Oral Méthode Expérimentale Loci CUT

Pretseille Emmanuelle
Master 1 MABS
UE EM7BMGEM - Méthodes
expérimentales et publication scientifique

Interactions plantes-microorganismes,
pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle

Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoir
pathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire,
Xanthomonas campestris pv campestris

Plan de la présentation

- Introduction
- Objectifs des expérimentations
- Étude de la cassette « Saccharose »
- Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359
- Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux
- Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356
- Discussions
- Bilan
Les symboles suivants indiquent les TPs
- Remerciements correspondant aux différentes parties
présentées :
- Références
1 2 3 4

Introduction

Sujet des Tps : Étude du pouvoir pathogène chez la bactérie phytopathogène,
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc)

Xcc & facteurs de pathogénicité

1
- Bacilles Gram -
- Membres des γprotéobactéries
- Responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées
- Bactérie à croissance lente 1

Colonies de Xcc
sur milieu solide riche
[Adapté de Blanvillain (2007)]

Introduction
Pore de la feuille Phase de
pénétration
dans la feuille
Vie à la surface
des feuilles

Dégradation de la
paroi végétale

Libération des
composants de la
paroi (pectine,
cellulose …) et du
saccharose (sucre
majeur chez les
végétaux).

Cycle de vie de la bactérie Xcc
[Adapté de Boulanger (2007)]

Introduction

Sujet des Tps : Étude du pouvoir pathogène chez la bactérie phytopathogène,
Xanthomonas campestris pv. Campestris (Xcc)

Xcc & facteurs de pathogénicité

- Bacilles Gram -
- Membres des γprotéobactéries
- Responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées
- Bactérie à croissance lente

- Étude des récepteurs TonB-dépendants (TBDR) →
Colonies de Xcc
clusters de gènes impliqués dans le transport et la sur milieu solide riche
dégradation de molécules végétales [Adapté de Blanvillain (2007)]

Loci CUT (carbohydrate utilization containing TBDR)

Objectifs des expérimentations

Différentes molécules végétales

Saccharose

Test de croissance 1
Construction de mutants 2
Étude d'expression
Étude d'un régulateur 4

Caractérisation du
locus Xcc3356-3359

Fonctionnement ?



Saccharose Pectine

2
Test de croissance 1 Conjugaison triparentale
Construction de mutants 2 Étude d'un promoteur 3
Étude d'expression 4

Caractérisation du Caractérisation du
locus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122

Fonctionnement ? Induction de Xcc0119?



Saccharose Pectine Cellulose

2
Test de croissance 1 Conjugaison triparentale Construction de mutants 3
Construction de mutants 2 Étude d'un promoteur 3 Conjugaison triparentale 4
Étude d'expression 4

Caractérisation du Caractérisation du Caractérisation
locus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122 du gène Xcc3534

Fonctionnement ? Induction de Xcc0119? Lien avec un locus CUT ?



Saccharose Pectine Cellulose

Test de croissance 1 Conjugaison triparentale Construction de mutants
Construction de mutants 2 Étude d'un promoteur Conjugaison triparentale
Étude d'expression

Caractérisation du Caractérisation du Caractérisation
locus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122 du gène Xcc3534

Fonctionnement ? Induction de Xcc0119? Lien avec un locus CUT?


- Introduction
- Discussions
- Bilan
Les symboles suivants indiquent les TPs
- Remerciements correspondants aux différentes parties
présentées :
- Références
1 2 3 4

Étude de la cassette « Saccharose »

État de l'art

3356 3357 3358 3359

Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose »
[Adapté de Bottin & all (2011)]

- Xcc3356, régulateur de la famille LacI
- Xcc3357, transporteur de la membrane interne
- Xcc3358, TBDR (transporteur de la membrane externe)
- Xcc3359, amylosucrase (saccharose hydrolase) Opéron

Étude de la cassette « Saccharose »

État de l'art

3356 3357 3358 3359

[Adapté de Bottin & all (2011)]

- Xcc3356, régulateur de la famille LacI
- Xcc3357, transporteur de la membrane interne
- Xcc3358, TBDR (transporteur de la membrane externe)
- Xcc3359, amylosucrase (saccharose hydrolase) Opéron

Fonctionnement ?

