Presentación de un caso clínico para ejemplificar la modalidad de uso del MEB, MEB ambiental (ESEM) y MET.

1. Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Curso de Microscopía Electrónica
Autor: Kenneth Walker

2. Antecedentes entregados
 En la mayoría de los pacientes que padecen úlcera péptica, se ha
descrito la infección del antro gástrico por parte del microorganismo
Helicobacter pylori.
 Una vez adherido este microorganismo a la mucosa gástrica, es
capaz de reducir la capacidad ácido-neutralizante del mucus.
 En el último tiempo se ha descrito que ciertos probióticos naturales
no inmunogénicos, pueden competir con el Helicobacter pylori por
los nichos de la mucosa gástrica, siendo capaces de erradicar la
infección reduciendo la ocurrencia de úlceras pépticas.

3. Kéfir
 Es un producto lácteo fermentado probiótico originado en la
región del Cáucaso. También reciben este nombre los gránulos
utilizados para su producción.
 Los principales microorganismos en el kéfir son la bacteria
Lactobacillus acidophilus y la levadura Saccharomyces kefir,
aunque varían según las regiones y métodos de cultivo.

4. Problema
Investigadores del Instituto de Biotecnología de la
Universidad de Madagascar desean saber si el
microorganismo Helicobacter pylori y el probiótico “Kéfir”
coexisten en un mismo nicho o si se excluyen
mutuamente.

5. Metodología
Los investigadores proponen un estudio
comparativo entre biopsias de pacientes que
consumen diariamente Kéfir y pacientes que
no lo consumen.

6. Resultados esperados
Que la colonización de la región antral gástrica
por parte de la microflora que contiene el
probiótico Kéfir desplace y erradique a la
Helicobacter pylori.

7. Se nos solicita la realización de un
protocolo para manejo y visualización
de la muestra.

8. Generalidades
 H. pylori es una bacteria Gram negativa de forma espiralada, de
alrededor de 3um de largo y con un diámetro aproximado de
0,5um. Tiene de 4 a 6 flagelos.
 Es microaerófila. Usa hidrógeno y metanogénesis como fuente de
energía. Es oxidasa y catalasa positiva.

10. Surgen las siguientes interrogantes…
 ¿Ambos grupos de pacientes están infectados por H. pylori? ¿Qué
cepa de H. pylori?
 Respecto al grupo consumidor de Kéfir. ¿Cuánto tiempo llevan
consumiendo el probiótico?
 ¿Se espera que Kéfir desplace todas las cepas de Helicobacter?

11. Asumiendo que…

Ambos grupos de pacientes están infectados con H. pylori. Los grupos se
crearon de tal manera que existe la misma posibilidad teórica de que la H.
pylori les pueda producir una úlcera.

Los pacientes del grupo consumidor de Kéfir llevan el tratamiento con el
probiótico durante 1 a 6 meses .

Se espera que Kéfir desplace indistintamente a las cepas de H. pylori que
estén presentes en el antro gástrico de los pacientes consumidores del
probiótico.

12. Confirmación de la presencia de H. pylori
Para crear los grupos se debe:
Tomar muestra por endoscopía dirigida a la región antral.
 Fijación en formalina tamponada al 4% p/v, 0.1M.
 Deshidratación en etanoles de concentración creciente.
 Impregnación e inclusión en Paraplast.
Tinción de H/E.

13. H/E

14. Luego, confirmar presencia de H. pylori por IHQ
 Desparafinación en xilol
 Rehidratación en etanoles de concentración decreciente
 Recuperación antigénica
 Bloqueo peroxidasa endógena con H2O2 3% en PBS.
 Bloqueo con suero fetal bovino durante 15min a Tº ambiente.
 Incubación Ac. 1º anti-H. pylori
 Incubación Ac. 2º biotinilado
 Detección con Streptavidina-DAB
 Contratinción con hematoxilina
Controles negativos: Cortes tratados del mismo modo sin Ac.
Secundario.

15. IHQ

16. Una vez creados los grupos,
se sugiere al cabo de 1 mes…

17. Antro
Gástrico
Muestras endoscópicas
Parafina
Resina Lowicryl
Desecado
H/E e IHQ
ImmunoGold
Metalizado
MET
MEB
M.O

18. Usos de cada muestra
IHQ y H/E en parafina
• Detección de H. pylori en ambos grupos de individuos.
• Comparar resultados con los de la IHQ inicial.
• Conocer efectos del Kéfir.
MET ImmunoGold
• Analizar la biopelícula formada por los microorganismos del Kéfir y su
relación con la H. pylori para los casos en que hubiese presencia de la
bacteria. Marcar H. pylori para distinguirla.
MEB con metalizado
• Complementar la información obtenida por MET para comprender de mejor
forma la disposición de los microorganismos en la superficie gástrica y
ayudar en la obtención de conclusiones.

