1. Parásitos Protozoarios entéricos en ambientes acuáticos:
Métodos de concentración y detección
Walter Q. Betancourt 1 y Luis J. Querales2
1
PhD. Ciencias Marinas, Universidad del Sur de Florida, EEUU.
Investigador, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas
(IVIC), Venezuela. Dirección: IVIC, Centro de Microbiología y
Biología Celular. Laboratorio de Genética Molecular. Apartado
Postal: 20632. Caracas, Venezuela 1020A. e-mail:
wbetanco@ivic.ve
2
Estudiante Doctoral del Postgrado en Ciencias Biológicas,
Mención Microbiología. IVIC, Venezuela. e-mail: lquerale@ivic.ve
RESUMEN
La transmisión de parásitos protozoarios patógenos a través del
agua representa uno de los problemas de salud pública más
prominentes en el mundo entero. Los estudios sobre presencia de
parásitos protozoarios en aguas son fundamentales para conocer
a fondo la epidemiología de enfermedades que afectan a
poblaciones humanas en diferentes zonas geográficas. De esta
manera, se pueden implementar en todo el mundo las medidas de
salud pública que permitan el control y prevención de
enfermedades transmitidas a través del agua. Los métodos
corrientes para el monitoreo de Cryptosporidiumparvum, C.
hominis y Giardiaintestinalis son empleados para la detección de
Toxoplasma gondii y Cyclosporacayetanensis en ambientes
acuáticos. La combinación de nuevas técnicas de filtración y
concentración junto con los métodos moleculares y cultivo celular
forma parte de la estrategia científica dirigida a evaluar la
significancia de microorganismos patógenos actuales y
emergentes de interés para la salud pública. Este artículo revisa
avances recientes en métodos de concentración y detección de
protozoarios patógenos transmitidos a través del agua, cuya
aplicación reviste importancia en ambientes acuáticos de toda
América Latina, donde se requiere mayor investigación científica
en esta área.
PALABRAS CLAVE / Aguas / Concentración / Detección /
Métodos / Protozoarios /
La transmisión ambiental de microorganismos patógenos
constituye un medio altamente efectivo para la diseminación de
enfermedades a una gran proporción de la población. La
Organización Mundial de la Salud estima que un 24% de las
enfermedades que ocurren en el mundo están asociadas con
factores ambientales, entre ellos el agua de calidad insegura y
precarias condiciones higiénicas (WHO, 2007). Los cuerpos de
aguas naturales que reciben desechos fecales de animales y
humanos contienen numerosos microorganismos patógenos
capaces de sobrevivir fuera de su hospedero. Estos
microorganismos son transmitidos indirectamente a poblaciones

2. susceptibles a través de las aguas de distribución
inadecuadamente tratadas o a través de aguas recreacionales
fuertemente impactadas con aguas residuales y desechos fecales
de animales domésticos (Hurst y Murphy, 1996).
Los parásitos protozoarios Giardiaintestinalis(sinónimo para G.
lambliay G.duodenalis), Cryptosporidiumparvum y C. hominis son
patógenos intestinales excretados con las heces de humanos y
animales infectados en concentraciones de hasta 1×109
(oo)quistes por gramo de heces (Danciger y López, 1975;
Pickeringet al., 1984; Jokipii y Jokipii, 1986; Chappellet al., 1996;
Morgan-Ryanet al., 2002; Chappellet al., 2006). Los (oo)quistes
(abreviación para ooquiste y quiste) son las formas infectantes y
constituyen un estadio del ciclo de vida de estos parásitos que los
capacita para sobrevivir en el ambiente acuático y resistir los
procesos de tratamiento de aguas de distribución y aguas de
desecho doméstico (Betancourt y Rose, 2004). La ingestión no
intencional de (oo)quistes infecciosos con las aguas y alimentos
contaminados, así como la ingestión inadvertida de aguas
contaminadas durante las actividades recreacionales, puede
ocasionar problemas de salud pública. En países en vías de
desarrollo, las enfermedades causadas por Cryptosporidium y
Giardia forman parte del complejo grupo de enfermedades
parasitarias que, junto con las enfermedades bacterianas y virales,
son un factor que impide el avance potencial y el progreso social y
económico de sus habitantes. Estos parásitos fueron incluidos
recientemente en la Iniciativa de la Organización Mundial de la
Salud para las enfermedades desatendidas (Savioliet al., 2006).
La Iniciativa persigue abordar enfermedades parasitarias y otras
enfermedades tropicales (entre ellas las helmintiasis intestinales,
esquistosomosis, leishmaniasis, leptospirosis, etc.) de manera
integrada a fin de garantizar el manejo efectivo (control y
eliminación) de estas enfermedades (www.paho.org,
www.who.int).
Numerosos brotes epidémicos de enfermedades gastrointestinales
han ocurrido por transmisión indirecta de los parásitos
protozoarios Giardia y Cryptosporidium a través de aguas de
distribución y cuerpos de aguas naturales y artificiales (lagos, ríos,
playas y piscinas) empleados para recreación (Thompson et al.,
1993; MacKenzieet al., 1994; Fayeret al., 2000; Rose et al., 2002;
Nygårdet al., 2006). De igual manera, los protozoarios
Cyclosporacayetanensis y Toxoplasmagondii han estado
asociados con brotes de enfermedades transmitidas a través del
agua (Benensonet al., 1982; Raboldet al., 1994; Bowie et al., 1997;
Isaac-Rentonet al., 1998; Araminiet al., 1999; Dubey, 2004;
Schuster y Visvesvara, 2004; Karaniset al., 2007). A esta lista se
suman los protozoarios intestinales Entamoebahistolytica y
Balantidiumcoli, los cuales son considerados patógenos de
atención para la salud pública y con potencial de transmisión a
través de las aguas, particularmente en países en vías de
desarrollo (Ashbolt, 2004; Karaniset al., 2007). En poblaciones de
zonas urbanas y rurales de estos países son comunes las
protozoosis intestinales ocasionadas por todos los parásitos
anteriormente mencionados (Chacín-Bonilla et al., 1998, 2006a, b;