Cassette « Saccharose »
1
Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359

Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose
et MME+saccharose

Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant d'insertion sur 3359) et Xcc
i3359 complémenté


Xcc WT
Double recombinaison

Gène Xcc3359 uidA Gène rapporteur GUS
AmpR

Zone de recombinaison
homologue
oriT KanR
Plasmide pVO155
Xcc i3359 BleoR

Construction des souches mutantes de Xcc: exemple avec Xcc3359
[Extrait de Bottin & all (2011)]

1

Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et
MME+saccharose

i3359 complémenté

Résultats :
- Pousse identique des 3 souches sur MME+glucose
- Sur MME+saccharose,
- Xcc WT et Xcc i3359 complémenté : pousse normale;
- Xcc i3359 : aucune pousse.

1

Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et
MME+saccharose

i3359 complémenté

Résultats :
- Pousse identique des 3 souches sur MME+glucose
- Sur MME+saccharose,
- Xcc WT et Xcc i3359 complémenté : pousse normale;
- Xcc i3359 : aucune pousse.

Xcc3359 permet la pousse sur milieu saccharose.

Xcc3359 → utilisation du saccharose [ locus sux ]
Effet du saccharose sur les autres gènes du locus ?

2
Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux

Principe : Tester l'activité des promoteurs de différents gènes du locus sux
chez des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS

Cassette « Saccharose » 2

- Mutant d'insertion et GUS

Région promotrice Gène GUS Partie terminale de
Xcc335*
de Xcc335*

Dosage GUS et évaluation de l'activité d'un promoteur


- Mutant d'insertion et GUS

Région promotrice Gène GUS Partie terminale de
Xcc335*
de Xcc335*

- Réaction en jeu :

H 2O
PNPG + GUS Galactose + p-nitrophenol
37°C

- Calcul de l'activité

Activité GUS =
(DO415nm – 1,75*DO550nm) / (DO600nm*0,001*Volume(mL)*tps de réaction)

Dosage GUS et évaluation de l'activité d'un promoteur

2
Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux

Principe : Tester l'activité du promoteur de différents gènes du locus Sux chez
des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS

Souches utilisées : Xcc i3356, Xcc i3357, Xcc i3358 et Xcc i3359.

Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose

Résultats :


16

Act. GUS (Sac)/Act. GUS(Glu) 14 * 14

12

10

8

6

4

2
* 2,2
~1
~1
0

i3356 i3357 i3358 i3359

Histogramme des rapports « activité GUS (Saccharose) / activité GUS (Glucose) »
selon la souche mutante Xcc i335* considérée

2
Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus Sux

Principe : Tester l'activité du promoteur de différents gènes du locus Sux chez
des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS

Souches utilisées : Xcc i3356, Xcc i3357, Xcc i3358 et Xcc i3359.


Résultats :

- Xcc i3356 et Xcc i3357 avec activité similaire dans les 2 conditions.
- Activité GUS +++ pour Xcc i3358 et Xcc i3359 en milieu saccharose.

L'expression de Xcc3358 et Xcc3359 est induite par le
saccharose. Réponse à un signal végétal ?

Opéron Xcc3358-59 → rôle majeur dans la pathogénicité
Mécanisme de régulation ?

4
Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356

Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité
bêta-galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de
substrats différents.


Souches utilisées: Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358


- « Description » d'une souche utilisée

Xcc WT pl 750 prom 3358

Xcc sauvage Promoteur contrôlant
Plasmide pCZ750 LacZ dans la
avec le gène LacZ codant construction obtenue
pour la βGal

Dosage de la bêta galactosidase dans l'étude d'expression de gènes


- « Description » d'une souche utilisée

Xcc WT pl 750 prom 3358

Xcc sauvage Promoteur contrôlant
Plasmide pCZ750 LacZ dans la
avec le gène LacZ codant construction obtenue
pour la βGal

- Réaction en jeu 4

H2O
ONPG + βGal Galactose + ONP
28°C

- Calcul de l'activité

Activité(Unité Miller) = [(DO420nm-1,75*DO550)*1000]/[DO600*temps (min)*vol(mL)]

Dosage de la bêta galactosidase dans l'étude d'expression de gènes

4

Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité bêta-
galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats
différents..

