está sendo oferecido para venda, revelando tais preparações como potenciais fontes de baixo custo que vale a pena investigar enzimas. Se essas primeiras pesquisas não forem bem sucedidos, é provável que seja necessário para triagem de novas estirpes de microrganismos capazes de realizar a transformação necessária. Isso não deve ser uma tela de "cega": normalmente haverá alguma fonte de micróbios que poderiam ter sido expostas por incontáveis gerações com as condições que a nova enzima deve suportar ou a produtos químicos que é obrigada a modificar. Assim, thermophiles são procurados em fontes termais, osmophiles em fábricas de açúcar, organismos capazes de metabolizar conservantes de madeira nos pátios de madeira e assim por diante. Um exemplo clássico de detecção de uma enzima por rastreio inteligente foi a descoberta de uma enzima degradadora de cianeto comercialmente útil nos micróbios patogénicos de plantas que contêm glicósidos cianogénicos. A identificação de uma fonte microbiana de uma enzima é de modo algum o fim da história. As propriedades da enzima deve ser determinada; ou seja, a temperatura óptima para a produtividade, o perfil de estabilidade da temperatura, pH óptimo e estabilidade, constantes cinéticas (K m , V max ), se houver substrato ou a inibição do produto, e a capacidade para resistir a componentes de matéria-prima esperado, além do substrato. Uma equipe de cientistas, engenheiros e contabilistas devem então considerar os próximos passos. Se qualquer um desses parâmetros é insatisfatório, a tela deve continuar até que as enzimas melhoradas estão localizados. Agora que a engenharia de proteínas (ver Capítulo 8) pode ser seriamente contemplada, uma enzima com valor potencial suficiente poderia ser melhorado "desde a concepção" para superar uma ou duas falhas. No entanto, isso levaria muito tempo, no nível atual de
  57. 57. 57 conhecimento e habilidade, de modo ainda mais a triagem de micróbios a partir de fontes selecionadas provavelmente seria considerado mais vantajoso. Uma vez que uma enzima com propriedades adequadas tenha sido localizada, várias decisões devem ser feitas em relação à aceitabilidade do organismo para as autoridades reguladoras, a produtividade do organismo, e o modo pelo qual a enzima é para ser isolado, utilizado (livre ou imobilizada) e, se necessário, purificado. Se o organismo é inaceitável do ponto de vista regulatório existem duas opções;para eliminar esse organismo completo e continuar a operação de crivação, ou para clonar a enzima num organismo aceitável. A última abordagem é cada vez mais atraente, especialmente como a clonagem também pode ser utilizado para aumentar a produtividade do processo de fermentação. A clonagem também pode ser atraente quando o organismo originalmente produzir a enzima é aceitável do ponto de vista da saúde e segurança, mas cuja produtividade é inaceitável (ver Capítulo 8). No entanto, ainda não é a clonagem de rotina e bem-sucedidos por isso ainda é uma excelente caso a ser feito por aplicação de técnicas de mutação e de isolamento convencionais para a selecção das estirpes melhoradas. Deve notar-se que, embora a tecnologia para a clonagem de isomerase de glucose em organismos de rotina '' é conhecido, que ainda não tenha sido aplicada. Várias das preparações isomerase de glicose utilizados comercialmente consistem de células inteiras, ou fragmentos de células, das estirpes seleccionadas de espécies detectada originalmente por despistagem. O uso de enzimas imobilizadas (ver Capítulo 3 ) já está familiarizado com a indústria e as suas vantagens são bem reconhecidos por isso a praticidade de usar as novas enzimas de forma imobilizado será determinada no início do procedimento de triagem. Se o enzima é produzido intracelularmente, a viabilidade do uso sem isolamento e purificação serão seriamente considerada e estirpes seleccionadas pela sua receptividade para usar neste modo. Ressalta-se que haverá um diálogo constante entre os cientistas de laboratório e engenheiros de processos bioquímicos desde as primeiras fases do processo de seleção. Uma vez que os engenheiros bioquímicos estão convencidos de que os seus critérios iniciais de produtividade, atividade e estabilidade podem ser cumpridas, a cepa selecionada (s) de micróbio serão cultivadas em condições de planta piloto.É somente através da aplicação do tipo de equipamento utilizado em plantas em escala real que precisa custeio de processos podem ser alcançados. Estudos-piloto provavelmente irá revelar as imperfeições, ou pelo menos as áreas de ignorância, que deve ser corrigido na escala de laboratório. Se isso for possível, a planta piloto irá produzir amostras da preparação de enzima a ser utilizada por clientes que pode muito bem ser também na fase de instalação piloto para o desenvolvimento do processo de utilização de enzima. A planta piloto enzima também produz amostras para estudos toxicológicos e de segurança, desde que o processo de piloto é exactamente similar ao da operação em grande escala.
