DESENVOLVIMENTO DE SCAFFOLDS À BASE
DE NANOFIBRAS PARA TRATAMENTO DE
DOENÇAS ÓSSEAS
Daniela Sofia Rodrigues Figueira
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Trabalho apresentado no âmbito da unidade curricular de Projeto em
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O presente trabalho é da exclusiva responsabilidade da autora:
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ABSTRACT
Worldwide, degenerative bone diseases and fractures are known to affect
millions of people. Poor eating habits ...
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1. Estado da Arte 6
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1.2. Doenças Ósseas 6
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1.ESTADO DA ARTE
1.1. CARACTERIZAÇÃO DO OSSO
O tecido ósseo é um material compósito formado por uma fase orgânica e por
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O tratamento de fraturas através de artoplastia total da anca (ATA) é comum há
vários anos em ambiente clínico. A ATA é ...
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células são depois semeadas no scaffold, levando à produção de matriz extracelular
sob condições controladas. Posteriorm...
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Dada a sua simplicidade e acessibilidade relativamente aos demais métodos, o
electrospinning é considerado o método mais...
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Tendo em conta a importância do desenvolvimento de substitutos capazes de
colmatar falhas no processo de re...
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3.TAREFAS
TAREFA 1 - PRODUÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE SCAFFOLDS TRIDIMENSIONAIS ATRAVÉS DE
ELECTROSPINNING.
A primeira tarefa c...
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TAREFA 2 – PREPARAÇÃO DE UM COCKTAIL DE FATORES DE CRESCIMENTO.
Esta tarefa consiste na preparação de um cocktail de fa...
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TAREFA 3 – CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BIOLÓGICA DO SCAFFOLD FINAL.
As nanofibras de PCL e Col, constituintes do sc...
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ser aplicado a lesões do tecido ósseo. Para quantificar a viabilidade celular em
contacto com o scaffold irá utilizar-s...
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4.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 Beachley, V., & Wen, X. (2010). Polymer nanofibrous structures: Fabrication,
biofunction...
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 Salgado, A. J., Coutinho, O. P., & Reis, R. L. (2004). Bone tissue engineering: state
of the art and future trends. M...
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5.ANEXO
Fig.1 – Estrutura hierárquica do osso de acordo com as suas dimensões (adaptado
de Murugan et al, 2005).
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Figura 3- Representação esquemática da implantação de scaffolds a partir do
isolamento e expansão de células ex vivo qu...
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VERSÃO-FINAL_PROJETO-1

  1. 1. DESENVOLVIMENTO DE SCAFFOLDS À BASE DE NANOFIBRAS PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS ÓSSEAS Daniela Sofia Rodrigues Figueira Nº28555 Projeto em Bioquímica Orientador: Tiago Correia, MS.c. Covilhã, junho de 2014
  2. 2. 2 Trabalho apresentado no âmbito da unidade curricular de Projeto em Bioquímica.
  3. 3. 3 O presente trabalho é da exclusiva responsabilidade da autora: ____________________________________________ (Daniela Sofia Rodrigues Figueira)
  4. 4. 4 ABSTRACT Worldwide, degenerative bone diseases and fractures are known to affect millions of people. Poor eating habits or aging are, among other things, responsible for decreasing the regenerative capacity of bone tissue. In recent years, the treatment for these problems has been achieved through the use of bone graft or prosthesis. However, these alternatives present certain limitations both in functional terms and in terms of effectiveness. To this purpose, structures called scaffolds, on which bone tissue can be repaired and regenerated are being devoloped. Thus, this work proposes the development of a scaffold comprising a double layer of nanofibers produced by electrospinning. The inner layer will be composed by polycaprolactone (PCL) and will give structure to the scaffold. In order to create an adequated microenvironment for bone regeneration, a cocktail of growth factors will be incorporated between the double layer of the scaffold. The outer layer will consist on collagen nanofibers enriched with silver nanoparticles, that will provide antimicrobial properties to the scaffold. The scaffold will be characterized through use of different techiniques, such as SEM, FTIR, antimicrobial activity tests, MTS, among others. It is expected that the developed scaffold fulfills features like structural integrity, porous