Milieux de culture : MME+glucose et MME+saccharose

Souches utilisées : Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358

Résultats:


14000

~ 11000
12000 Milieu Saccharose
Activité βGal (en unité Miller)

10000
Milieu Glucose

8000

6000

4000

Histogramme des activités
2000

< 1000 βgalactosidase selon le
milieu de culture et
0
la souche testée

Xcc WT Xcc i3356

4

Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité bêta-
galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats
différents.

Milieux de culture : MME+glucose et MME+saccharose

Souches utilisées : Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358

Résultats:
- Activité βGal Xcc WT + en milieu Saccharose.
- Activité βGal +++ pour Xcc i3356 quelque soit le milieu.

Xcc3356 est un répresseur des gènes du locus sux.

Rôle de Xcc3357 ? Régulation ?
Tests de pathogénicité sur les mutants d'insertion ?


- Introduction
- Discussions
- Bilan
- Remerciements
- Références

Discussions

Utilisation du
Répresseur saccharose par Xcc

3356 3357 3358 3359

Induction

[Adapté de Bottin & all (2011)] Saccharose

Discussions

Utilisation du
Répresseur saccharose par Xcc

3356 3357 3358 3359

Induction

[Adapté de Bottin & all (2011)] Saccharose

- Perspectives :
- Tests de pathogénicité sur plantes
- Etude du transport du saccharose par Xcc3357 et Xcc3358
- Phylogénie : origine ? avantage évolutif ? adaptation à l'environnement ?

Discussions

Transporteur
saccharose
(TBDR)

Interaction
Saccharose =
saccharose-
substrat de
répresseur
l'enzyme
→ induction
des gènes

Modèle du locus CUT fonctionnel basé sur le locus sux de Xcc
[Adapté de Blanvillain & all (2007)]

Discussions

Locus Xcc0117-0122
Bilan des expérimentations :
- Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de Xcc0119
- Étude de ce promoteur par dosage de l'activité βGal du mutant et du WT
en milieu Glucose et PGA

Activité +++ en présence de PGA

Induction de l'expression de Xcc0119 en milieu PGA.

Discussions

Locus Xcc0117-0122
- Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de Xcc0119
- Étude de ce promoteur par dosage de l'activité βGal du mutant et du WT
en milieu Glucose et PGA

Activité +++ en présence de PGA

Induction de l'expression de Xcc0119 en milieu PGA.

0118 0119 0120 0121 0122

Deoxygluconate TBDR TBDR Pectin Methyl Pectate
kinase Esterase Lyase

Induction
Locus CUT putativement impliqué dans le
métabolisme de la pectine chez Xcc
PGA [Adapté de Bottin & all (2011)]

Discussions

Gène Xcc3534
- Construction d'un mutant d'insertion dans Xcc3534 par conjugaison
triparentale et vérification par PCR/ gel d'électrophorèse

Obtention de mutants.

Discussions

Gène Xcc3534
- Construction d'un mutant d'insertion dans Xcc3534 par conjugaison
triparentale et vérification par PCR/ gel d'électrophorèse

Obtention de mutants.

Suite des investigations:
- Tests de croissance sur milieu Glucose et Cellulose du mutant d'insertion
dans Xcc3534
- Analyse fonctionnelle des gènes voisins de Xcc3534

CorA cycA 3354 3355 (hyp) pheC

Transporteurs Transporteur de
Enzymes du catabolisme
membranaires la membrane
de la cellulose
externe

Gènes voisins de Xcc3354 : un locus hypothétique dédié à la cellulose

Bilan

Caractérisation en cours de trois loci CUT probables

Locus sux Locus pectine Locus cellulose

Bilan



Lien entre TBDRs et l'utilisation des molécules végétales par Xcc

Bilan



Lien entre TBDRs et l'utilisation des molécules végétales par Xcc

- Meilleure compréhension de l'adaptation plantes/MO
- Moyen de lutte contre les bactéries phytopathogènes
- Applications industrielles (clarification des jus de fruits, biocarburant ...)

Remerciements

Mes remerciements s'adressent à :

- l'ensemble des professeurs de cette unité d'enseignement, Martine
Lautier, Arnaud Bottin, Christophe Jacquet et Elisabeth Crosnier ;

- à mes camarades du parcours alternatif en particulier à ma binôme,
Anne-Laure Brasset;

- aux préparateurs/préparatrices des salles où nos travaux pratiques
ont eu lieu.

