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EFEITOS DE QUITOSANA NO CONTROLE DE
       DOENÇAS PÓS COLHEITA E
 RESPOSTAS FISIOLÓGICAS EM FRUTOS DE
                TOMATE


            Ernane Nogueira Nunes
     Mestrando em Agronomia – CCA-UFPB


                Areia – PB
                  2012
EFFECTS OF CHITOSAN ON CONTROL OF
       POSTHARVEST DISEASES AND
PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF TOMATO FRUIT
AUTORES: Jia Liu, Shiping Tian, Xianghong Meng, Yong Xu;

PERIÓDICO: Postharvest Biology and Technology 44 (2007)
300–306

Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular
Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of
Sciences, Nanxingcun 20, Xiangshan, Haidian, Beijing
100093, China.

                        Areia – PB
                          2012
INTRODUÇÃO

• Pós colheita: responsável por grandes perdas de frutas
  e hortaliças (chegando até 40%);

• Fungicidas sintéticos:
 ▫   Ainda são as melhores alternativas;
 ▫   Preocupação internacional;
 ▫   Patógenos resistentes;
 ▫   Novas alternativas.
INTRODUÇÃO


• QUITOSANA                 (N-acetil-d-glucosamina):
  Polissacarídeo derivado da carapaça (quitina) de
  crustáceos;

• É natural, possui efeitos antifúngicos e estimulante de
  respostas de defesa nos vegetais (Terry e Joyce, 2004);

• Puccinia     arachidis    Speg.     (Sathiyabama   e
  Balasubramanian, 1998), Alternaria alternata (Fr.)
  Keissler (Reddy et al., 1998) e Aspergillus niger V.
  Tiegh. (Plascencia-Jatomea et al., 2003).
INTRODUÇÃO
• Através de pesquisas anteriores sabe-se que a quitosana
  aumentou a atividade da fenilalanina amônia liase (PAL) em
  bagas de uva (Romanazzi et al, 2002); (BIOSSÍNTESE DE
  FLAVONOIDES E LIGNINA)

• Quitinase e 1,3-glucanase em laranjas, morangos e
  framboesas (Fajardo et al, 1998;. Zhang e Quantick, 1998);
  (ESTÍMULOS A DEFESA VEGETAL)

• Quitosana apresentou efeitos em B. cinerea e P. expansum
  em frutos de cereja doce e morango (Romanazzi et al., 2003)
  em cítros (Reddy et al., 2000);

• Estudos recentes indicam resistência dos fungos.
OBJETIVO
Investigar os efeitos da quitosana no controle do mofo
cinzento e mofo azul, causada por B. cinerea e P.
expansum, em frutos de tomate armazenados a
diferentes temperaturas e o desencadeamento de
marcadores de defesa, incluindo polifenoloxidase
(PPO), peroxidase (POD) e compostos fenólicos.




         B. cinerea                P. expansum
MATERIAL E MÉTODOS


• Os frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill)
  foram colhidas no estádio vermelho maduro;

• Classificados com base no tamanho e na ausência de
  lesões físicas ou doença de infecção;

• Antes dos tratamentos, os frutos foram desinfetados
  com hipoclorito de sódio a 2% durante 3min, e em
  seguida enxaguados com água corrente e secos ao
  ambiente.
MATERIAL E MÉTODOS
• B. cinerea e P. expansum foram isolados a partir de
  frutos infectados de tomate e cultivados em BDA a
  25◦C;

• Os esporos de ambos os agentes patogênicos foram
  removidos a partir de 2 semanas de idade e suspensas
  em 5ml de água destilada estéril contendo 0,05%(v/v)
  de Tween 80, como solubilizante;

• As suspensões foram filtradas através de quatro
  camadas de gaze estéril, de modo a aderir os micélios.
MATERIAL E MÉTODOS
• Quitosana com desacetilação de 90% e uma
  viscosidade de 15cP foi obtido a partir do Ocean
  University of China;

• Dissolvido em 2%(w/v) em HCl a 1% sob constante
  agitação;