3. Díaz et al., 2000; Xiaoet al., 2001; Alarcón de Noyaet al., 2003;
Seppoet al., 2005).
La transmisión de los protozoarios intestinales Cryptosporidium y
Giardia a través del agua se considera uno de los problemas de
salud pública más prominentes en el mundo entero (Rose et al.,
2002; Carey et al., 2004). Esto es evidente al considerar las bajas
dosis infecciosas de C.parvum(9-1042 ooquistes; DuPont et al.,
1995; Okhuysenet al., 1999), de C. hominis (10-83 ooquistes;
Chappellet al., 2006) y de G. intestinalis(10-100 quistes; Rendtorff,
1954) y su resistencia a los tratamientos. En Venezuela existen
estudios sobre protozoarios entéricos en ambientes acuáticos
(Arcay y Bruzual, 1993; Quintero-Betancourt y Botero, 2000); sin
embargo, son pocos y se requiere de mayor información en zonas
costeras y sistemas de tratamiento de aguas para suministro.
Existen numerosos métodos de concentración y detección de
protozoarios entéricos en aguas, que aplicados en conjunto con
los métodos moleculares y cultivo celular permiten determinar de
manera eficiente y sensible las especies y genotipos asociados
con enfermedades en humanos. Conocer la importancia relativa
de vías específicas de transmisión de protozoarios intestinales,
incluyendo las fuentes potenciales de contaminación ambiental,
constituyen aspectos fundamentales que permiten entender la
epidemiología de las enfermedades parasitarias, de esta manera
se pueden aplicar medidas correctivas que minimicen la
prevalencia e incidencia de estas enfermedades en la población.
Métodos para el Estudio de Protozoarios Entéricos en Aguas
Los métodos de detección de protozoarios intestinales en
ambientes acuáticos, desarrollados en instituciones de diversos
países, son evaluados constantemente con el fin de optimizar los
diferentes procedimientos que permitan detectar de manera
sensible y específica los protozoarios patógenos en aguas
(Anónimo, 1999; EPA, 1999a, b, 2005). Inicialmente, los métodos
fueron diseñados y aprobados para el monitoreo de la presencia
de Cryptosporidium yGiardia en aguas de distribución y cuerpos
de aguas naturales; sin embargo, han sido adaptados para el
estudio y detección de Toxoplasma gondii y
Cyclosporacayetanensis (Sturbaumet al., 1998; Quintero-
Betancourt et al., 2002; Villena et al., 2004; Dumetre y Darde,
2005).
El método estándar para el estudio de Cryptosporidium yGiardia
en aguas incluye tres procedimientos básicos: concentración,
purificación y detección. Los procedimientos iniciales de
concentración y purificación incluyen los siguientes pasos: 1)
filtración de un volumen determinado de agua (10-1000 litros) con
el propósito de capturar los (oo)quistes en una matriz de filtración;
2) lavado del filtro con soluciones detergentes para desprender los
(oo)quistes capturados en la matriz de filtración; 3) centrifugación
a velocidad moderada (1100-1500g) a fin de reducir el volumen de
muestra (£5ml) y concentrar el material en suspensión junto con