architecture, biocompatibility, biodegradability, osteoconductivity and antimicrobial character. RESUMO Mundialmente, as doenças degenerativas ósseas e as fraturas afetam milhões de pessoas. Os maus hábitos alimentares ou o envelhecimento são, entre outros fatores, responsáveis por atenuar a capacidade regenerativa do tecido ósseo. Nos últimos anos, o tratamento para estes problemas tem passado pela aplicação de próteses ou enxertos ósseos. Estas alternativas acarretam algumas limitações tanto em termos funcionais como em termos de eficácia. Para colmatar este problema, estão a ser desenvolvidas estruturas, denominadas de scaffolds, sobre as quais o tecido ósseo se pode reparar e regenerar. Assim sendo, este projeto propõe o desenvolvimento de um scaffold formado por uma dupla camada de nanofibras produzidas através de electrospinning. A camada interna será constituída por nanofibras de policaprolactona (PCL) que darão estrutura ao scaffold e, devido à biodegradação lenta deste polímero, permitirão que possa ser usado em defeitos ósseos com uma extensa área de regeneração. De forma a desenvolver o microambiente adequado ao desenvolvimento do tecido ósseo, será incorporado um cocktail de fatores de crescimento entre a dupla camada do scaffold. A camada externa será constituída por colagénio e enriquecida com nanopartículas de prata que dotarão o scaffold de propriedades antimicrobianas. O scaffold será caracterizado recorrendo a diversas técnicas, tais como, SEM, FTIR, testes de atividade antimicrobiana, MTS, entre outros. Espera-se que o scaffold desenvolvido reúna características como integridade estrutural, arquitetura porosa, biocompatibilidade, biodegradabilidade, osteocondutividade e caractér antimicrobiano e que possa responder às necessidades clínicas.
  5. 5. 5 ÍNDICE 1. Estado da Arte 6 1.1.Caracterização do osso 6 1.2. Doenças Ósseas 6 1.3. Engenharia de tecidos e scaffolds 7 1.4.Electrospinning 8 2. Objetivos 10 3. Tarefas 11 3.1. Produção e otimização de scaffolds tridimensionais através de electrospinning 11 3.2. Preparação de um cocktail de fatores de crescimento 12 3.4. Caracterização físico-química e biológica do scaffold final 13 4. Referencias Bibliográficas 15 5. Anexo 17
  6. 6. 6 1.ESTADO DA ARTE 1.1. CARACTERIZAÇÃO DO OSSO O tecido ósseo é um material compósito formado por uma fase orgânica e por uma fase inorgânica, que são constituídas maioritariamente por colagénio (Col) e hidroxiapatita (HA), respetivamente (Dorozhkin, 2011). Os ossos do esqueleto são responsáveis por fornecer suporte ao resto do corpo, permitir a locomoção e proteger os órgãos vitais. A matriz óssea representa, também, o maior reservatório de iões minerais do organismo, particularmente de cálcio e fósforo (Tortora et al, 2012). As células vivas no osso são os osteoblastos, osteoclastos e osteócitos. Os osteoblastos sintetizam e secretam fibras de colagénio para formar a matriz extracelular do tecido ósseo. À medida que estes são internalizados pela matriz extracelular transformam-se em osteócitos. Os ósteocitos são as principais células do tecido ósseo e são responsáveis por manter o seu metabolismo diário (Shekaran et al, 2011). Com base na sua densidade, o osso pode ser classificado em cortical ou trabecular. A estrutura hierárquica do osso de acordo com as suas dimensões encontra-se representada na figura 1. O tecido ósseo cortical é o tipo mais denso de tecido ósseo. Fornece proteção e sustentação ao stress produzido pelo peso e movimento e possui um papel importante na tensão, compressão e torsão, enquanto o tecido ósseo trabecular é importante apenas na compressão. Estruturalmente, está disposto em unidades estruturais repetitivas chamadas osteões ou sistemas de Havers. Por sua vez, o tecido ósseo trabecular, estruturalmente é constituído por pequenas unidades estruturais chamadas trabéculas, onde os espaços macroscópicos são preenchidos por medula óssea vermelha. Este é mais ativo metabolicamente, sendo renovado de forma mais frequente que o osso cortical (Murugan et al, 2005). 1.2. DOENÇAS ÓSSEAS As doenças degenerativas ósseas e fraturas são conhecidas por afetarem milhões de pessoas. Estima-se que, em 2020, o número de pessoas afetadas por doenças ósseas duplique (Santos et al, 2012). Atualmente, mais de 2,2 milhões de enxertos ósseos são realizados num ano (Van Lieshout et al, 2011). A capacidade de regeneração, a estrutura e a função do tecido ósseo podem ser afetadas no caso de doenças como a osteogénese imperfeita, a osteoartrite, a osteomielite e a osteoporose (Porter et al, 2009). Os maus hábitos alimentares ou o envelhecimento podem ser causas da diminuição da capacidade regenerativa do osso. Assim sendo, a reparação e regeneração de defeitos ósseos é levada a cabo pela substituição do tecido original por um substituto ósseo que deve preencher o defeito e restaurar a sua função. Em ambiente clínico, a solução passa muitas vezes pela aplicação de próteses.
