Les effets des extraits des Cyanobactéries contenant les microcystines sur la croissance, le processus de la nodulation et l’assimilation de l’azote chez la fève Vicia faba L., Fabacées

1. Université Caddi Ayad Faculté des Sciences Semlalia de marrakech
Master BES 2015

3. INTRODUCTION
 Les changements climatiques mènent à une augmentation de
l’eutrophisation des écosystèmes aquatiques surtout les réservoirs et les
rivières ainsi que les cyanobactéries sont de plus en plus fréquentes.
 L’utilisation des eaux contaminées par ces toxines dans l’irrigation peut
contribuer à plusieurs effets négatifs sur le rendement agricole surtout chez
les légumineuses , ainsi cette étude vise à déceler l’influence de ces toxines
sur la croissance , la nodulation et l’assimilation de l’azote.

4. MILIEU D’ÉTUDE
 Barrage de « Lalla Takerkoust »:
 Situé à environ 35 Km au Sud Ouest de Marrakech, II est construit sur
l'oued N'fis qui prend sa source dans la chaîne du haut Atlas.
 C’est un réservoir aquatique qui représente un écosystème avec une
prolifération massif des cyanobactéries toxiques durant l’été et l’automne.

5.  Les cyanobactéries toxiques sont collectées en mois de
Septembre 2005 à partir de réservoir de Takerkoust.
 Les échantillons sont collectés suit aux techniques
d’échantillonnage.

6. CYANOBACTÉRIES TOXIQUES
Généralement ces proliférations ne durent que quelques jours car les pluies, les
vents violents ou la chute de la température sont des facteurs qui stoppent cette
croissance anarchique.

7. Microcystis aeruginosa
Cette bactérie appartient à la famille des Microcystis, prolifèrent dans les
écosystèmes d'eau douce tempérés.

8.  Les échantillons sont séchés et congelés
 Le matériel lyophilisés (échantillons) est conservé à 20°C pour l’extraction
des MC et l’analyse par la chromatographie HPLC.
 La méthode d’extraction et la quantification des toxines par HPLC est déjà
décrite par EL Khalloufi et al.

10. Protocole expérimental:
Trois souches rhizobiales sont isolées( dans le milieu YEM medium agar avec
congo-red) à partir des racines nodulés de v.faba collecté de la région de
Marrakech.
NB: les nodules sont prédésinfecté avec l’hypochlorite (4°) et lavées avec
l’eau physiologique stérile.

11. Milieu YEM medium

13. Confrontation des souches rhizobiales et
les MC
 Dans trois rangées des flacons contenants100ml de l’extrait de levure
mannitol inoculé avec les trois souches rhizobiales (RhoF4.RhoF6.RhoF21)
en parallèle avec les concentrations (0, 10, 50 et 100 µg/l) de MC.
 Incubation à 28°C dans l’obscurité avec l’agitation continue (250 rpm).
 L’estimation de la croissance des souches rhizobiales étudiées est évalué
par le comptage des UFC dans le milieu de culture.

16. Protocole expérimental:
• Stérilisation et rinçage des graines.
• Préparer trois boite de pétri pour la germination des
grains(pour chaque boite 10 graines ).
• L’exposition des graines à des concentratrions de ( 0; 10; 50;
100 µg MC /l).
• Incubation des boites de germination à 25°C dans l’obscurité
et dans un milieu stérile.
• Ainsi la détermination de taux de la germination.

17. L’exposition des plantes de la fève à
l’extrait de MC
Protocole expérimental:
 Prégermination des graines de v.faba dans des pots de 15 cm de sable stérile (
3 graines/pots), sous les conditions naturelles ( Avril-Mai 2010).
 Trois groupes de traitement sont réalisée avec 3 différent souches
(RohF4.RohF6.RohF21), 2 ml de suspension bactérienne par group de graines
 Après 15 jours de germination on rajoute les différents gammes de
concentrations (0, 10, 50 et 100µg/l de MC), avec la solution de l’azote pendant
6 semaines.

18. Evaluation d’effets
 Récolte des plantes puis récupération des nodules de chaque
lots de plantes.
 Compter de nombre de nodules pour chaque gammes de
concentration.
 le nombre de nodules selon la concentration de MC utilisée
nous permet de vérifier s’il y a de différence significative les
résultats ou non.

19. Protocole expérimental:
 Dessiccation des tiges, racines et nodules à 70°C pendant 72h.
 Pondéré la matière sèche obtenu.
 Dosage de l’azote contenu dans les racines et les bourgeon par
la méthode de Kjeldahl.

20.  Les résultats ainsi obtenu pour chaque protocole
expérimental sont analysée par des tests statistique
convenable.
 L’analyse de la variance ( Anova) nous permet de
vérifier s’il y a une différence significatif entre les
résultats obtenu.