4. los (oo)quistes; 4) separación selectiva de (oo)quistes de los
materiales inespecíficos en suspensión, utilizando partículas
magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos para
protozoarios (separación inmunomagnética). La detección de
(oo)quistes se realiza mediante microscopía de fluorescencia
utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales marcados con
isotiocianato de fluoresceína (ITFC), lo que permite incrementar la
capacidad de visualizar los (oo)quistes y diferenciarlos de
materiales inespecíficos y algas microscópicas (microalgas)
presentes en ambientes acuáticos. La confirmación de (oo)quistes
aislados de ambientes acuáticos se lleva a cabo mediante
microscopía por contraste de fases o también mediante
microscopía de interferencia diferencial. Adicionalmente se aplican
fluorocromos específicos para ácidos nucleícos tales como el 4`,6-
diamidino-2-phenylindole (DAPI) y el yoduro de propidio o PI por
sus siglas en Ingles (PropidiumIodide). La microscopía por
contraste de fases y de interferencia diferencial permite visualizar
la morfología y estructuras internas de los (oo)quistes, tales como
esporozoitos (Cryptosporidium) axonema y núcleos (Giardia). La
tinción con los fluorocromos DAPI y PI permite no solo confirmar la
presencia de (oo)quistesesporulados, sino que suministra además
información acerca de la viabilidad de los (oo)quistes. Esto se
debe a la habilidad que tienen los fluorocromos de penetrar de
manera selectiva al interior de la estructura parasitaria (Campbell
et al., 1992). El DAPI es un fluorocromo de tamaño pequeño que
penetra fácilmente al interior de las células y tiñe selectivamente
las regiones del DNA ricas en adenina y timina, por ello permite
distinguir (oo)quistesesporulados potencialmente viables (Figura
1). El PI es un fluorocromo de gran tamaño que penetra el interior
de las células únicamente cuando la continuidad de las barreras
físicas (pared celular y membrana celular) han sido interrumpidas
(Belosevicet al., 1997), de ahí que los (oo)quistes que han incluido
PI se consideran no viables.
Figura 1. Fotomicrografías de Cryptosporidiumparvumobtenidas
con microscopía de inmunofluorescencia. Nótese en la imagen
izquierda un ooquiste no viable de Cryptosporidiumteñido con
fluoresceína y yoduro de propidio. La micrografía a la derecha
corresponde a cuatro ooquistesesporulados (DAPI+) teñidos con
fluoresceína, Alexa fluor y DAPI (nótese los cuatro esporozoitos en

5. el interior de los ooquistes) (imágenes digitales de Walter Q.
Betancourt y G. D. Digiovanni).
En la Tabla I se describen los métodos estandarizados para el
estudio de Cryptosporidium y Giardia en aguas. El método 1622
fue aceptado y aprobado para el estudio de Cryptosporidium por la
Agencia de Protección Ambiental de los EEUU y forma parte de la
regulación más reciente instaurada en ese país para el control de
ese parásito en aguas. La regla LT2 establece un nivel de cero
ooquistes en aguas tratadas o un requerimiento de 99% (2-log10)
de remoción de ooquistes cuando se emplea únicamente
tratamiento por filtración (EPA, 2006). En el Reino Unido, la
regulación vigente dictada en 1999 establece el monitoreo diario
de Cryptosporidium en aguas tratadas. La regulación requiere un
nivel máximo de 10 ooquistes por 100 litros y cualquier valor por
encima constituye una ofensa criminal (Fairleyet al., 1999).
Tabla I
Métodos Convencionales para la Concentración, Purificación y
Deteción de Giardiay Cryptosporidiumen Ambientes Acu áticos
El método 1622 fue rigurosamente validado por diferentes
laboratorios y los principios generales se describen en la Tabla I.
El método 1623, también validado, fue posteriormente
desarrollado para la detección simultánea de Cryptosporidium y

