1. LAQB
Laboratório de Analises
Químicas e Biológicas
Principais conceitos e técnicas
utilizados na microbiologia
Aluno: Ivson Cassiano de O. Santos
2012
2. INTRODUÇÃO
A Microbiologia é o ramo da biologia que estuda os
microrganismos, incluindo eucariontes unicelulares e
procariontes, que incluem Bactérias, Fungos, Vírus,
Protozoários, Algas unicelulares, Viróides e Prions.
A Bacteriologia é uma ciência, ramo da Biologia, que
estuda as bactérias e suas propriedades.
3. CONDUTAS, BARREIRAS, EQUIPAMENTOS E
INSTRUMENTAIS DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL E AMBIENTAL
ambiente apropriado
instrumentais estéreis
luvas, máscaras e óculos protetores
Flambar as alças e agulhas e boca dos tubos.
limpar e desinfetar periodicamente a bancada.
Todas as operações envolvendo manipulação de culturas e
meios de cultura deverão ser efetuadas na área de proteção
conferida pela chama do bico de Bunsen.
4. ÁLCOOL 70%
Sua atividade ocorre pela desnaturação de proteínas e remoção de
lipídios, inclusive dos envelopes de alguns vírus. Para apresentar
sua atividade germicida máxima, o álcool deve ser diluído em
água, que possibilita a desnaturação das proteínas. A concentração
recomendada para atingir maior rapidez microbicida com o álcool
etílico é de 70% em peso e com o isopropílico, entre 60 e 95%.
Possuir fácil aplicabilidade, baixo custo e reduzida toxicidade.
Diluição correta e tempo de exposição
6. CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS
Fig.: Procedimento para remover bactérias de um caldo com a
alça de platina
7. CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS
Fig.: Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de
uma Placa de Petri
8. INOCULAÇÃO NA PLACA DE PETRI
Isolamento de colônias
bacterianas e obtenção
culturas puras.
Estrias múltiplas ou
esgotamento
9. DESCONTAMINAÇÃO
Um dos principais problemas nos laboratórios de microbiologia é a grande
quantidade de resíduos contendo microrganismos infecciosos.
Autoclaves
Desinfecção química
Os recipientes que acondicionam material com perigos microbiológicos
devem conter um desinfetante na diluição de uso apropriada.
Compostos à base de fenol 5% , hipocloritos (água sanitária a 2%) e
glutaraldeído 2%, formaldeído (solução alcoólica 8% e solução aquosa
10%).
10. BANCO DE DADOS
O nosso laboratório dispõe de uma tabela com as bactérias presentes
em estoque com suas devidas informações e observações.
Bactéria Cepa/numero Origem Espécie
Condições de crescimento Incubação Condições de estoque
Ultima data de estoque Observações
11. INTRODUÇÃO
Cepas bacterianas
Isto deriva dos fenômenos espontâneas ou
induzidos da natureza ou mesmo
artificialmente, chamado "Mutação Genética"
12. CEPAS PADRÃO
São cepas destinadas ao controle de qualidade
bacteriológico.
Apresentam resposta conhecida a uma série de
provas laboratoriais, entre as quais bioquimismo,
reação tintorial ao Gram, morfologia e resposta a
antibióticos.
ATCC AYE SDF
ACICU AB
13. CEPAS LAQB
Cepas ATCC - American Type Culture
Collection.
Escherichia coli ATCC 10536
14. ESCHERICHIA COLI ATCC 10536
Referencia para esta cepa :
Di Modugno E et al. 1994
Misiek et al. 1973.
18. MEIO DE CULTURA
Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada,
capazes de promover o crescimento bacteriano, em condições
laboratoriais. Para isso um meio de cultura necessita conter
características básicas, que incluem:
- Fonte de carbono e nitrogênio
- Fonte de energia
- Sais minerais
- Fatores de crescimento
- Condições físicas
- Esterilização
19. TIPOS DE MEIOS DE CULTURA
Meios de enriquecimentos
Caldo Brain Heart Infusion (BHI)
Caldo Tetrationato
Meios de transporte
Meio de Stuart
Meio de Cary-Blair
Caldo Tioglicolato
Meio seletivo
o
Agar Manitol Salgado
Agar SS
20. TIPOS DE MEIOS DE CULTURA
Meio diferencial
Agar Eosin Meteiolene Blue (EMB)
Agar McConkey
Agar Hektoen.
