Development of an engineered bioluminescent reporter phage for the sensitive detection of viable Salmonella typhimurium Because foodborne illnesses continuously threaten public health, rapid and sensitive detection of pathogens in food has become an important issue. As an alternative to time-consuming and laborious conventional detection methods, a technique using recombinant reporter phages has been developed. Here, we developed an advanced bioluminescent reporter phage SPC32H-CDABE by inserting a bacterial luxCDABE operon into the Salmonella temperate phage SPC32H genome. Whole SPC32H genome sequencing enabled the selection of nonessential genes, which can be replaced with approximately 6-kb luxCDABE operon, which provides both luciferase (LuxAB) and its substrate, fatty aldehyde, as generated by fatty acid reductase (LuxCDE). Thus, the SPC32H-CDABE detection assay is simpler and more efficient compared to the luxAB-based assay because the substrate addition step is excluded. At least 20 CFU/mL of pure S. Typhimurium culture was detectable using SPC32H-CDABE within 2 h, and the signals increased proportionally to the number of cells contaminated in lettuce, sliced pork, and milk. These results thereby demonstrate that this phage successfully detects live Salmonella without appreciable interference from food components. Furthermore, the presented data suggest that SPC32HCDABE represents a promising easy-to-use diagnostic tool for the detection of Salmonella contamination in food. Seongmi Kim,# Minsik Kim,# and Sangryeol Ryu* Department of Food and Animal Biotechnology, Department of Agricultural Biotechnology, Research Institute for Agriculture and Life Sciences, and Center for Food and Bioconvergence, Seoul National University, Seoul 151-921, South Korea pubmed link : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24806327 french traduction and power point presentation by Liliane M. Lebanese university - Section 1 - Hadath Biology department

2. Introduction
Avec l’augmentation de la pollution
environnementale le risque de contaminations
alimentaires préoccupe de plus en plus la
communauté vue les maladies sévères qu’elle
pourrait engendrer.
D’où l’importance de développer des méthodes
pour une détection rapide de toute sorte de
contamination.

3. À savoir:
I. Salmonella enterica serovar Typhimurium :
 Bactérie gram (-)
 responsable des symptômes qui vont de la diarrhée légère à la gastro-entérite
aiguë chez l’homme et cause la fièvre typhoïde chez les animaux.
 93.8 millions des cas de gastro-entérite dans le monde sont causées par une
infection de Salmonella avec 155,000 mort chaque année dont 80.3 millions sont
victime d’aliments contaminé par la bactérie en question.

4. Méthodes classique de détection de
contamination :

5. Méthode basée sur l’utilisation d’un
bactériophage rapporteur :
 Principe : insertion d’un gène rapporteur dans le génome du bactériophage
spécifique à la bactérie qu’on veut détecté.
 Avantages :
1. Spécifique à la bactérie cible
2. Capacité de distinguer entre bactérie vivante et morte
3. Production de masse facile
4. Moins couteux
5. Longue durée de vie
6. Détection rapide

6. Idée générale
SPC32H CDABE
SPC32H LUX CDABE
Bactériophage
de Salmonella
Typhimurium
Opéron
bactérien

7. Enzyme qui ce trouve dans les cellules des
organismes bioluminescents et qui catalyse
l’oxydation de la luciférine ( FMNH2 + Aldéhyde
aliphatique) en oxyluciférine avec émission de
photons .
Capacité de clonage
limitée => on
élimine les gènes
non essentiels et on
les remplaces avec
l’opéron bactérien
Opéron bactérien de 6 Kb
Substrat de
luciférase

8. Les gènes Lux
 Gènes responsables des réactions qui entrainent l’émission de lumière
 Ils sont utilisé dans la construction de bio rapporteurs
 Émettent une lumière bleu-vert a 490 nm
 Il existe 5 gènes lux : A, B, C, D et E
Les différentes combinaisons entre ces gènes génère différents bio rapporteurs.
LuxAB
• Luciférase
• Addition de
substrats
exogènes
• Erreurs
LuxCDE
• Complexe
d’acide gras
réductases.
• Substrat de
luciférase
LuxCDABE
• Pas besoin
de substrats
exogènes
• Facile
• rapide

10. Milieux et conditions de cultures :
 37 ̊C – Aérobie
 Milieu LB ( bouillon – agar 1.5 % )
 Ampicilline (Ap) : 50 μg/ml
 Kanamycine (Km) : 50 μg/ml
 Chloramphénicol (Cm) : 25 μg/ml
 L(+)- arabinose 100 Mm
 Mitomycine C ( MMC ) : 1.0 μg/ml
 Saccharose (20 %)
 N-décanal (1 % ) = n- décylaldéhyde
(substrat exogène pour LuxAB)

11. Souche bactérienne, bactériophage et
plasmides :
 Souche : SR5100 ΔLT2gtrABC1 (32H); SR5003 lysogenized by SPC32H
( LT2 souche sauvage de salmonella hôte pour le phage SPC32H )
 E. coli S17-1 λpir
 SPC32H : phage qui infecte Salmonella Typhimurium
 Plasmides :
 Red Helper pKD46
 pKD13
 pCP20
 pCE70
 PBBR lux
 plasmide suicidaire PDS132

13. 1 – One-step inactivation method of
chromosomal gene
 Méthode de Datsenko et wanner.
 Principe :
Remplacer par recombinaison homologue, une
séquence chromosomique par un gène de résistance
à l’aide d’amorces portant des extensions
homologues au gènes cibles.