  58. 58. 58 Triagem para novas enzimas é caro para que a propriedade intelectual gerados devem ser protegidos contra cópia pelos concorrentes. Isto é geralmente feito por patentear a enzima ou o seu método de produção ou, de forma mais útil, o processo no qual é para ser utilizado. Patenteamento será iniciada logo que há evidências de que uma descoberta inovadora foi feita. Mídia para a produção da enzima Descrição detalhada do desenvolvimento e utilização de fermentadores para o cultivo em grande escala de microrganismos para a produção da enzima está fora do âmbito deste volume, mas o uso de meios de comunicação menção é apropriado porque este tem uma influência sobre o custo da enzima e porque os componentes dos meios frequentemente encontrar seu caminho em preparações de enzimas comerciais.Detalhes de componentes utilizados em caldos de fermentação à escala industrial para a produção da enzima não são prontamente obtidos. Isso não é inesperado, pois os fabricantes não têm nenhum desejo de revelar informações que possam ser de valor técnico ou comercial para os seus concorrentes. Além disso, alguns componentes de suporte pode ser alterada de lote para lote quanto a disponibilidade e custo de, por exemplo, matérias-primas de hidrato de carbono alterado. Tais mudanças se revelam em diferenças muitas vezes bastante profundas na aparência de lote para lote de uma única enzima de um único produtor. Os efeitos das variações de matérias-primas deve ser considerado em relação ao tratamento a jusante. Se esta variabilidade é susceptível de reduzir significativamente a eficiência da metodologia padrão, pode ser económico utilizar um meio definido mais caros da composição facilmente reprodutível. Media claramente definidos geralmente estão fora de questão para o uso em larga escala por razões de custos, mas pode ser perfeitamente aceitável quando as enzimas são produzidas para fins de alto valor, tais como análise ou terapia médica onde preparações muito puras são essenciais. Meios complexos menos definidos são compostos de ingredientes seleccionados com base no custo e disponibilidade, bem como a composição. Os resíduos e subprodutos das indústrias alimentares e agrícolas são muitas vezes os principais ingredientes. Assim, melaço, licor de milho, destilados solúveis e farelo de trigo são importantes componentes de meios de fermentação que fornecem carboidratos, minerais, nitrogênio e algumas vitaminas. Hidratos de carbono extra é normalmente fornecido como amido, por vezes, refinado, mas muitas vezes simplesmente como grãos de cereais chão. Sais de farelo de soja e de amônio são frequentemente utilizadas fontes de nitrogênio adicional. A maior parte destes materiais variam em qualidade e composição de lote para lote, causando alterações na produtividade enzima. Preparação de enzimas
  59. 59. 59 Os leitores de trabalhos relacionados com a preparação de enzimas para fins de investigação estarão familiarizados com as tabelas que detalham as etapas de purificação. Muitas vezes, a enzima pode ser purificada a várias centenas de vezes mas o rendimento da enzima pode ser muito fraca, muitas vezes abaixo de 10% da actividade do material inicial ( Tabela 2.2 ). Em contraste, as enzimas industriais será purificado tão pouco quanto possível, as únicas outras enzimas e materiais que possam interferir com o processo a que a enzima é o de catalisar, vai ser removido. Purificação desnecessário será evitado como cada etapa adicional é dispendiosa em termos de equipamentos, mão de obra e perda de atividade enzimática. Como resultado, algumas preparações enzimáticas comerciais consistem essencialmente de caldo concentrado da fermentação, além de aditivos para estabilizar a actividade da enzima. Tabela 2.2 . O efeito do número de passos na produção e custos de um processo de purificação típico enzima. As hipóteses realistas são feitos que os rendimentos da etapa são de 75%, purificações passo são os custos de três vezes e step são 10% dos custos iniciais (mais tarde etapas de purificação geralmente são intrinsecamente mais caros, mas são necessariamente de menor escala). Passo Peso relativo Rendimento (%) A actividade específica Custo total Custo por peso Custo por atividade 1.000 100 1 1.00 1 1.00 1 0.250 75 3 1.10 4 1,47 2 0,063 56 9 1.20 19 2.13 3 0,016 42 27 1.30 83 3.08 4 0,004 32 81 1,40 358 4,92 5 0,001 24 243 1.50 1536 6,32 O teor de enzima necessária deve ser tão alta quanto possível (por exemplo, 10% w / w da proteína), a fim de facilitar a tarefa de processamento a jusante. Isto pode ser conseguido através do desenvolvimento