  7. 7. 7 O tratamento de fraturas através de artoplastia total da anca (ATA) é comum há vários anos em ambiente clínico. A ATA é uma cirurgia utilizada na substituição das articulações da anca através de um implante que consiste numa taça acetabular polimérica e numa componente femoral em liga metálica, como se encontra representado na figura 2 (So et al, 2013). Embora muito utilizados, este e outros tratamentos não conseguem, muitas vezes, promover a reparação tecidular, quer seja devido ao tamanho do defeito ósseo ou à ocorrência de infeções. O tratamento de defeitos ósseos pode também ser feito através de autoenxertos, aloenxertos e xenoenxertos. Os autoenxertos consistem no preenchimento do defeito ósseo através do transplante de tecido de outros ossos do próprio paciente. Por sua vez, os aloenxertos baseiam-se na utilização de tecido ósseo de outros humanos, geralmente cadáveres. Os xenoenxertos utilizam tecido ósseo proveniente de outras espécies. No entanto, a ocorrência frequente de infeções, respostas imunitárias contra o hospedeiro e risco elevado de rejeição compromete o sucesso destes métodos. As complicações supracitadas e outras levaram à necessidade de se desenvolverem novos estudos na área da engenharia de tecidos de modo a que as doenças ósseas possam ter um tratamento mais eficaz (Porter et al, 2009). 1.3. ENGENHARIA DE TECIDOS E SCAFFOLDS A engenharia de tecidos (ET) é um ramo interdisciplinar que aplica os princípios das ciências biológicas juntamente com os da engenharia levando ao desenvolvimento de substitutos biológicos que restaurem, mantenham ou melhorem as funcionalidades de tecidos humanos que tenham sido lesados ou perdidos. Assim, é responsável pela produção de órgãos “artificiais” imunologicamente tolerantes e substitutos de tecidos que podem crescer com o paciente (Suganya et al, 2014). Os scaffolds são um dos componentes principais na ET. Fornecem o suporte estrutural necessário para a fixação das células e o consequente desenvolvimento de tecidos, servindo como reservatórios de água, citocinas, nutrientes e fatores de crescimento (Salgado et al, 2004). Para além disso, reduzem a quantidade de intervenções cirúrgicas necessárias e o risco de infeções, graças ao seu carácter biodegradável (Porter et al, 2009). Na regeneração óssea é fundamental que os scaffolds tenham uma boa integridade estrutural, uma grande superfície de contacto para promover a interação entre o material e a célula, uma degradação lenta sincronizada com o tempo de formação do novo osso, e devem ser biocompatíveis. Além disso, o scaffold deve ser osteocondutivo, isto é, permitir a migração de células osteogénicas para a sua superfície. A escolha de materiais que façam parte da constituição nativa do osso (ex. HA) e a incorporação de fatores de crescimento, fármacos, moléculas bioativas e genes ajudam a estimular a reparação e regeneração óssea. Assim sendo, a escolha do material mais apropriado na produção do scaffold é determinante para que ele possa cumprir as aplicações para as quais foi desenvolvido (Cabañas et al, 2014). A estratégia mais eficaz de implantação de scaffolds consiste no isolamento das células estromais mesenquimais do paciente e posterior ampliação destas ex vivo. As
  8. 8. 8 células são depois semeadas no scaffold, levando à produção de matriz extracelular sob condições controladas. Posteriormente, o scaffold é implantado no defeito ósseo do paciente, como se encontra esquematicamente representado na figura 3 (Porter et al, 2009). Os scaffolds à base de nanofibras são muito utilizados na ET porque podem ser arquitetados de forma a possuírem diversas propriedades mecânicas necessárias para suportar o crescimento celular, a sua proliferação, diferenciação e mobilidade. (Salgado et al, 2004). As nanofibras são fabricadas a partir de vários polímeros sintéticos ou naturais. A policaprolactona (PCL) é um