Beginners Guide to TikTok for Search - Rachel Pearson - We are Tilt __ Bright...
PhD thesis defence
1. Forurening af vandmiljøet med steroidøstrogener Henrik Andersen Adjunkt Institut for Analytisk Kemi Danmarks Farmaceutiske Universitet [email_address]
12. Xeno-østrogener fra Nova-programmet 1,32 μg/l 0,5 μg/l BPA <LOQ <LOQ OP 0,68 μg/l 0,4 μg/l NP NOVA 2001 4 μg/l <LOQ BPA <LOQ <LOQ OP 0,29 μg/l <LOQ NP Århus amt Max Median Østrogen
17. Oprindelig vandmetode Forsur til pH = 3,0 & GF/C filtrer 1,00 kg prøve Tilsæt intern standard (E2-acetat) 1 g silika gel (1.5 % H 2 O deaktiveret) Elueres med 5 ml n-hexane/acetone (65/35) Ekstraktion med C18 SPE Derivation med MSTFA, TMSI, DTE. 1 h ved 60 °C. Tilsæt apparat standard (Mirex) GC/ion trap-MS/MS
19. Metoder til slam og spildevand Ternes et al. (2002) Anal. Chem. 74, 3498-3504. Andersen et al., (2003) Env. Sci. Tech. Forsur til pH = 3,0 & GF/C filtrer 1,00 l prøve Tilsæt intern standard (E2-acetat) GPC oprensning cyclohexane/acetone (3:1) Ekstraktion med C18 SPE Derivation med MSTFA, TMSI, DTE. 1 h ved 60 °C. Tilsæt apparat standard (Mirex) 1 g silika gel (1.5 % H2O deaktiveret) Elueres med 5 ml n-hexane/acetone (65/35) GC/ion trap-MS/MS Afvej 0,50 g slam (Aktivt eller endeligt slam) Tilsæt intern standard (E2-Acetat) GPC oprensning cyclohexane/acetone (3:1) Ekstraher 2xmetanol + 2xacetone med ultralyd Derivation med MSTFA, TMSI, DTE. 1 h ved 60 °C. Tilsæt apparat standard (Mirex) 1 g silika gel (1.5 % H2O deaktiveret) Elueres med 5 ml n-hexane/acetone (65/35) GC/ion trap-MS/MS
28. Diagram af renseanlæg Andersen et al., (2003) Env. Sci. Tech. biofosfat denitrifikation gitter sandfilter primær sedimentation nitrifikation FeCl 3 24 h flow proportional prøve grab prøve tromlefilter primært slam overskud af aktivt slam biogas anaerob rådnetank pressefilter endeligt slam 9.350 m 3 11.950 m 3 41.900 m 3 sekundær sedimentation
37. Slam og vand massestrøm i renseanlæg NO 3 - Primær sedimentering Aktivt slamanlæg Sekundær sedimentering Slambehandling Overskudsslam Stof fra primær sedimentering Indløb Udløb Stabiliseret slam Returslam
Notas do Editor
Jeg hedder Henrik Andersen og jeg har været indskrevet som PhD-studerne ved Institut for Analytisk Kemi her på Danmarks Farmaceutisk Universitet. Titelen på min afhandling er: Forurening af vandmiljøet med steroidøstrogener.
Foredraget er organiseret som vist her. ….
De tre traditionelle steroidøstrogener der omtales i miljøsammenhæng er vist her. Østradiol er det naturlige hormon for mennesker og dyr og østron er en metabolit der dannes ved oxidation af østradiol, som har nogen østrogenaktivitet. Ethinyløstradiol er den østrogene komponent i alle P-piller. Inden jeg går videre vil jeg bede om at i bemærker at her har defineret forkortelser for steroidøstrogenernes navne, som jeg vil anvende gennem foredraget. Alle tre østrogener har en fælles struktur som gør at de kan bindes til østrogenreceptoren. TRYK.
Østrogener har været et af de hotteste emner indenfor toksikologi og miljøkemi i over ti år. Det skyldes især at der findes en række industrikemikalier, som uheldigvis har samme effekt som steroidøstrogenerne. Disse utilsigtede østrogener kaldes xeno-østrogener. Her er vist de vigtigste xeno-østrogener i miljøsammenhæng. Nonylphenol og octylphenol er nedbrydningsprodukter fra detergenter og bisphenol A stammer fra en række plastprodukter.
Hvad er så effekten af østrogener i vandmiljøet. Der er to typer af effekter: De kan stimulere syntese af vitellogenin og de kan forstyrre kønsdifferentieringen. Disse effekter kan forårsages både af steroidøstrogener og xeno-østrogener.