• Depois diluiu-se a: 0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5% e
  1%, com o valor do pH de cada solução ajustado para
  5,4 com NaOH.
MATERIAL E MÉTODOS
• Foram preparadas 50 placas de Petri para cada fungo (60
  mm de diâmetro) com 10ml BDA e com os conídios a
  1×106spores/mL-1,      que      continham       diferentes
  concentrações (0%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5% e 1%) de
  quitosana, com posterior incubação a 25◦C por 12h;

• Discos de micélio (5mm de diâmetro) a partir de 2
  semanas de idade, foram colocados no centro de placas de
  Petri (90 mm de diâmetro) com 20mL de BDA, contendo
  diferentes    concentrações    de      quitosana     em
  seguida, incubadas a 25 ◦C.

• O crescimento micelial foi determinado medindo o
  diâmetro das colónias 3 dias após a inoculação.

• Cada tratamento foi repetido três vezes e a experiência foi
  repetida duas vezes.
MATERIAL E MÉTODOS: Ensaio de
integridade da membrana plasmática dos
esporos
 ▫ As amostras foram inoculadas em meio de cultura PDA
   diluídas a 5×105spores/mL-1 e depois centrifugadas a
   200rpm durante 10 min a 25◦C e lavadas duas vezes com
   tampão 5omM de fosfato de sódio (pH 7,0) para remover
   meio residual.

 ▫ As suspensões de conídios foram coradas com 10 µgml-1
   de iodeto de propídio(PI), durante 5 min a 30 ◦ C.
MATERIAL E MÉTODOS: Efeitos da quitosana
nos frutos
• De acordo com dados não mostrados foram escolhidas as concentrações de
  0,5% e 1%;

• Os frutos foram feridos com o auxílio de um prego estéril (3mm de
  profundidade e 3mm de largura);

• TRATAMENTOS: 0,5% de quitosana (15µL), 1% de quitosana (15µL) e água
  destilalada (15µL) nos ferimentos;

• Depois 4 horas, 5µL de uma suspensão de esporos de B. cinerea e P.
  expansum a 5×103 spores/mL-1 foram adicionados a cada ferida;

• Os frutos tratados foram colocados em caixas estéreis para manter uma
  umidade relativa (cerca de 95%) e armazenados a 25◦C e 2◦C;

• Verificação da incidência de podridões: 3 e 21 dias após a inoculação;

• Tratamento: 3 repetições e o Experimento: 2 vezes.
MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do
PPO, POD e compostos fenólicos
• Frutos de tomate foram feridos e 15µL de 1% de quitosana
  foram adicionados a cada ferida, com agua destilada
  adicionada servindo como controle;

• Após o tratamento, os frutos foram divididos
  aleatoriamente em dois lotes: 25◦C e 2◦C;

• Foram retiradas amostras de polpa em torno das feridas de
  10 frutos a 0, 1, 2 e 3 dias a 25◦C e aos 0, 7, 14 e 21 a 2◦ C;

• Cada tratamento continha três repetições e a experiência
  foi repetida duas vezes.
MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do
PPO, POD e compostos fenólicos
• As amostras de tecido (2g) de cada tratamento foram
  homogeneizados com 10ml de 100 mM de solução tampão
  de fosfato de sódio (pH 6,4) contendo 0,2g de polivinil
  polipirrolidona (PVPP) e terra a 4◦C;

• O homogeneizado foi centrifugado a 15000 × g durante 30
  min a 4◦C e o sobrenadante foi utilizado para o ensaio;

• Atividade PPO foi determinada através da adição de 0,1ml
  de enzima preparada em 3,0mL de substrato catecol
  (500mM, 100mM em tampão fosfato de sódio, (pH6.4) e o
  aumento da absorvância em 398nm foi verificada.
MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do
PPO, POD e compostos fenólicos
• A atividade de POD foi determinada utilizando
  guaiacol como substrato (Ippolito et al., 2000);

• A mistura de reação consistiu em 0,1ml de extrato
  bruto, 2mL de guaiacol (8mM, de sódio 100mM
  tampão de fosfato, pH 6,4), incubou-se durante 30
  min a 30◦C;

• O aumento da absorvância a 460nm foi medida após a
  adição de 1mL H2O2 (24mM).
MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do
PPO, POD e compostos fenólicos
• 1g de polpa de cada 10 frutos foram homogeneizadas
  com 20mL de gelo á 1% de HCl metanol-solução e em
  seguida centrifugou-se a 15000 × g durante 15 min a
  4ºC.