16. 2- Induction :
 Pousser la bactérie lysogène à libérer une grande
quantité de phages ( + que la quantité qu’elle
libère normalement )
 La portion de bactéries qui subissent un cycle
lytique devient considérable.
 Agent inducteur : Mitomycine C.

17. 3- Luminométrie:
 Appareil :
Luminomètre
 Fonction :
Mesurer une intensité lumineuse
( bioluminescence et ATP métrie )
 Il comprend :
1. Un Détecteur de lumière qui compte les photons
2. Un Système électronique converti et affiche la mesure
de photons en RLU ( relative luminescence units )
3. Un tube photomultiplicateur
4. Une chambre de mesure
5. Un injecteur de réactifs.

20. Génome
SPC32H
Gène Lux
CDABE
Taille
augmente de
15 %
Diminution du
pouvoir infectieux
du phage
Capacité de la tête du
phage est limitée
Solution ??????????

21. Choix et délétion des gènes non essentiels :
 Les gènes impliquées dans la conversion lysogénique :
• Antigène-O Acétylase ( oac )
• Glucose translocase ( gtrA)
 Le gène (Int) séquence codante pour l’intégrase .
( on a gardé une partie du cote 5’ terminal importante pour l’excision )
 Le site situé directement après l’opéron CPS.
Conversion lysogénique :
le gène du phage s’intègre dans les chromosomes
de la bactérie et la mettent en état latent (
lytique  lysogénique ) et la rendant plus
virulente ex. : modification de l’antigène O de
salmonella qui est reconnu par le Sys. immunitaire
Rôle dans l’ intégration du génome du
phage dans le chromosomes de l’ hôte
et son excision
 Elimination par la méthode one-step en utilisant :
• le plasmide pKD13 portant le gène de résistance a la kanamycine
• le plasmide pCP20 portant le gène de FLP recombinase
( mais pas pour le site situé après l’opéron CPS )

22. Insertion du gène Lux :
I- Choix du site cible :
• Directement après le Promoteur de CPS
 Pourquoi ?
• Région transcrite de manière efficace
 Preuve ?
• On a inséré dans cette région le gène lacz sans promoteur apporté par le
plasmide pCE70 et sous traitement par MMC on a induit un cycle lytique.
Après test de la β-Galactosidase on a prouvé que ce promoteur (Pcps) est
largement transcrit par suite cette région serait la plus convenable.

23. Insertion du gène Lux :
II- Préparation à l’insertion:
a. Le plasmide pBBRlux porte les gènes Lux ( AB ou CDABE)
b. Amplification du gène par PCR ( fragment de pBRlux avec le gène dans son centre)
c. Clonage du fragment amplifié dans le plasmide suicidaire pDS132
d. Lysogénisation d’ E. coli S17-1 λpir par le phage SPC32 H
( contenant le gène de résistance a la kanamycine au niveau du site cible ( one-step method) )
e. Transformation D’Ecoli par pDS–luxAB ou pDS-LuxCDABE
f. Conjugaison entre E. Coli transformée et lysogénisée .

24. Insertion du gène Lux :
III- Intégration au site cible
SPC32H KmR
pDS-Lux
Première recombinaison
homologue
Par compétition du
saccharose
(présent à 20%)
Deuxième recombinaison
homologue
SPC32H:Lux
Insertion validée par séquençage
KmR et CmS
KmR et CmR
KmS et CmS
Gène sacB :
Gène de la Bacillus Subtilis
confère une sensibilité au
saccharose au bac gram(-)
C’est le gène suicidaire de
pDS132

26. 1- Contrôle de l’affinité du phage rapporteur
 But :
Savoir si la modification génétique de SPC32H a altérée son affinité et son
habilité de lyser la bactérie Salmonella Typhimurium.
 Méthode :
Test de concurrence bactériennes mesurée par D.O.
 Échantillons testés :
- Solution de phages : SPC32H-ABi + culture Salmonella
- Solution de phages : SPC32H-AB + culture Salmonella
- Solution de phages : SPC32H-CDABE + culture Salmonella
- Solution de phages : SPC32H + culture Salmonella
- Solution de contrôle négatif : Tampon SM + culture Salmonella
Tampon utilisé pour
dilution et stockage de
bactériophages
Souche
sauvage du
phage non
modifié

27.  Résultats :
Cycle Lysogénique
présence de (Int )
L’ introduction du
gène lux AB n’a pas
altérée le pouvoir
infectieux de la
souche sauvage
SPC32H tolère
l’insertion de
fragment de 2kb
Début de la lyse
de par SPC32H-AB
Début de la
lyse par
SPC32H-CDABE
Cette Intervalle peut être due à :
1- Complication dans
l’assemblement du phage due à la
surexpression du gène luxCDABE à
partir du promoteur CPS.
2- Problèmes d’encapsidation du
phage causés par l’augmentation
de la taille du génome du phage
de 3kb > souche sauvage.
Après 3 h d’action le
taux de Salmonella
inhibée est devenu à
peut-près égale pour
les deux phages.