Begge typer af effekter blev fundet i vandløb i Århus amt tilbage i 2001. Den rapport der er vist her på skærmen beskriver forekomsten af østrogeneffekter i både ørreder og skaller. Desuden er der foretaget målinger af koncentrationer af alle de seks østrogener, jeg omtalte før. Desværre konkluderede rapporten at årsagen til påvirkningen af fisk var ukendt.
Miljøministeren udtalte at han ikke ville gøre noget fordi det ikke var kendt hvilket stof, der forårsager effekterne.
Jeg mener det er uholdbart at afskære sig fra at forske i og finde en løsning på et problemet fordi man ikke kan overskue det. Derfor har jeg formuleret tre spørgsmål. Er der tilstrækkeligt høje koncentrationer af nogle af østrogenerne tilstede til at forklare effekterne i vandmiljøet. Hvilke østrogener er vigtigst i vandmiljøet. Hvordan kan problemet løses. Jeg springer straks videre til at svare på de to første spørgsmål.
Jeg kunne komme et pænt stykke allerede fra skrivebordet. Der er en mængde artikler i litteraturen om hvilken koncentration der giver effekter ved eksponering af forskellige fisk for hver af østrogenerne. Det vil jeg sammenligne med koncentrationerne i udløbene fra renseanlæggene for hvert østrogen.
Jeg lavede først denne sammenligning i forbindelse med folketingets høring om ”hormonforstyrrende stoffer” i april 2002. Denne høring blev afholdt som følge af fundene af østrogenpåvirkede fisk i Århus amt. På det tidspunkt forelå to serier af målte koncentrationer. Dels resultater fra Århus amts rapport om fundet af forstyrrede fisk. Dels en lille undersøgelse jeg selv har lavet. Det ses at middelkoncentrationerne generelt er under detektionsgrænsen, så vi må basere os på maksimumkoncentrationer. De laveste effektkoncentrationer der var beskrevet ses i den midterste søjle. Til højre ses forholdet mellem de to koncentrationer. Det ses at både østron, østradiol og ethinyløstradiol findes i højere koncentration i udløbsvandet end effektgrænsen for fisk. Denne betragtning sivede hurtigt og man kunne i månederne efter se denne pointe gentaget i medierne.
Efter høringen opstod muligheder for nye projekter, så jeg kunne udebygge datagrundlaget ved analyser finansieret fra forskellige kilder. Århus amt lavede en opfølgende undersøgelse af lokaliteten Voel bæk hvor de havde fundet mange påvirkede fisk. Miljøstyrelsen lavede en undersøgelse af indløb og udløb til tre renseanlæg. Endelig lavede vi på DFU en undersøgelse af flest mulige renseanlæg over hele landet. Det ses at tendensen til at middelkoncentrationerne er under detektionsgrænsen er generel gennem alle undersøgelser.
Jeg fandt også landsdækkende data for xeno-østrogener. Der er omtrent 90 forskellige renseanlægsudløb i analyseserien. De er ikke meget forskellige fra Århus amts dataene.
Ved at kombinere alle data fås et billede af situationen baseret på alle data der er tilgængelige. Det ses at ethinyløstradiol er det vigtigste. Østron er næst, men tæt fulgt af østradiol. De tre xenoøstrogener er mindre vigtige.
For at kunne undersøge renseanlægs omsætning af sterooidøstrogener kræves analysemetoder. Jeg har lavet metoder til råt spildevand og til slam fra renseanlæg.
Jeg tog udgangspunkt i den metode til vandprøver som jeg i forvejen har anvendt. Vandprøver tilsættes en standard. Ekstraheres på en C18 kolonne. Ekstraktet oprenses med silikagel og der tilsættes endnu en standard inden analysen med GC-iontrap. Metoden kan imidlertid ikke anvendes på de anderledes og kraftigere matrice belastede prøver fra renseanlæggebe.
Her ses problemet Den problematiske matrice er således lipofil. Der satses på at der faktisk er tale om lipider.
Det er klassisk at oprense lipider med GPC, som står for Gel Permation Chromatografi. Det kaldes også størrelseskromatografi. Hvis der indføres GPC i vandmetoden fås en metode der er robust for råt spildevand. Samme oprensningsmetode viste sig også at være effektiv til at oprense solventekstrakter af slam. Jeg kan ikke på den tid der er til rådighed for foredraget nå at vise metodeevalueringen af disse metoder, men jeg vil gerne fortælle lidt om den databehandling som sikrer den høje kvalitet af analyserne. Inden vi går videre fra oversigten fra metoden skal i bemærke at der anvendes to standarder i løbet af prøveoprensningen.