• O sobrenadante foi recolhido e a absorbância foi
  medida a 280nm.
MATERIAL E MÉTODOS: Análises estatísticas
• Todas as análises estatísticas foram realizadas com o SPSS
  11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

• Os dados do ensaio de membrana de plasma integridade
  foram comparados independente-amostras teste t.

• Demais análises foram analisadas através da ANOVA.

• Teste de médias realizadas através do teste de Duncan (P
  <0,05).
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
CONCLUSÕES
• Os resultados evidenciaram que quitosana foi eficaz no
  controle do mofo cinzento (B. cinerea) e mofo azul (P.
  expansum) em frutos de tomate armazenados a 25◦C e
  2◦C, indicando que a temperatura de armazenamento teve
  pouca influência sobre os efeitos de controle de quitosana
  em doenças pós-colheita de frutos de tomate.

• Sendo o efeito da quitosana sobre mofo cinzento melhor
  do que no azul.

• Verificou-se que as atividades de PPO, POD e nível de
  compostos fenólicos em frutos tratados com quitosana
  aumentaram significativamente a 25◦C e 2◦C, o que
  confere propriedades de defesa.

• Quitosana tem potencial para substituir os fungicidas
  sintéticos, mas muitos estudos ainda são necessários.
MUITO OBRIGADO!



ernanenn@gmail.com
   (83) 9908 0650
EFEITOS DE QUITOSANA NO CONTROLE DE
       DOENÇAS PÓS COLHEITA E
 RESPOSTAS FISIOLÓGICAS EM FRUTOS DE
                TOMATE


            Ernane Nogueira Nunes
     Mestrando em Agronomia – CCA-UFPB


                Areia – PB
                  2012

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Efeitos da quitosana no controle de doenças pós colheita