exemplo de um polímero sintético que tem sido eficazmente aplicado em sistemas de entrega de fármacos e que revela uma boa biocompatibilidade. Devido ao seu carácter hidrofóbico e elevada cristalinidade, a PCL possui uma biodegradação in vivo relativamente lenta. A aplicação da PCL a substitutos ósseos pode ser bastante promissora porque dotará o scaffold de boas propriedades mecânicas e a sua velocidade de degradação coincide com a velocidade de formação do novo osso (Yu et al, 2008). Por seu turno, o Col é um polímero natural do osso muito utilizado em substitutos ósseos já que é biocompatível, biodegradável e possui potencial osteogénico (Murphy et al, 2014). 1.4. ELECTROSPINNING Depois de selecionado o polímero adequado para constituir o scaffold, deve- se escolher ou desenvolver uma técnica de processamento apropriada. No caso das nanofibras poliméricas, estas têm sido produzidas usando uma enorme variedade de métodos diferentes, baseados em técnicas físicas, químicas, térmicas e eletrostáticas (Beachley et al, 2010). Algumas características dos métodos mais comuns encontram- se sumariamente descritas na tabela 1. Tabela 1- Comparação dos métodos mais comuns no fabrico de scaffolds à base de nanofibras (Bachley et al, 2010). Método Vantagens Desvantagens Electrospinning  Procedimento fácil;  Rentável;  Permite o controlo do diâmetro das fibras, microestruturas e arranjo;  Poros bidimensionais;  Uso frequente de solventes tóxicos; Automontagem  Fácil incorporação das células durante a formação de fibras;  Arranjo tridimensional dos poros;  Procedimento complicado;  Arranjo descontrolado de fibras;  Diâmetro e comprimento limitado; Separação de fase  Arranjo 3D dos poros;  Procedimento complicado;  Arranjo de fibras descontrolado;
  9. 9. 9 Dada a sua simplicidade e acessibilidade relativamente aos demais métodos, o electrospinning é considerado o método mais utilizado na produção scaffolds à base de nanofibras (Pham et al, 2006). Trata-se de um método que se baseia em interações eletrostáticas a partir de soluções principalmente poliméricas (Beachley et al, 2010). A figura 4 mostra uma ilustração esquemática do funcionamento básico do electrospinning. É constituído por três componentes maioritários: uma bomba de seringa, uma fonte de alimentação de alta tensão e um coletor. Na seringa é colocada uma solução polimérica, que é bombeada a uma velocidade constante e controlada. Quando se aplica uma corrente elétrica, através da fonte de alimentação de alta tensão, a gota pendente de solução de polímero no bico da agulha tornar-se-á altamente eletrificada e, consequentemente, na ponta da agulha irão verificar-se, dois tipos de forças eletrostáticas: a repulsão eletrostática entre as cargas á superfície e as forças de Couloumb exercidas pelo campo elétrico externo. Sob a ação destas forças de interação, o líquido na ponta da agulha será distorcido obtendo-se uma forma cónica, denominada cone de Taylor (Li et al, 2004). Se a intensidade do campo elétrico passar o limiar, as forças eletrostáticas podem superar a superfície de tensão da solução polimérica e levar à ejeção de um jato líquido da agulha. Este jato eletrificado entra, de seguida, num processo de alongamento, levando à formação de uma fina malha. Como o jato líquido é continuamente alongado e o solvente evaporado, o seu diâmetro é reduzido de cerca de uma centena de micrómetros para umas dezenas de nanómetros. Atraídas pelo coletor localizado na direção da agulha, as fibras carregadas são frequentemente depositadas com orientação aleatória (Li et al, 2004). Na figura 4 b) encontra-se representada a imagem típica recolhida por microscopia eletrónica de varrimento. As nanofibras produzidas por electrospinning têm superfície elevada em relação ao volume, elevada porosidade, e elevada interconectividade entre poros que facilita o transporte de nutrientes e comunicação celular.