28. 2- Validation de la production de bioluminescence par
le phage génétiquement modifié
 But :
Mettre en évidence la production de bioluminescence par les cellules infectées
par le phage modifié contenant les gènes lux .
 Méthode :
Mesure luminométrique

29.  Résultats :
SPC32H-ABi-2 et
SPC32H-ABi-1 procurent
le même niveau de
bioluminescence
l’absence d’ intégrase
n’aboutit pas directement
une activité lytique
Pourquoi SPC32H-ABi-2
n’entre pas en cycle
lytique (T=100)
comme SPC32H-AB ??

30. 3- Contrôle de détection spécifique de
Salmonella vivante
 Test de l’affinité
 But :
Mesurer la quantité de salmonella d’ après l’ intensité de l’ émission lumineuse
 Procédure :
- Dilution en série de cultures de salmonella 10X
- Infection par SPC32H-CDABE ( 10^8 PFU/mL )
- Mesure de la bioluminescence émise pour 2 h d’infection
( pour capter le maximum de signal lumineux même pour les plus petites concentration de salmonella )
 Test de spécificité
Dans les aliments et dans l’environnement Salmonella se trouve avec beaucoup d’autre
bactéries pour cela la méthode de détection utilisée ne doit pas être influencé par la
présence d’autres bactéries
 On a mélangé la souche MG1655 d’ E. Coli avec le phage SPC32H-CDABE et on a mesuré la
bioluminescence.
 On a mélangé la souche MG1655 avec Salmonella et le phage et on a mesuré la
bioluminescence

31.  Résultats :
on a put
détecter 20
CFU/ml de
salmonella
Il y a corrélation entre la
valeur RLU et le nombre de
bactéries énuméré par
comptage directe
Test de l’affinitéTest de spécificité
Aucune émission
de
bioluminescence
Niveau de
bioluminescence
égal a celui qui est
émis en présence de
salmonella seul

32. 3- Contrôle de détection spécifique de
Salmonella vivante
 Test de l’ habilitée de SPC32H-CDABE de détecter SEULMENT les Salmonella vivante:
Capacité de distinguer entre bactérie vivante et morte est une des objectifs de l’utilisation de la Méthode basée
sur l’utilisation d’un bactériophage rapporteur.
 Procédure:
• Culture de Salmonella de 10^5 UFC/ml
• La moitié de cette quantité est traitée 30 min avec de l’ éthanol 70% (v/v)
• Récupération des bactéries et resuspension dans un bouillon LB
• Mélange des cellules morte avec les cellule vivante ensemble dans des ratios
différents ( 100 %, 10%, 1%, 0.1% et 0% de cellules vivante ).
• Infection de chaque Mélange avec SPC32H-CDABE ( 10^8 PFU/ml)
• Mesures luminométrique.

33.  Résultats :
Échantillons
contrôles
L’ intensité du signal
lumineux augmente avec
l’augmentation du taux
des cellules vivante dans
la solution.

35. 1- Contaminations artificielles des
échantillons alimentaires
 A- préparation de l’inoculum pour la contamination artificielle
i. culture de Salmonella dans 3 ml de bouillon LB à 37 ̊C pour obtenir une
valeur de D.O600 = 0.5 ~ 4 x 10^7 CFU/ml
ii. Dilutions en séries 10 X ( de 10 a 1 x10 ^6 CFU/ml ) dans bouillon LB
iii. Quantification de la concentration par étalement sur gélose LB ou XLD
 B- Contamination des échantillons
Laitue
Iceberg
•3 échantillons de 10 g
•Quantification sur XLD
•1 ml de salmonella dans chaque
échantillon
•Séchage 2 h à température Ambiante
•Homogénéisation dans un Blender dans
90 ml de bouillon LB
•Dilutions en séries.
•Culture de 0.1 ml des échantillons sur
XLD pour mesurer la quantité de
Salmonella
•5 ml de chaque échantillon dans tube
stériles pour mesure luminométrique
Tranche de
porc
•3 échantillons de 10 g
•Trempés dans l’inoculum pour 30 min
•Homogénéisation
•Culture de 0.1 ml sur XLS
•5 ml de chacun sont transférés dans tube
de test stériles pour mesure
luminométrique
Lait
pasteurisé
•3 échantillons de 10 ml
•+ 1 ml de culture dans chacun.
•Stockage 2 h à 4 ̊C
•Homogénéisation
•Culture sur XLD
•Mesure luminométrique
Consommée
frais et sans
cuisson
Un des inconvénients des autres
phages portant les gènes lux
c’est l’inhibition du signal
lumineux dans les échantillons
turbide (trouble - laiteux)  on
veut tester la capacité de notre
Phage rapporteur

36. L’ intensité du signal
est moins important
que celui des autres
échantillons mais
continue a démontré
une allure dose-
dépendante et
linéaire en
corrélation avec le
nombre de bactérie
Résultats