  • 1. EFEITOS DE QUITOSANA NO CONTROLE DE DOENÇAS PÓS COLHEITA E RESPOSTAS FISIOLÓGICAS EM FRUTOS DE TOMATE Ernane Nogueira Nunes Mestrando em Agronomia – CCA-UFPB Areia – PB 2012
  • 2. EFFECTS OF CHITOSAN ON CONTROL OF POSTHARVEST DISEASES AND PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF TOMATO FRUIT AUTORES: Jia Liu, Shiping Tian, Xianghong Meng, Yong Xu; PERIÓDICO: Postharvest Biology and Technology 44 (2007) 300–306 Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Nanxingcun 20, Xiangshan, Haidian, Beijing 100093, China. Areia – PB 2012
  • 3. INTRODUÇÃO • Pós colheita: responsável por grandes perdas de frutas e hortaliças (chegando até 40%); • Fungicidas sintéticos: ▫ Ainda são as melhores alternativas; ▫ Preocupação internacional; ▫ Patógenos resistentes; ▫ Novas alternativas.
  • 4. INTRODUÇÃO • QUITOSANA (N-acetil-d-glucosamina): Polissacarídeo derivado da carapaça (quitina) de crustáceos; • É natural, possui efeitos antifúngicos e estimulante de respostas de defesa nos vegetais (Terry e Joyce, 2004); • Puccinia arachidis Speg. (Sathiyabama e Balasubramanian, 1998), Alternaria alternata (Fr.) Keissler (Reddy et al., 1998) e Aspergillus niger V. Tiegh. (Plascencia-Jatomea et al., 2003).
  • 5. INTRODUÇÃO • Através de pesquisas anteriores sabe-se que a quitosana aumentou a atividade da fenilalanina amônia liase (PAL) em bagas de uva (Romanazzi et al, 2002); (BIOSSÍNTESE DE FLAVONOIDES E LIGNINA) • Quitinase e 1,3-glucanase em laranjas, morangos e framboesas (Fajardo et al, 1998;. Zhang e Quantick, 1998); (ESTÍMULOS A DEFESA VEGETAL) • Quitosana apresentou efeitos em B. cinerea e P. expansum em frutos de cereja doce e morango (Romanazzi et al., 2003) em cítros (Reddy et al., 2000); • Estudos recentes indicam resistência dos fungos.
  • 6. OBJETIVO Investigar os efeitos da quitosana no controle do mofo cinzento e mofo azul, causada por B. cinerea e P. expansum, em frutos de tomate armazenados a diferentes temperaturas e o desencadeamento de marcadores de defesa, incluindo polifenoloxidase (PPO), peroxidase (POD) e compostos fenólicos. B. cinerea P. expansum
  • 7. MATERIAL E MÉTODOS • Os frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill) foram colhidas no estádio vermelho maduro; • Classificados com base no tamanho e na ausência de lesões físicas ou doença de infecção; • Antes dos tratamentos, os frutos foram desinfetados com hipoclorito de sódio a 2% durante 3min, e em seguida enxaguados com água corrente e secos ao ambiente.
  • 8. MATERIAL E MÉTODOS • B. cinerea e P. expansum foram isolados a partir de frutos infectados de tomate e cultivados em BDA a 25◦C; • Os esporos de ambos os agentes patogênicos foram removidos a partir de 2 semanas de idade e suspensas em 5ml de água destilada estéril contendo 0,05%(v/v) de Tween 80, como solubilizante; • As suspensões foram filtradas através de quatro camadas de gaze estéril, de modo a aderir os micélios.
  • 9. MATERIAL E MÉTODOS • Quitosana com desacetilação de 90% e uma viscosidade de 15cP foi obtido a partir do Ocean University of China; • Dissolvido em 2%(w/v) em HCl a 1% sob constante agitação; • Depois diluiu-se a: 0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5% e 1%, com o valor do pH de cada solução ajustado para 5,4 com NaOH.
  • 10. MATERIAL E MÉTODOS • Foram preparadas 50 placas de Petri para cada fungo (60 mm de diâmetro) com 10ml BDA e com os conídios a 1×106spores/mL-1, que continham diferentes concentrações (0%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5% e 1%) de quitosana, com posterior incubação a 25◦C por 12h; • Discos de micélio (5mm de diâmetro) a partir de 2 semanas de idade, foram colocados no centro de placas de Petri (90 mm de diâmetro) com 20mL de BDA, contendo diferentes concentrações de quitosana em seguida, incubadas a 25 ◦C. • O crescimento micelial foi determinado medindo o diâmetro das colónias 3 dias após a inoculação. • Cada tratamento foi repetido três vezes e a experiência foi repetida duas vezes.