6. Giardia en aguas (EPA, 1999b). Existen variaciones de los
métodos 1622 y 1623 que incluyen procedimientos alternos de
filtración y separación inmunomagnética, así como diferentes
anticuerpos monoclonales y métodos de detección. Los
procedimientos alternos se describen en la Tabla II y pueden ser
utilizados para el estudio y monitoreo de Cryptosporidium y Giardia
en aguas una vez aplicados los controles específicos de calidad
(EPA, 2005). Los controles de calidad son ensayos de laboratorio
que permiten evaluar la eficiencia de recuperación tanto del
método estándar como del método alterno. En estos ensayos se
utilizan muestras de aguas sembradas con (oo)quistes, se
cuantifican los (oo)quistes recuperados y se determina la eficiencia
de recuperación. Los valores obtenidos deben satisfacer criterios
de aceptación establecidos para que tanto el método estándar
como el método alterno puedan ser utilizados por laboratorios de
referencia en el estudio y monitoreo de Cryptosporidium y Giardia
en aguas. Con el desarrollo reciente de controles positivos
internos (ColorSeed, BTF Precise Microbiology, Australia) se
puede evaluar simultáneamente la eficiencia de recuperación y el
numero de (oo)quistes presentes en ambientes acuáticos. Los
controles positivos internos consisten de (oo)quistes inactivados
por irradiación gamma y marcados con un fluorocromo diferente al
que se emplea para evaluar la presencia de (oo)quistes en
ambientes naturales. Una vez procesada la muestra, los
(oo)quistes se cuantifican con el microscopio de fluorescencia
utilizando de forma simultánea filtros específicos para cada
fluorocromo, de manera de diferenciar los (oo)quistes sembrados
de los recuperados del ambiente. La eficiencia de recuperación se
expresa en base al número y porcentaje de (oo)quistes
recuperados. Con este procedimiento se determinan las
interferencias que pueden ocasionar una baja eficiencia de
recuperación y se estiman con mayor precisión la presencia y
número de (oo)quistes en una muestra de agua (Quintero-
Betancourt et al., 2003).
Tabla II
Métodos alternos para la concentración y deteción de
Cryptosporidiumy Giardiaen ambientes acu áticos

7. Detección de ProtozoariosEntéricos en Aguas
La microscopía de inmunofluorescencia es el método estándar
para la detección de Cryptosporidium y Giardia en aguas, tanto
para el método 1622/1623 en los EEUU como para el Protocolo
Operacional Estándar en Australia y el Reino Unido. En este
método se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales
conjugados con ITFC. Sin embargo, se ha determinado que
existen diferencias significativas en cuanto a la avidez y
especificidad de los anticuerpos disponibles comercialmente
(Hoffman et al., 1999). Diversos estudios han demostrado que la
detección de Cryptosporidium y Giardia en aguas es más eficiente
cuando se emplean anticuerpos monoclonales de tipo IgG1, los
cuales poseen mayor avidez y especificidad que los anticuerpos
policlonales u otras clases de anticuerpos monoclonales (por
ejemplo, IgG3 e IgM) (Ferrari et al., 1999; Weiret al., 2000;
Quintero-Betancourt et al., 2003). Estas observaciones fueron
confirmadas en muestras ambientales utilizando dos clases
diferentes de anticuerpos monoclonales (IgG1 e IgM) marcados
con isotiocianato de fluoresceína. La aplicación del anticuerpo
monoclonal IgG1 (EasyStain, BTF Precise Microbiology, Australia)
produjo mucho menos fluorescencia de trasfondo y la unión del
anticuerpo a los (oo)quistes fue más específica que con el
anticuerpo IgM (WaterborneInc, New Orleans, EEUU). La
distinción fue más evidente en muestras de agua que contenían
altos niveles de microalgas y partículas minerales (Quintero-