Meio indicador
Agar Triple Sugar Iron (TSI)
Agar Citrato de simimons.
21. PROCEDIMENTOS E CUIDADOS NA PREPARAÇÃO
DE MEIOS DE CULTURA
Na preparação de um meio, deve-se adicionar uma pequena
quantidade de água até que o meio fique úmido e então completar
com o resto de água homogeneizando a solução.
O tempo de esterilização em autoclave é de 15 minutos á
temperatura de 121°C.
Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas,
para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos
tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.
22. Todos os meios confeccionados
devem ser devidamente
identificados com o nome do
meio e do responsável, data de
fabricação, data de validade e
tipo de armazenamento.
23. MANUTENÇÃO DE CULTURAS
A manutenção de culturas é realizada para que
se possa manter viável as cepas em estoque.
De acordo com a cepa a concentração de glicerol
pode variar.
Ex.: E. coli 50% glicerol e 50% Ágar Nutriente.
Prazo de validade: 3 meses á -20°C.
24. PLANO DE TRABALHO LAQB - 2012
Objetivo: Fazer o levantamento de cepas atualmente encontradas no
LAQB e preparar o mesmo para aquisição de outras.
Método:
1°- Inoculado as amostras em meio enriquecido para proporcionar o
crescimento das amostras. O meio de enriquecimento escolhido foi o
caldo BHI, após a semeadura , incubar por 24h á 37ºC.
Resultados: POSITIVO para turvação no meio.
NEGATIVO para coloração intacta do meio.
2° - De acordo com os resultados obtidos na etapa 1, será semeado as
amostras de acordo com o meio seletivo de cada espécie.
Staphylococcus aureus = manitol
E. coli = EMB
Pseudomonas areuginosa = agar Pseudomonas
Micrococcus luteus = MH
25. Método:
Análise do crescimento bacteriano (morfologia e coloração)
O Manitol é fermentado pelo Staphylococcus Aureus,
mas não pela maioria dos Staphylococcus; o Sal inibe o
crescimento da maioria dos microrganismos, mas o
Staphylococcus Aureus.
Meio Manitol salgado para
Staphylococcus Aureus.
O meio EMB, o azul de Eosina e Metileno
inibem o crescimento de Gram positivas. E. coli
apresentam colônias escuras ou verde metalico,
fermentação da lactose e sacarose.
Meio EMB (Eosine Methylene
Blye) para E. coli
26. Método:
Análise do crescimento bacteriano (morfologia e coloração)
Permite a diferenciação de P. aeroginosa de outras
Pseudomonas. As P. aeroginosa apresentam
pigmento azul-verde escuro que se funde ao meio.
Meio Agar Pseudomonas.
M. luteus apresentam pigmentação amarela
tanto em meio AN, quanto em MH.
Micrococcus luteus em meio MH
27. Método:
3° - Ressemear, por esgotamento, todas as amostras crescidas
e isoladas em meio agar nutriente 24h 37°C
Meio Agar Nutriente
4° - Teste bioquímico
A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de
Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou
espécies de bactérias
28. Método:
4° - Teste bioquímico
Meio TSI, meio SIM, meio citrato de Simons, Meio úreia.
5° - Preparo para estoque
Semear em placa, com swab, as amostras cultivadas no caldo
6° - Estoque
NEXT
29. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS – DISCIPLINA:
BACTERIOLOGIA. PROFESSOR ALOYSIO
CERQUEIRA, UFF.
Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos
Exames Microbiológicos – ANVISA.
Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da
Embrapa Agrobiologia, 1999.
Biossegurança em Laboratórios Biomédicos de
Microbiologia - 3.a edicao, 2006.