Références bibliographiques
Blanvillain S (2007) Etude des récepteurs TonB-dépendants et d'un nouvel effecteur de type III
de la bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris pv. campestris. Doctorat de
microbiologie. Université Paul Sabatier. Toulouse.

Blanvillain S, Meyer D, Boulanger A, Lautier M, Guynet C, Denancé N, Vasse J, Lauber E &
Arlat M (2007) Plant Carbohydrate Scavenging through TonB-Dependent Receptors: A
Feature Shared by Phytopathogenic and Aquatic Bacteria. PLoS One. 2(2):e244.

Bottin A, Lautier M & Jacquet C (2011) Méthodes expérimentales et publication scientifique :
interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène, régulation transcriptionnelle. Master
MABS - UE EM7BMGEM. Université Paul Sabatier. Toulouse.

Boulanger A (2007) Analyse d'un nouveau système CUT impliqué dans l'acquisition et
l'utilisation du N-acétylglucosamine par Xanthomonas campestris pathovar campestris.
Doctorat de microbiologie. Université Paul Sabatier. Toulouse.

Brasset AL (2011) Analysis of the pathogenicity and transcriptional regulation of the pathogen
Xanthomonas campestris pv. campestris. Master MABS. Université Paul Sabatier. Toulouse.

NCBI (2011) Fiche Gene XCC3534 1,4-beta-cellobiosidase (ID: 1000107)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1000107

Références des illustrations
(Classées selon leur ordre d'apparition)

- http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Crucifers/BlackRot_Cruc/BR_CrucFS4.jpg
- http://www.omafra.gov.on.ca/IPM/images/brassica/diseases/black-rot-cabbage_zoom.jpg

Annexe 1 : Conjugaison triparentale
2 Transfert par conjugaison du promoteur du gène Xcc0119

3 Construction d'un mutant d'insertion dans le gène Xcc3534

Présentation des souches

Bactérie donneuse Bactérie cible
E. coli avec
pVO 155 + 300b de Xcc 3534
Xcc WT
(Kan R)
(Rif R)

Souche « helper »
Plasmide vecteur E. coli avec Bactérie
PRK 600 non transformable
(Spectinomycine R)

Plasmide « helper »

Conjugaison triparentale

Culture des souches

Culture sur milieu Moka (milieu riche)

Transfert du vecteur « helper »
dans la souche donneuse puis Culture sur milieu Moka et ATB :
conjugaison vers Xcc Rifampicine et Kanamycine

Xcc avec
pVO 155 + 300b de Xcc3534
(Rif R et Kan R) Sélection des clones Rif R et Kan R

Xcc i3534

3
Annexe 2 : PCR sur colonies chez Xanthomonas 4

Référence : Chez E. coli, suspension d'une colonie dans de l'eau stérile puis ajout
du mix PCR.
Non applicable chez Xanthomonas !

Adaptation du protocole

- Mise en suspension d'une colonie dans le l'eau stérile
- Lyse des bactéries !

Tampon de lyse au PEG

Obtention d'un « jus Xcc » (ADN)

- Mix PCR (eau, tampon vert, dNTPs, Taq pol, oligo 1 et oligo 2)
- Cycle/Programme PCR
- Révélation taille du fragment obtenu → électrophorèse sur gel

http://www.sesep.uvsq.fr/formation/PCR4.jpg
PCR sur Xcc

Vitesse GoTaq :
1 min/ kb

Schéma bilan de la PCR

Annexe 3 : Analyse de gel d'électrophorèse
3 Electrophorèse sur gel d'agarose des PCRs réalisées sur Xcc WT
pl750 et Xcc pl 750 + prom 119
4 Electrophorèse sur gel d'agarose des PCRs réalisées sur Xcc WT pVO155
et Xcc pVO155 + Xcc3534 (= mutant d'insertion)

DNA Clones testés
ladder
(en pb)

10000
8000
6000 Fragment d'intérêt à 1kb
5000
4000
3000
2500 PCR ayant amplifiée le promoteur du
2000 gène Xcc0119 de 1kb
1500 → taille correspondante
1000
750
500

Validation des clones obtenus

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