Expressão heteróloga

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Expressão heteróloga

  1. 1. EXPRESSÃO HETERÓLOGA DEPROTEÍNASIvson CassianoMayla Abrahim
  2. 2. O que são proteínas heterólogasheterólogo (he-te-ró-lo-go) adj (hétero+logo) 1Que consiste em elementos diferentes.Expressão heteróloga de proteína significa que umaproteína é experimentalmente colocado em uma célula quenormalmente não fazem (ou seja, expressa) a proteína.A expressão de proteínas funcionais em hospedeirosheterólogos é um desafio da biotecnologia moderna.
  3. 3. Proteínas e sua importânciaA sequência de aminoácidos bem como a função daproteína, são determinadas pela sequência de pares debases no gene que a codifica. As proteínas sãoessenciais à estrutura, à função, e aoregulamento celular e são também responsáveis pelahomeostasia do organismo.A expressão heteróloga de proteínas é muitoimportante quando se pretende proceder ao estudofuncional das mesmas.A utilização de microrganismos geneticamentemodificados, capazes de sintetizar proteínas em grandequantidade, apresenta, sob o ponto de vista econômico,uma vantagem considerável em relação aos processosclássicos de produção.
  4. 4. Os sistemas de expressão heterólogaem proteínas têm vindo a serextensivamente utilizados nos dias dehoje, nomeadamente na produção deproteínas de interesse do ponto devista biotecnológico e medicinal .EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS
  5. 5. Expansão e desafios da indústria debiotecnologia: produção eficiente e controlada de proteínasrecombinantes diferentes sistemas de expressão: procariotos eeucariotos inúmeras finalidades: diagnóstica, terapêutica e deprevenção (vacinas)Tecnologia de DNA recombinante: obter e combinar genes de uma variedade de fontes clonar e expressar genes em diferentes hospedeiros produção de grandes quantidades de proteínasrecombinantes
  6. 6. A clonagem de expressão permite obter o produto do geneclonado.O produto é utilizado para diferentes fins: O transcrito da sequência clonada (transcrição in vitro) podeservir como sonda de hibridação.•A proteína expressa pode servir para identificar o gene clonado,numa biblioteca de expressão, por hibridação com o anticorpoespecífico.•O DNA recombinante pode servir para produzir proteínas de valorcomercial.
  7. 7. Relembrando: Clonagem gênica: isolamento, amplificação epurificação de um gene ou de genes, a partir domaterial genético de um dado organismo. Vetores: veículos de clonagem que permitem que osfragmentos de DNA a serem clonados sejamintroduzidos e propagados em uma célula hospedeiraadequada. Célula hospedeira: células de fácil manipulação,crescimento rápido e constituição genética bemconhecida (ex: bactérias, leveduras, células de culturade tecidos de mamíferos e insetos).
  8. 8. Sistemas de expressão de proteínasrecombinantes: bactérias (Escherichia coli) leveduras (Pichia pastoris) baculovírus/células de inseto cultura de células de mamíferos células de plantas e plantas transgênicas animais transgênicos
  9. 9. Processo: Escolhendo o vetorAplicação da proteína expressadaCaracterísticas da proteínaSolubilidade e localização celularTagsPreparar o vetorDigestão ou MétodoLICPreparar o InsertoPlasmídeo ou DNAPCRClonar o Insertono VetorAnelamentoTransformaçãoTransformação emcélulade expressãoInduçãoDeterminação tempo etemperaturaSDS-PAGECultura decélulasExtraçãoDetergentesMétodosFísicosPurificaçãoColuna afinidadeProtases - Tags
  10. 10. Procedimento:Isolar e preparar o DNA;Escolher o vetor apropriado;O fragmento de DNA a clonar é introduzido emvectores de clonagem, formando-se o DNArecombinante.O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira– transformação, que possui mecanismosenzimáticos para a replicação do DNA e para asíntese protéica;Selecção e identificação de células que incorporam oDNA recombinante;Verificar se a proteína foi expressa;Remoção e purificação das proteínas. -
  11. 11. Escolhendo o vetorOrganismos como plasmídeos, bacteriófagos, cosmídios, BAC (BacterialArtificial Chromosome) e YAC (Yeast Artificial Chromosome) utilizadospara transferir DNA/RNA para uma celular hospedeira.Considerações importantes para escolher o melhor vetor de expressão:- Aplicação da proteína expressada;- Informações específicas sobre a proteína a ser expressada (sequência extra deamina terminal)- Estratégia de clonagem – preparo do inseto (compatibilidade entre sítio derestrição e a região de leitura).- Solubilidade e localização celular (citoplasma, periplasma ou corpo de inclusão)- um local de reconhecimento onde as endonucleases o irão cortar.
  12. 12. Preparando o inserto de DNADNA de interesseUtilizar uma enzima de altafidelidade;Limitar o número de ciclos da reação;Aumentar a concentração do DNA;Aumentar a concentração de primers.
  13. 13. Células para clonagem E. coliVantagens:Vasto conhecimento da genética e fisiologiade E. coliDiversidade de vectores de clonagemFácil controlo da expressão génicaFácil crescimento com elevadas produçõesSecreção do produto no meio de culturaDesvantagens:Não realiza modificações pós-traducionais etem capacidade limitada de formar pontesdissulfídricasAtividade biológica e imunogenicidadepodem diferir da proteína naturalElevado conteúdo de endotoxinasFalta de um mecanismo de secreção