21. RESULTATS
Les résultats de la chromatographie obtenue de l’extrait des blooms du
M.aeroginosa, révèle qu’il ya cinq variétés :
 MDC-LCR (4.20 %) ;
 MC-(H4)-YR (4.32 %) ;
 MCLY (8.32 %);
 C-FR (9.25 %) et
 MC-LR (73.71 %).
 La concentration des microcystines contenant dans l’extrait de blooms est de
22.24 µg/ml.
 MC-LR est la microcystine la plus dominante dans l’extrait (74%).

22. Tableau1: Effet des cyanotoxines sur la croissance des souches rhizobiums (RhOF4, RhOF6 et RhOF21)
dans YEM medium (abondances bactériennes en UFC/ml)
Confrontation des souches rhizobiums et les
cyanotoxines

23. Tableau 2: l’effet de la concentration des microcystines sur l’abondance des
souches bactériens après 5 jours d’exposition
100 µg/l témoin
RhOF4
(UFC/ml) 122*1011 227 * 1011
RhOF6
(UFC/ml) 100*108 127 * 108
RhOF21 (UFC/ml)
61*1010 261 * 1010

24.  La croissance des souches du rhizobium RhOF4, RhOF6 et RhOF21
dépend de la nature de la souche et de la concentration des
cyanotoxines.
 Les toxines des Microcystines ont des effets négatifs sur la croissance des
rhizobiums.
 Décroissance significative des UFC/ml des rhizobiums dans les tests
d’exposition avec les MC en comparaison avec le témoin.
 L’effet négatif des microcystines apparait spécialement pour les hautes
concentrations (50 et 100 µg/l).

25. Concentration MC (µg/l) 10 50 100
Taux de germination (%) 100 75 68,75
Tableau 3: Effet de la concentration de microcyctine (10, 50 et 100 µg/l) sur le
taux de la germination des graines
Effet des microcystines sur le taux de la germination
des graines de la fève
Les microcystines ont des effets significativement négative sur le taux de
germination des graines de la fève.

26. Rendement de la matière sèche des pousses et
les racines
Figure 1: Effet des microcystines sur l’accumulation de la matière sèche dans les poussés (A) et les
racines (B) chez la fève inoculé avec les souches rhizobiums (RhOF4, RhOF6 et RhOF21)

27.  le rendement de la matière sèche des pousses et les racines décroit significativement
dans des concentrations les plus élevés de cyanotoxine (100 µg MC/l).
 Les plantes de la fève inoculées avec RhOF6 ont montré une décroissance significative
de la matière sèche dans les concentrations de 50 µg MC/l en comparaison avec le
témoin.
 les plantes inoculé avec RhOF21 ne montre pas une différence significative de point de
vue de poids sec entre les racines et les pousses.
 Il y a une corrélation significativement négative entre la concentration des cyanotoxines
et la matière sèche de plante de la fève inoculé avec RhOF4, RhOF6 et RhOF21.

28. Figure 2: Effet des microcystines sur la matière sèche des nodules et le nombre des nodules
Effet des microcystines sur la nodulation

29.  L’effet des microcystines est fort contre la nodulation.
 Les microcystines inhibent la croissance des nodules et aussi le processus
de la nodulation.
 Cyanotoxines induisent des effets négatifs sur le développement des
nodules de la fève inoculés avec les souches RhOF4, RhOF6 et RhOF21.
Effet des microcystines sur la nodulation

30. Effet des microcystines sur la teneur d’azote contenu dans les
racines et les bourgeons de la fève inoculée avec les souches
rhizobiums
Tableau 5: effet des microcystines sur la teneur d’azote contenu dans les racines et les
bourgeons de la fève inoculée avec les souches rhizobiums

31.  Dans les plantes nodulés par RhOF6 ou par RhOF21, les MC fait diminuer
significativement la teneur de l’azote totale dans les bourgeons et les
racines de la fève
 l'effet des cyanotoxines est plus important dans les concentrations de
toxines plus élevées(50, 100µg MC/ml). Par contre les MC n'ont pas induit
une modification significative sur l'azote contenu dans les pousse et les
tiges des plantes inoculées par RHOF4 ===> RHOF4 est plus résistante
aux MC.
 l'assimilation de l'azote sous l'effet des cyanotoxines est différente selon la
concentration des MC et la nature de la souche