das condições de fermentação ou, muitas vezes, mais dramaticamente, por engenharia genética. Pode muito bem ser economicamente viável para passar algum tempo clonagem cópias extras do gene necessário juntamente com um poderoso promotor de volta para o organismo produzir a fim de obter 'over-produtores "(ver Capítulo 8). É importante que a actividade máxima é retido durante a preparação de enzimas. Inactivação do enzima pode ser causada pelo calor, de proteólise, o pH sub- óptimo, oxidação, desnaturantes, inibidores irreversíveis e perda de cofactores ou coenzimas. Destes inactivação pelo calor, que, em conjunto com os efeitos de pH associados, é provavelmente a mais significativa. É provável que ocorra durante a extração e purificação da enzima se refrigeração insuficiente está disponível
  60. 60. 60 (ver Capítulo 1 ), mas o problema é menor quando se prepara enzimas termófilas. A proteólise é mais provável de ocorrer nas primeiras fases de extracção e purificação em que as proteases responsáveis para o volume de proteína em células vivas ainda estão presentes. É também a razão principal para a inactivação da enzima por contaminação microbiana. Nas suas conformações nativas, enzimas têm domínios altamente estruturadas, que são resistentes ao ataque por proteases, porque muitos dos ligações peptídicas são inacessíveis mecanicamente e porque muitas proteases são altamente específicos. As chances de uma ligação peptídica suscetíveis em um domínio estruturado estar disponível para o ataque protease são baixos. '' Entalhes individuais por proteases nestas circunstâncias podem ter pouco efeito imediato sobre a conformação da proteína e, por conseguinte, a actividade. O efeito, no entanto, podem reduzir severamente a estabilidade conformacional da enzima ao calor ou a variação do pH o que reduz grandemente a sua estabilidade operacional. Se o domínio é desdobrada sob estas condições alteradas, toda a cadeia de polipéptido pode estar disponível para a digestão enzimática e o mesmo, específico, a protease pode destruí- lo. É evidente que a melhor maneira de prevenir a proteólise é remover rapidamente, ou inibir, a atividade da protease. Antes isto pode ser conseguido é importante para manter as preparações enzimáticas frio para manter a sua conformação nativa e retardar qualquer acção de proteases que podem ocorrer. Algumas enzimas intracelulares são utilizados comercialmente, sem isolamento e purificação, mas a maioria das enzimas comerciais são produzidos extracelularmente pelo micróbio ou planta ou devem ser libertados a partir das células em solução e posteriormente tratados ( Figura 2.1 ). Separação sólido / líquido é geralmente necessário para a separação inicial da massa celular, a remoção de detritos celulares após a ruptura das células e a recolha dos precipitados. Isto pode ser conseguido por filtração, centrifugação ou partição bifásica aquosa. Em geral, a filtração e sistemas bifásicos aquosos são usadas para remover as células não desejadas ou detritos celulares enquanto que a centrifugação é o método preferido para a recolha de material sólido necessário. Figura 2.1. Diagrama de fluxo para a preparação de enzimas.
  61. 61. 61 Centrifugação A centrifugação separa com base no tamanho de partícula e a diferença de densidades entre as fases líquida e sólida. A sedimentação do material num campo centrífugo pode ser descrito pela (2,1) em que v é a taxa de sedimentação, d é o diâmetro da partícula, ρ s é a densidade da partícula, ρ l é a densidade da solução,  é a velocidade angular em radianos s -1 , r é o raio de rotação,  é a dinâmica viscosidade, F s é um fator de correção para a interação de partículas durante a colonização dificultado e é um fator de forma (= 1 para
  62. 62. 62 partículas esféricas). F s depende da fracção de volume dos sólidos presentes; aproximadamente igual a 1, 0,5, 0,1 e 0,05 para 1%, 3%, 12% e 20% de fracção de volume de sólidos, respectivamente. Apenas o material que chega a uma superfície, durante o escoamento através de centrífugas contínuas será removida da matéria-prima de centrifugação, a eficiência em função do tempo de residência no interior da centrifugadora e da distância necessária para a sedimentação (D). Este tempo de permanência será igual ao caudal volumétrico (  ), dividida pelo volume da centrífuga (V). O rendimento máximo de uma centrífuga para uso eficiente é dada por (2,2) A eficiência do processo é visto depender da fracção do volume de sólidos, a superfície eficaz de clarificação (V / D) e o factor de aceleraçÀ

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