  10. 10. 10 2.OBJETIVOS Tendo em conta a importância do desenvolvimento de substitutos capazes de colmatar falhas no processo de regeneração óssea, este trabalho tem como objetivos: - O desenho, produção e otimização de redes de nanofibras tridimensionais capazes de servirem como revestimento de defeitos ósseos ou de otimizarem propriedades de outros tipos de scaffolds. - O estudo da técnica de electrospinning, que compreende vários parâmetros de otimização. - A caracterização físico-química e biológica do scaffold 3D produzido recorrendo a ensaios de porosidade e espetroscopia de infravermelhos e ensaios in vivo e in vitro para avaliar se as suas características biológicas permitem uma futura aplicação no tratamento de doenças ósseas. - O estudo da libertação controlada de um cocktail de biomoléculas incorporado no scaffold.
  11. 11. 11 3.TAREFAS TAREFA 1 - PRODUÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE SCAFFOLDS TRIDIMENSIONAIS ATRAVÉS DE ELECTROSPINNING. A primeira tarefa consiste em desenhar tridimensionalmente a estrutura do scaffold usando o software SolidWorks. A matriz do scaffold será constituída por uma dupla camada de nanofibras, de forma a criar um ambiente biológico específico em cada camada. A camada mais interna será constituída por PCL, já que é um polímero que se degrada lentamente, e será responsável por fornecer estabilidade estrutural ao scaffold (Yu et al, 2008). A camada mais externa será formada por fibras de Col que irão promover a adesão celular na superfície do scaffold (Liu et al, 2014). As duas camadas que formarão o scaffold serão produzidas através da técnica de electrospinning uma vez que é uma técnica simples e rentável que consiste na produção de uma rede fibrosa a partir de soluções poliméricas. De modo a evitar a perda da hélice tripla do colagénio e garantir a estabilidade estrutural das nanofibras, o solvente utilizado no electrospinning deve ser um solvente não tóxico. Para tal, será utilizado um sistema de solvente etanol-água (Jiang et al, 2013). A camada de Col será enriquecida com nanopartículas de prata (AgNPs) cobertas com polivinilpirrolidona (PVP). A PVP apresenta grande afinidade para a superfície das AgNPs e reduzirá os iões metálicos. Para preparar as AgNPs revestidas com PVP, uma determinada quantidade de PVP será dissolvida em 10 mL de etanol num recipiente de 50 mL que será aquecido a 50o C com agitação magnética. Posteriormente, serão adicionados 10 mL de solução etanólica de nitrato de prata (AgNO3) ao recipiente e a mistura será vigorosamente agitada a 50º C para se promover o início da reação. De forma a monitorizar a formação de AgNPs durante a reação foi utilizada espetroscopia UV/visível. A solução etanólica de AgNPs revestidas com PVP será adicionada diretamente à solução de Col dissolvida em clorofórmio numa concentração de 1:4. Depois de sofrer agitação, a solução será processada por electrospinning. As nanopartículas de prata vão dotar o scaffold de propriedades antimicrobianas (Tian et al, 2013). No meio das duas camadas serão incorporadas fisicamente microsferas de gelatina contendo fatores de crescimento.