8. Betancourt et al., 2003). La Tabla III describe los diferentes
anticuerpos disponibles comercialmente para la detección de
Cryptosporidium y Giardia en muestras clínicas y ambientales.
Tabla III
Anticuerpos disponibles comercialmente para la deteción de
Cryptosporidiumy Giardiaen muestras cl ínicas y ambientales
En Australia fue desarrollado un método para la detección y
enumeración selectiva de ooquistes de Cryptosporidium que aplica
citometría de flujo con activadores fluorescentes capaces de
clasificar células según la fluorescencia y el tamaño (Veseyet al.,
1997). Este método (Ferrari et al., 2000) mejora sustancialmente el
proceso de detección, especialmente cuando se utilizan
anticuerpos monoclonales de tipo IgG1 conjugados con ITFC
(CRY104- ITFC) y ficoeritrina (CRY104-PE). Los anticuerpos
monoclonales conjugados con estos fluorocromos facilitan la
visualización de muestras ambientales bajo el microscopio, ya que
se disminuye la fluorescencia inespecífica.
En Francia se desarrolló un equipo automatizado (ChemScan RDI,
Chemunex, France) que utiliza amplificación de luz por emisión
estimulada de radiación (Laser) capaz de localizar de manera
específica ooquistes de Cryptosporidium y diferenciarlos de
partículas y otros microorganismos inespecíficos (Rushtonet al.,
2000).
Para la detección de ooquistes de T. gondii y C. cayetanensis no
se han desarrollado aun anticuerpos fluorescentes, sin embargo
los ooquistes de ambos protozoarios son capaces de emitir
fluorescencia (autofluorescencia) al ser excitados con luz
ultravioleta (Lindquistet al., 2003). Este procedimiento facilita la
visualización de las estructuras parasitarias bajo el microscopio de
fluorescencia. No obstante, el procedimiento es muy tedioso,
sobre todo cuando se trata de muestras ambientales en las cuales
están presentes microalgas y materiales inertes capaces de emitir
fluorescencia similar a los ooquistes. La tinción ácido-resistente,
particularmente usada para el diagnóstico de Cyclospora en
heces, tampoco se recomienda para la detección del ooquiste en
ambientes acuáticos, debido a que muchas veces no permite ni
siquiera la identificación correcta de ooquistes en muestras
clínicas (Marshall et al., 1997; Mota et al., 2000).

9. La detección de quistes de E. histolytica en ambientes acuáticos
resulta igualmente tediosa cuando se utilizan tinciones diseñadas
para la detección de quistes en muestras clínicas de heces, tales
como la solución de lugol (Healy y Ravdin, 1988), ya que la
abundancia de microalgas de morfología y tamaño similar a los
quistes dificulta la diferenciación bajo el microscopio de luz. A
finales de los años 90 se desarrolló un anticuerpo monoclonal para
la detección específica de quistes de E. histolytica en muestras de
heces (Walderichet al., 1998); sin embargo, este anticuerpo no se
encuentra disponible comercialmente. Hasta ahora, no hay
trabajos sobre la aplicabilidad de este u otros anticuerpos
monoclonales para la detección de quistes de Entamoeba en
muestras ambientales. Más aun, son escasos los trabajos
publicados sobre presencia de E. histolyticayotros protozoarios
intestinales (Blastocystishominis, Balantidiumcoli e Isospora belli)
en aguas, a pesar de haber sido demostrada su asociación con
brotes epidémicos de enfermedades gastrointestinales en
humanos (Karaniset al., 2007).
Conclusión
La aplicación de métodos de detección de protozoarios patógenos
en aguas ha sido fundamental en el esclarecimiento de aspectos
que son importantes para entender la transmisión de protozoosis
intestinales a través de ambientes acuáticos. Los nuevos sistemas
de concentración (filtración y purificación) permiten recuperar
selectivamente los (oo)quistes facilitando de esta manera el
método subsecuente de detección. No se incluye en esta revisión
las técnicas moleculares y cultivo celular, las cuales han permitido
identificar modos de transmisión y fuentes de contaminación de los
parásitos protozoarios intestinales Cryptosporidium y Giardia que
constituyen hoy en día junto con otros protozoarios emergentes
(Cyclospora, Toxoplasma) problemas de salud pública en el
mundo entero. Estos métodos y su importancia para la
determinación de riesgos de salud pública serán cubiertos en una
revisión aparte.
Aun queda por establecerse el papel del agua en la transmisión de
las protozoosis intestinales causadas por E. histolytica, B.hominis,
B. coli, I. belli. De allí que el potencial de transmisión de los
primeros protozoarios mencionados sea mayor en países donde
los sistemas convencionales de tratamiento de aguas para
suministro y aguas de desecho son inadecuados o inexistentes.
Los parásitos unicelulares microsporidios que eran considerados
protozoarios patógenos son incluidos actualmente dentro del
phylum de los hongos, por ello no forman parte en esta revisión.
No obstante su potencial de transmisión a través del ambiente
acuático ha sido identificado y comprobado y por ello hoy en día
se aplican los principios de los métodos de detección para
Cryptosporidium y Giardia. En Venezuela y otros países de
América Latina son muy limitados los estudios sobre parásitos
protozoarios en ambientes acuáticos y la disponibilidad de
métodos de detección de protozoarios entéricos en estos
ambientes proporciona la estrategia científica requerida en estos

10. países para enfrentar algunos de los desafíos que representan los
patógenos entéricos en aguas.
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