Fordi der anvendes iontrap MS-MS kan fittet af et komplet datterion massespektre testes mod et reference spektre. Dette sker elektronisk ved en procedure der beregner den procentvise match mellem spektrene. Desuden testes de to vigtigste datterioners ioners indbyrdes forhold.
Desuden testes kvaliteten af hele prøvebehandlingen ved anvendelse af to parametre. ….. Begge parametre sammenlignes med middelværdien på standarderne der blev anvendt til standardkurven.
Standardkurven laves ved spiking i kildevand. Dvs. standarderne behandles over hele kurven. Her er vist en idealiseret standardkurve. Bemærk at under et vist niveau er der ikke noget signal fordi datterionmassespektret ikke har tilstrækkelig god kvalitet til at blive kvalificeret som analytisk signal. Vi definerer kvantifikationsgrænsen (LOQ) som det andet laveste punkt på den lineare del af standardkurven. Som en ekstra test sammenlignes signalet på dette punkt med baggrunsstøjen på ægte prøver. (Peak to Peak)
Før vi bevæger os videre til undersøgelsen af renseanlægget vil jeg gerne gennemgå nogle generelle pointer om om teorien omkring steroidøstrogener i renseanlæg og hvordan et moderne renseanlæg fungerer.
Mennesker udskiller ikke steroidøstrogener. Steroidøstrogener er for lipofile til at kunne udskilles over nyrerne. Derfor omdannes de til konjugerede forbindelser, ved at et enzym i kroppen sætter et sukker eller sulfatmolekyle på en hydroxygruppe. De resulterende stoffer kaldes konjugater eller konjugerede østrogener. Da de er anioner er vandopløseligheden høj og lipofiliciteten lav. De kan derfor udskilles i urinen. Konjugaterne kan spaltes så østrogenerne gendannes. Det sker både enzymatisk og ved sur hydrolyse. Der findes en række forskellige konjugater i det alle hydroxygrupper kan kobles med de to molekyler. F. eks. østradiol i begge ender.
Hvis vi zoomer ind på renseanlægget er der tale om tre typer reaktion som steroidøstrogener indgår i. Dekonjugering som gendanner østrogenet. Nedbrydning som fjerner steroidøstrogenerne. Sorption som er en reversibel proces.
Vi ser her en oversigt over steroidøstrogeners miljøkemi i forbindelse med eksponering af vandmiljøet gennem renseanlæg. Steroidøstrogener omdannes i kroppen til konjugerede østrogener, som udskilles i urinen. De konjugerede østrogener spaltes i kloakken og i renseanlægget i overvejende grad til frie steroidøstrogener. De frie østrogener nedbrydes herefter, i varierende grad efter forholdene, eller løber videre ud i vandmiljøet. I vandmiljøet har alle flercellede dyr østrogenreceptorere og forskellig følsomhed for østrogenpåvirkning.
Jeg har valgt at lave et studie af Wiesbaden renseanlæg. Wiesbaden renseanlæg er et af de første renseanlæg man har analyseret steroidøstrogener fra. Det plejer at have betydelige koncentrationer i udløbet. Da jeg målte en prøve i juni 2001 i forbindelse med at jeg hentede forskellige prøver til brug for metodeudvikling var østrogen væk. Da jeg var på anlægget var det tydeligt at der lige var afsluttet en ombygning. I den forbindelse var anlægget blevet udvidet med rensetrin for denitrifikation og biologisk fosfatfjernelse.
Her set et diagram af Wiesbaden renseanlæg fra november 2001. Vandets opholdstid er 48 timer i hele anlægget og heraf er 24 timer i aktivt slamanlægget. Aktiv slamanlægget er de tre tanke biofosfat, denitrifikation og nitrifikation, der ses øverst i midten. Vandet løbet fra venstre til højre i diagrammet. Det er vigtigt at bemærke at det cirkulerer 2-4 gange i aktiv slam anlægget Denne recirkulering har til formål at bringe nitrat tilbage til det organiske materiale. Der er to typer slam i anlægget. Stof fra primær sedimentation og overskydende aktivt slam. Det blandes og stabiliseres før fjernelse. I forbindelse med stabiliseringen af slammet frigives en del vand som pumpes tilbage i anlægget. Før ombygningen fandtes Denitrifikationstanken ikke og driften var vekslende for at få delvis denitrifikation. Slamopholdstiden var dengang under 6 dage mod nu 11-13 dage. Bemærk at prøveudtagningspunkter er angivet med sorte og hvide cirkler. De flow proportionale prøver er kun analyseret for østrogener i vandfasen, mens grab prøverne er adskilt i vand og slam som er analyseret separat.