19. Muestras para MO

20. IHQ

21. Muestras para MET

22. Procesamiento para MET
 Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM
clorhidrato de calcio por 3hrs a T° ambiente o 24hrs a 4°C.
 Lavado en frío con una solución de sucrosa al 3.5% en buffer
fosfato salino 0.1M por 2hrs.
 Lavado en una solución de clorhidrato de amonio 50 mM en
buffer sucrosa-fosfato + clorhidrato de calcio 0.5mM a pH
7.4 por 1hr a 0°C.
 Lavar en frío con buffer maleato 0,1M con sucrosa al 3.5%.
Utilizado para la remoción de iones fosfato pH 6.5.
Luego, deshidratar en acetonas ascendentes.

23. La infiltración y polimerización a baja T°.
 Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baja T°
 La polimerización con radiación UV es independiente de la T° lo que
le permite polimerizar a la T° de infiltración en un tiempo mayor o
igual a 24hrs.

24. ImmunoGold
 Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10 min,
diluido en TBS
 Ac primario contra H. Pylori en TBS + NGS (2.5% suero de
cabra, 2 mM HEPES, pH 7.2) al 1%
 Ac secundario contra FC conjugado con Au en TBS
 Pasar por GA al 2% por 5 minutos para estabilizar los complejos
Ag-Ac.
Nunca olvidar los tejidos controles a lo largo del procedimiento que son
necesarios para validar la técnica y el estudio mismo.
Acs. Hechos en especies distintas para evitar reacciones cruzadas.

25. Contraste
Acetato de uranilo al 4% por 10 min.
y citrato de plomo de Reynolds 5 min.
Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y citrato de
plomo de Reynolds 3min

26. Montaje
Los cortes siempre son sensibles al haz
de electrones. Para mejorar su
resistencia, cubrirlos con FORMVAR en
una etapa final. Esto permitirá el mejor
acceso de los anticuerpos por ambos
lados del corte.

27. MET

28. Muestras para MEB

29. Procesamiento para MEB
 Fijación
 Glutaraldehído 2,5% en PBS 1-2hrs a tº ambiente.
 3 lavados en PBS por 10min cada uno a tº ambiente.
 Post fijación en OsO4 en PBS1-2 hrs a tº ambiente.
 3 lavados en PBS 3 por 10min cada uno a tº ambiente.
 Deshidratación en acetonas de concentración ascendente.
 Secado por Punto Crítico
 Montaje del espécimen en platina de grafito.
 Metalizado con Oro/Paladio.

31. Ultrastructure of spiral and types A and
B coccoid forms of H. pylori. (a) SEM of
spiral forms on day 1. Flagella are seen
on one side of the cells (arrows). A
spherical organism is visible (asterisk).
Bar, 2 μm. Inset: TEM of a spiral form.
A flagellum (arrow) and an
intracytoplasmic granule (arrowhead)
are visible. Bar, 0.5 μm. (b) SEM of type
A coccoid forms on day 3 in CLM. Cells
are spherical with an irregular surface
and possess few flagella. They have a
tendency to adhere to each other. Bar, 2
μm. Inset: TEM of type A coccoid form.
The surface is sunken (arrowhead).
Membrane and intracytoplasmic
structures are not clearly visible. Bar,
0.5 μm. (c) SEM of type B coccoid forms
on day 3 in 300 mM-LM. The smooth
surface is tightly encircled by flagella
(arrowheads). Bar, 2 μm. Inset: TEM of
type B coccoid form. The membrane
structure is well preserved and a
flagellum is also visible (arrowhead).
Bar, 0.5 μm.
http://jmm.sgmjournals.org/

33. Methods Cell Biol. 2008;88:367-87. doi: 10.1016/S0091-679X(08)00419-6.
A protocol for isolation and visualization of yeast nuclei by scanning electron
microscopy.
Murray S, Kiseleva E.
Source
TEM Service Facility, Paterson Institute for Cancer Research, University of Manchester,
Manchester M20 4BX, United Kingdom.
Abstract
This article describes a protocol that details methods for the isolation of yeast nuclei from
budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) and fissionyeast (Schizosaccharomyces pombe),
immunogold labelling of proteins, and visualization by Field Emission Scanning Electron
Microscopy (FESEM). This involves the removal of the yeast cell wall and isolation of the nucleus
from within, followed by subsequent processing for high resolution microscopy. The nuclear
isolation step is performed by enzymatic treatment of yeast cells to rupture the cell wall and
generate spheroplasts (cells that have partially lost their cell wall and their characteristic
shape), followed by isolation of nuclei by centrifugation. This protocolhas been optimized for
the visualization of the yeast nuclear envelope (NE), nuclear pore complexes (NPCs), and
associated cytoskeletal structures. Samples, once processed for FESEM, can be stored under
vacuum for weeks, allowing considerable time for image acquisition.