32. DISCUSSION
 L’extrait brute des cyanotoxines utilisé dans cette étude a un effet négatif sur la croissance
des souches du rhizobium testé qui nodulent les fèves.
 Quelques études ont montré que les MC affectent la perméabilité de la paroi cellulaire même
aux faibles concentrations (Dixon et al. 2004).
 Il est indiqué aussi que les cyanobactéries peuvent produire des différents types des
métabolites secondaires ayant une activité fongicide et/ou antibactérienne.
 Les extraits des cyanobactérie et des MC pures ont un effet inhibiteur sur la croissance et
l’ultrastructure des microalgues (effet inhibiteur plus persistant)et les bactéries. perte de
propriétés métaboliques au bout de 8jrs d’exposition

33.  Selon Vassilakaki et Pflugmacher,L’exposition aux extraits bruts des bactéries et
aux MC pures induit une réponse oxydative de Senechosystis sp. au stress et aussi
un effet négatif sur la croissance des microalgues et bactéries.
 La germination des graines est très essentielle, elle constitue le stade précoce de la
croissance des semis (peut affecter la productivité des récoltes).
 l’inhibition de la germination est observée chez les légumineuses
Toxines
Cyanobactériques
+
Extraits bruts des
cyanobactéries
Alfalfa(Madia sativa)
(Pflugmacher et al.2006; El
khaloufi et al. 2011)
Graines de Pea sativum
(Saqrane et al.2008)

34.  Constations de cette étude:
Diminution significative du Taux de la germination
Concentrations
50µg des MC-LR/l 100µg des MC-LR/l

35.  Aucun effet n’est apparent pour la concentration 10µg de MC-LR/l par rapport au
témoin.
 Cette étude confirme donc les constatations de l’étude précédente.
 En plus de cela on 'a une réduction de la matière sèche (des tiges et des racines)
dans la gamme des plantes comme le pois cultivé(Pea sativum) et d’autre plantes
terrestres telles les lentilles cultivées(L.esculenta), le maïs(Z. mays), le blé dur
(T. durum) le trèfle, le colza et aussi l’ivraie (Rye grass) . diminution à la plus
forte concentration(100µg MC/l).
 La nodulation mesurée et le nombre de nodule sont un indice d’infection réussie
des légumineuses par les MC.

36. Effet des pratiques d’irrigation par aspersion avec une
eau contaminée??
• Cet effet possible est évoqué par El khaloufi et al.
Irrigation en eau contenant les
MC
Réduction de nombre des
nodules durant la symbiose
MC-M.Sativa
( dépend de la concentration
des MC)

37.  les cyanotoxines ont réduit le nombre de nodules par plante de fèves et
encore leur poids sec.
 La réduction du poids est due à la réduction de la translocation des
carbohydrates envers les nodules suivant l’inhibition de la croissance des
bourgeons et la diminution de la capacité photosynthétique
intrinsèque(Velagaleti et Marsh 1989).

38. Assimilation de l’azote
 La symbiose Rhizobium-Légumineuses permet la fixation de l’azote
atmosphérique.
 La souche RhOF4 apparaît être la plus efficace pour l’assimilation de l’azote.
 Dans cette expérience , pas de modification de l’azote contenu dans les bourgeons
et les racines des plantes infectées par RhOF4 par contre l’azote totale décroit pour
les fèves inoculées par RhOF6 et RhOF21 et exposées aux MC.
 Le déclin de l’azote assimilé par les plantes de la fève sous autres stress
environnementaux est rapporté par plusieurs auteurs, Sadiki et Rabih 2001
Abdellay et al. 2005 Krouma 2009… .

39. La dégradation de
leghemoglobine (hémoprotéine
fixatrice d’ O2 chez les fabacées)
La diminution de l’activité
enzymatique des tissus
protecteurs
Inhibition des voies
d’assimilation de
l’ammonium
Réduction de l’activité
nitrogènase et la limitation
de diffusion d’O2
Diminution ou
déclin de
l’assimilation de
l’azote

40. CONCLUSION
 Cette étude a évalué l’impact des cyanotoxines sur la croissance, la
nodulation et l’assimilation de l’azote chez la fève.
 L’utilisation des eaux contaminées aux cyanotoxines dans l’irrigation
engendre des effets négatifs sur le rendement et la qualité des cultures ce
qui conduit aux pertes économiques significatives.
 La tolérance de la symbiose rhizobium-légumineuses peut constituer une
nouvelle voie pour augmenter la fertilisation et la du sol et aussi une
méthode biotechnologique pour remédier la contamination des cultures par
les cyanotoxines.

41. Références
 Abddelly C. Krouma A. Drevon JJ (2005). Nitrogen fixation and yield of
chickpea in salin Mediterranean zones, Grain legumes 42: 16-17
 Asada K (1992) Ascorbate peroxydase: a hydrogen peroxide scavenging
enzyme in plants. Physiol Plant 85: 235-241