Vandprofil: Der ses et fald med renseprocessen i de første trin. Man skal imidlertid tage højde for fortynding i biofosfattanken til omkring 1/3. Det ses tydeligt at koncentrationerne i dette trin falder mindre. Forklaringen kan være spaltning af konjugerede østrogener. – Det kommer jeg tilbage til i en massestrømsanalyse. Bemærk tilbageløbet fra slambehandlingen har høj østrogen. Slamprofil: Koncentrationer i slam fra vandbehandlingen er omtrent ens hvilket viser at tab i vandfasen ikke i nævneværdig grad skyldes sorption. I øvrigt ses høje koncentrationer i slam fra slambehandlinsgsanlægget. Det skyldes primær slam og at biomassen falder ved udrådningen.
Jeg har omregnet koncentrationerne af steroidøstrogener til massestrømme ved at gange med voluminerne afvand der flyder i gennem rensetrinnene. Desuden er de to naturlige østrogener lavet om til en sum fordi de hurtigt omdannes indbyrdes. Det ser ud som om der sker en væsentlig forøgelse af mængden af naturlige steroidøstrogener i biofosfat tanken. Det skyldes formodentlig spaltning af glucoronider. Det kommer jeg tilbage til lidt senere. I denitrifikationstrinnet nedbrydes naturlige steroidøstrogener derimod tilsyneladende fuldstændigt.
Beregningen af massestrømme er også foretaget for ethinyløstradiol. Der ses et stort tab i det første sedimentationstrin som ikke blev observeret for de naturlige østrogener. Sorption til primær slam er åbenbart vigtigere end for de naturlige. Man kunne naturligvis også forestille sig at der foregik nedbrydning i sedimentationstanken, men fra batchforsøg med slam fra anlægget blev der fundet langsommere nedbrydning af EE2 end de naturlige Ø. Resten af fjernelsen sker gradvist over alle rensetrin så der kan ikke identificeres proces forhold som er særligt favoirable for nedbrydningen.
Det næste trin I fortolkningen af dataene er en mere avanceret massebalance. Nu prøver jeg at medtage sorberede koncentrationer. Desuden har jeg tilføjet en estimeret mængde konjugerede østrogener I indløbet baseret på gennemsnitskoncentrationer fra en tysk artikel af Adler et al. (2001). Der har fundet at 65% af totalkoncentrationen er konjugert I indløbet. Denne mere avancerede massebalance viser at under 1 % af naturlige østrogener ender i udløbet og omkring 4 % ender i slammet.
Den samme avancerede massebalance for ethjinyløstradiol bliver lidt anderledes fordi kun 35% af total ethinyløstradiol er konjugeret. MAssebalancen viser at under 10 % ender i udløbet og under 4 % ender i slammet. Det bemærkes at en væsentig større andel cirkulerer med slammet i forhold til de naturlige østrogener.
Det der er ændret i Wiesbaden renseanlæg ved ombygningen er slamretentionstiden. Dvs. hvor længe bakterierne for lov at udvikle sig. Desuden er kontakttiden mellem vand og bakterier forøget.
Voel Bæk var med i Århus undersøgelsen. I denne lille bæk løber et renseanlæg ud – men SØ koncentrationerne er høje opstrøms for renseanlægget. I denne opfølgning måles koncentrationer i drænrør som er forbundet med septiktanke. Bingo!
En sidste ting jeg vil vise inden vi går videre til renseanlægget er en skitse af de generelle strømme af vand og slam i et renseanlæg. Der er to typer slam i anlægget. Stof fra primær sedimentation og overskydende aktivt slam. Det blandes og stabiliseres før fjernelse. Vandet løber desuden ikke direkte gennem anlægget men cirkulerer et par gange i aktiv slam anlægget for at bringe nitrat tilbage til det organiske materiale.
![Forurening af vandmiljøet med steroidøstrogener Henrik Andersen Adjunkt Institut for Analytisk Kemi Danmarks Farmaceutiske Universitet [email_address]](https://image.slidesharecdn.com/20040323foredragtilphdforsvar-13034197846212-phpapp02/85/PhD-thesis-defence-1-320.jpg)
![Indhold af foredraget ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP///yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7)