  12. 12. 12 TAREFA 2 – PREPARAÇÃO DE UM COCKTAIL DE FATORES DE CRESCIMENTO. Esta tarefa consiste na preparação de um cocktail de fatores de crescimento que será posteriormente incorporado entre a dupla camada do scaffold, criando um sistema que permita a libertação controlada e gradual dos mesmos. A imobilização de fatores de crescimento num scaffold assume um papel importante na criação do microambiente adequado para o desenvolvimento do tecido (Gungor-Ozkerim et al, 2014). Os fatores de crescimento selecionados foram o BMP-2 e o BMP-7, responsáveis por promover a diferenciação e migração dos osteoblastos e o TGF-β que é responsável pela proliferação e diferenciação das células formadoras de tecido ósseo (Lee et al, 2011). A gelatina é um biopolímero hidrofílico natural resultante da hidrólise do Col que tem sido utilizado, sob a forma de microsferas, na entrega de biomoléculas. As microsferas de gelatina incorporarão os fatores de crescimento e serão produzidas através da técnica de coacervação. Os fatores de crescimento selecionados serão dissolvidos em tampão fosfato-salino (PBS) e numa solução aquosa de gelatina 15 wt %. A mistura será posteriormente depositada, gota a gota, sob agitação mecânica durante 10 minutos, de modo a que as microesferas obtenham um diâmetro adequado. Posteriormente, estas serão reticuladas com uma solução de glutaraldeído e secas durante 24 horas a 4 ºC. As microesferas de gelatina serão dissolvidas numa pequena quantidade de etanol e adicionadas sobre a camada de PCL. Depois da secagem das microsferas sobre a camada de PCL, será adicionada a cobertura de Col. A dupla camada será colocada a vácuo num dessecador para eliminar resíduos de solvente e previnir a adsorção de humidade (Gungor-Ozkerim et al, 2014). A libertação dos fatores de crescimento será estudada a partir da imersão das microsferas numa solução de PBS e sua posterior incubação a 37o C com agitação suave. Todo o sobrenadante será removido diariamente. Para quantificação das biomoléculas libertadas, a gelatina será precipitada e a quantidade de fatores de crescimento libertados por intervalo de tempo será medida utilizando um espetrofotómetro de fluorescência. As concentrações de fatores de crescimento serão calculadas recorrendo a uma curva de calibração que relacionará as intensidades medidas no espetrofotómetro com as concentrações (Jeon et al, 2008), (Gungor-Ozkerim et al, 2014).
  13. 13. 13 TAREFA 3 – CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BIOLÓGICA DO SCAFFOLD FINAL. As nanofibras de PCL e Col, constituintes do scaffold final, serão caracterizadas através de medições de Espetroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). As medições serão recolhidas entre os 4000 e os 400 cm-1 . Esta análise permitirá verificar se ocorreram alterações na estrutura química dos polímeros durante o processo de electrospinning e se a dupla camada de nanofibras apresenta as ligações características de ambos os polímeros (Gungor- Ozkerim et al, 2014). A microscopia eletrónica de varrimento (SEM) será outro método utilizado na caracterização das nanofibras. A SEM permite obter imagens da morfologia das estruturas electrofiadas. Antes das medições da SEM, as amostras devem ser revestidas com ouro através de pulverização catódica. O diâmetro médio das fibras será calculado estatisticamente através da análise aleatória de 25 fibras. Os resultados serão analisados recorrendo ao teste de t de Student (Gungor-Ozkerim et al, 2014). A determinação do grau de libertação dos iões de prata da camada de Col será realizada através de espetrometria de adsorção atómica. Neste processo, uma pequena malha de fibra electrofiada contendo AgNPs será imersa em água desionizada – meio de libertação – e incubada a 37º C sob uma oscilação de 100 rpm. A água desionizada será recolhida diariamente e substituída pelo mesmo volume de água fresca. A concentração de prata na solução foi medida usando um Espéctrofotómetro de Emissão Atómica por Plasma Acoplado (ICP-AES). Os testes de atividade antimicrobiana serão levados a cabo na Escherichia coli, por ser um microorganismo comum no organismo humano, e na Staphylococcus aureus, por ser o principal causador de infeções em substitutos ósseos. Ambas as espécies serão cultivadas em meio de cultura adequado e incubados durante a noite a 37 o C. Para avaliar qualitativamente o carácter antimicrobiano das fibras será usado o método de Kirby-Baeuer. Assim sendo, cerca