  • 11. MATERIAL E MÉTODOS: Ensaio de integridade da membrana plasmática dos esporos ▫ As amostras foram inoculadas em meio de cultura PDA diluídas a 5×105spores/mL-1 e depois centrifugadas a 200rpm durante 10 min a 25◦C e lavadas duas vezes com tampão 5omM de fosfato de sódio (pH 7,0) para remover meio residual. ▫ As suspensões de conídios foram coradas com 10 µgml-1 de iodeto de propídio(PI), durante 5 min a 30 ◦ C.
  • 12. MATERIAL E MÉTODOS: Efeitos da quitosana nos frutos • De acordo com dados não mostrados foram escolhidas as concentrações de 0,5% e 1%; • Os frutos foram feridos com o auxílio de um prego estéril (3mm de profundidade e 3mm de largura); • TRATAMENTOS: 0,5% de quitosana (15µL), 1% de quitosana (15µL) e água destilalada (15µL) nos ferimentos; • Depois 4 horas, 5µL de uma suspensão de esporos de B. cinerea e P. expansum a 5×103 spores/mL-1 foram adicionados a cada ferida; • Os frutos tratados foram colocados em caixas estéreis para manter uma umidade relativa (cerca de 95%) e armazenados a 25◦C e 2◦C; • Verificação da incidência de podridões: 3 e 21 dias após a inoculação; • Tratamento: 3 repetições e o Experimento: 2 vezes.
  • 13. MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do PPO, POD e compostos fenólicos • Frutos de tomate foram feridos e 15µL de 1% de quitosana foram adicionados a cada ferida, com agua destilada adicionada servindo como controle; • Após o tratamento, os frutos foram divididos aleatoriamente em dois lotes: 25◦C e 2◦C; • Foram retiradas amostras de polpa em torno das feridas de 10 frutos a 0, 1, 2 e 3 dias a 25◦C e aos 0, 7, 14 e 21 a 2◦ C; • Cada tratamento continha três repetições e a experiência foi repetida duas vezes.
  • 14. MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do PPO, POD e compostos fenólicos • As amostras de tecido (2g) de cada tratamento foram homogeneizados com 10ml de 100 mM de solução tampão de fosfato de sódio (pH 6,4) contendo 0,2g de polivinil polipirrolidona (PVPP) e terra a 4◦C; • O homogeneizado foi centrifugado a 15000 × g durante 30 min a 4◦C e o sobrenadante foi utilizado para o ensaio; • Atividade PPO foi determinada através da adição de 0,1ml de enzima preparada em 3,0mL de substrato catecol (500mM, 100mM em tampão fosfato de sódio, (pH6.4) e o aumento da absorvância em 398nm foi verificada.
  • 15. MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do PPO, POD e compostos fenólicos • A atividade de POD foi determinada utilizando guaiacol como substrato (Ippolito et al., 2000); • A mistura de reação consistiu em 0,1ml de extrato bruto, 2mL de guaiacol (8mM, de sódio 100mM tampão de fosfato, pH 6,4), incubou-se durante 30 min a 30◦C; • O aumento da absorvância a 460nm foi medida após a adição de 1mL H2O2 (24mM).
  • 16. MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do PPO, POD e compostos fenólicos • 1g de polpa de cada 10 frutos foram homogeneizadas com 20mL de gelo á 1% de HCl metanol-solução e em seguida centrifugou-se a 15000 × g durante 15 min a 4ºC. • O sobrenadante foi recolhido e a absorbância foi medida a 280nm.
  • 17. MATERIAL E MÉTODOS: Análises estatísticas • Todas as análises estatísticas foram realizadas com o SPSS 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). • Os dados do ensaio de membrana de plasma integridade foram comparados independente-amostras teste t. • Demais análises foram analisadas através da ANOVA. • Teste de médias realizadas através do teste de Duncan (P <0,05).
  • 25. CONCLUSÕES • Os resultados evidenciaram que quitosana foi eficaz no controle do mofo cinzento (B. cinerea) e mofo azul (P. expansum) em frutos de tomate armazenados a 25◦C e 2◦C, indicando que a temperatura de armazenamento teve pouca influência sobre os efeitos de controle de quitosana em doenças pós-colheita de frutos de tomate. • Sendo o efeito da quitosana sobre mofo cinzento melhor do que no azul. • Verificou-se que as atividades de PPO, POD e nível de compostos fenólicos em frutos tratados com quitosana aumentaram significativamente a 25◦C e 2◦C, o que confere propriedades de defesa. • Quitosana tem potencial para substituir os fungicidas sintéticos, mas muitos estudos ainda são necessários.
  • 27. EFEITOS DE QUITOSANA NO CONTROLE DE DOENÇAS PÓS COLHEITA E RESPOSTAS FISIOLÓGICAS EM FRUTOS DE TOMATE Ernane Nogueira Nunes Mestrando em Agronomia – CCA-UFPB Areia – PB 2012