  14. 14. Escolhendo a melhor célula A escolha da melhor célula competentedepende da natureza da proteína deinteresse:Proteínas mais sensíveis a ação deproteases;Proteínas eucarióticas que possuem códonspróprios, também chamados de raros;Proteínas insolúveis;Proteínas tóxicas;
  15. 15. Deficiência de ProteaseLinhagens B834, BL21, BLR, Origami ™B,Rosetta™ 2, Tuner™;São deficientes em proteases que possamdegradar as proteínas durante o processo depurificação;Proteínas se tornam mais estáveis nessaslinhagens;
  16. 16. Um pedaço de DNA pode ser inserido emum plasmídeo, se tanto o plasmídeo circulare a fonte de DNA têm sítios dereconhecimento para a mesmaendonuclease de restrição.Vetor de expressão
  17. 17. Clonagem num vector de expressãoplasmídicoUm pedaço de DNA pode serinserido em um plasmídeo, setanto o plasmídeo circular e afonte de DNA têm sítios dereconhecimento para a mesmaendonuclease de restrição.O plasmídeo e o DNAestranho são cortados poresta endonuclease derestrição (EcoRI nesteexemplo).Os dois intermediáriosrecombinar por base oemparelhamento e estãoligadas pela ação da DNAligase.
  18. 18. O vector de expressão tem umpromotor forte, adjacente aogene que codifica a proteína, queorigina grandes quantidades demRNA.O DNA recombinante éintroduzido em bactérias,leveduras, células de inserto, oucélulas de mamífero, onde o geneclonado é transcrito e traduzidoeficientemente.
  19. 19. TagO tag é uma curta sequência de nucleotídeos que codifica umpeptideo com poucos aminoácidos. Pode ser adicionado à extremidade N ou C do produtodo gene clonado. Permite a detecção e purificação de proteínas. Péptideos de fusão específicos conferem vantagens àproteína alvo durante a expressão: aumentam asolubilidade, protegem da proteólise, melhoram aconformação, aumentam a produção.São vários os tags utilizados nos vectores de clonagem:His6Glutationa-S-transferase (GST)Proteína de ligação a maltose (MBP)Proteína verde fluorescente (GFP)Epítopos
  20. 20. Tag adicionado ao insertoPor engenharia genética, uma tag (epítopo) pode seradicionado ao inserto.
  21. 21. Detecção de proteínasA identificação do DNA clonado é feita porhibridação com um anticorpo específico daproteína expressa.
  22. 22. Recuperando a ProteínaLise celularRemoção dos Ácidos NucléicosOtimizar a PurificaçãoRemover os TagsArmazenar as proteínas em tampãoapropriado.
  23. 23. Lise celular convencional
  24. 24. Detergentes para Extração
  25. 25. Buster FamilyÉ uma mistura de detergentes, própria para o rompimentoda parede celular de E.coli e liberação das proteínas ativas.
  26. 26. Purificação de proteínas com tagApós obtenção da proteína, esses resíduos devem serpurificados;Podem prejudicar a função / forma da proteína;São removidos por uma protease específica e / oucoluna cromatográfica.
  27. 27. Proteases de remoçãoProteases específicas promovem remoçãoeficiente dos resíduosda proteínas.São altamente específicas e podem serativadas em baixastemperaturasEvita desnaturação da proteína.
  28. 28. FractogelPurificação eficiente e econômica dasprotéinasPurificação de proteínas em largaescala;Purificação de proteínas recombinantesobtidas da cultura celularPurificação de vírusRemoção de resíduos e toxinasAlta estabilidade química
  29. 29. Corpos de Inclusão – FraçãoInsolúvelCorpos de inclusão: tornam a proteínainativa devido a formação de agregadosinsolúveis (ácidos nucléicos, fosfolipídios,etc); Consequentemente a proteína deveser rearranjada para retomar sua atividade;Métodos convencionais de purificação decorpos de inclusão são empíricos econsomem muito tempo do usuário.iFOLD ™ Protein Refolding SystemÉ um método rápido ereprodutível deidentificar as condiçõesde rearranjo da proteína.
  30. 30. Gene repórterGene repórter é um gene que produz uma proteínaque pode ser detectada e quantificada utilizando umteste simples.Utilização de genes repórter na localização de proteínasrecombinantesRatinho transgénico com GFP em fusão com uma proteína epitelialO ratinho contém um transgene marcado com GFP expresso no corpo; oratinho fluoresce quando iluminado com luz UV.
  31. 31. AtualmenteÉ possível realizar este processo (com modificaçõesespecificas para cada célula, proteína de interesse egenoma) em: Leveduras (Pichia pastoris, Saccharomycescerevisiae, entre outras). células de mamífero (células COS, células CV1,etc) baculovírus/células de inseto células de plantas e plantas transgênicas animais transgênicos
  32. 32. A produção de insulina humana porENGENHARIA GENÉTICAbactéria E. coli Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro2001
  33. 33. vetor de expressão pLMT8.5 construído para a produçãoda pró-insulina humana em E. coli.
  34. 34. Aumentando a estabilidade daproteínaUtilize células deficientes de proteases;Adicione inibidores de proteases durante o processode extraçãoEncontre o melhor tampão de armazenagem
  35. 35. Bibliografia Como melhorar sua Expressão de ProteínasRecombinantes em E.coli. Paola de Carvalho Braga,2008. Clonagem de expressão. PROTEÍNAS RECOMBINANTES PRODUZIDAS EMLEVEDURAS. Fernando Araripe Gonçalves Torres. RevistaBiotecnologia. A produção de insulina humana por ENGENHARIAGENÉTICA. Beatriz Dolabela de Lima. RevistaBiotecnologia.
  36. 36. OBRIGADO!Ivson CassianoMayla Abrahim

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