de 200 µL de E. coli e S. aureus serão colocados em placas de ágar. Sobre as placas inoculadas, serão adicionadas pequenas redes da fibra de PCL contendo AgNPs. As placas serão incubadas durante a noite a 37ºC e o halo de inibição para cada malha será medido. Para avaliar quantitativamente a atividade antimicrobiana, a suspensão bacteriana diluída será colocada num recipiente contendo as malhas fibrosas. O recipiente será mantido a 37 ºC numa incubadora oscilante durante a noite. A intervalos de tempo regulares, serão recolhidas amostra da solução contida no recipiente, que serão inoculadas em ágar. Depois de incubadas a 37 ºC por 24 horas, as unidades formadoras de colónias (CFU) serão contabilizadas a olho nu. A percentagem de inibição será calculada através da diferença entre as CFU da amostra e as CFU do controlo (Tian et al, 2013). Para avaliação da citotoxicidade, o scaffold será analisado em contacto com uma linha celular osteoblástica humana, uma vez que se trata de um substituto para
  14. 14. 14 ser aplicado a lesões do tecido ósseo. Para quantificar a viabilidade celular em contacto com o scaffold irá utilizar-se um kit designado de MTS. O protocolo a seguir será o já anteriormente descrito por outros autores (Jiang et al, 2013). Os estudos da degradação in vitro serão levados a cabo através da emersão dos scaffolds numa solução de PBS a 37ºC. A intervalos de tempo específicos, as amostras serão removidas, lavadas suavemente com água destilada para remover a solução salina e secas a 37ºC. A percentagem de perda de peso (Wl) a cada tempo de emersão será calculada usando a equação 1. Wi e Wf correspondem à massa das amostras antes e depois da emersão na solução de PBS, respetivamente. Wl=[(Wf-Wi)/Wi] x 1000 (1)
  15. 15. 15 4.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  Beachley, V., & Wen, X. (2010). Polymer nanofibrous structures: Fabrication, biofunctionalization, and cell interactions. Progress in Polymer Science, 35(7), 868.  Cabañas, M.V., Peña, J., Román, J., Ramírez-Santillán, C., Matesanz, M.C., Feito, M.J., Portolés, M.T., Vallet-Regí, M. (2014). Design of tunable protein-releasing nanoapatite/hydrogel scaffolds for hard tissue engineering. Materials Chemestry and Physics 144 409-417.  Dorozhkin, S. V., (2011) Biocomposites and hybrid biomaterials based on calcium ortophosphates, Biomatter 1:1, 3-56.  Gungor-Ozkerin, P., Balkan, T., Kose, G., Sarac, A., Kok, F. (2014). Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications, Journal of Biomedical Research Part A, Volume 102, 1897-1908.  Jeon, J. H., & Puleo, D. (2008). Alternating release of different bioactive molecules from a complexation polymer system. Biomaterials, 29(26), 3591–8.  Jiang, Q., Reddy, N., Zhang, S., Roscioli, N., & Yang, Y. (2013). Water-stable electrospun collagen fibers from a non-toxic solvent and crosslinking system. Journal of Biomedical Materials Research. Part A, 101(5), 1237–47.  Lee, K., Silva, E. a, & Mooney, D. J. (2011). Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society, 8(55), 153–70.  Li, D., & Xia, Y. (2004). Electrospinning of Nanofibers: Reinventing the Wheel? Advanced Materials, 16(14), 1151–1170.  Liu, Y., Luo, D., Liu, S., Fu, Y., Kou, X., Wang, X., Zhou, Y. (2014). Effect of Nanostructure of Mineralized Collagen Scaffolds on Their Physical Properties and Osteogenic Potential. JOURNAL OF BIOMEDICAL NANOTECHNOLOGY, 10, 1049–1060.  Murphy, C., Schindeler, A., Gleeson, J., Yu, N., Cantrill, L., Mikulec, K., Peacock, L., O’Brien, F., Litlle, D. (2014). A collagen-hydroxyapatite scaffold allows for binding and co-delivery of recombinant bone morphogenetic proteins and biphosphonates. Acta Biomaterialia, 10, 2250-2258.  Murugan, R., Ramaktishna, S., (2005). Development of nanocomposites for bone grafting, Composites Science and Technology 65, 2385-2406.  Pham, Q. P., Sharma, U., & Mikos, A. G. (2006). Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue Engineering, 12(5), 1197–211.  Porter, J. R., Ruckh, T. T., & Popat, K. C. (2009). Bone tissue engineering: a review in bone biomimetics and drug delivery strategies. Biotechnology Progress, 25(6), 1539–60.
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  17. 17. 17 5.ANEXO Fig.1 – Estrutura hierárquica do osso de acordo com as suas dimensões (adaptado de Murugan et al, 2005). Figura 2 – Radiografia de uma mulher de 49 anos de idade com osteoartrite. A) Aspeto no pré operatório, B) Aspeto depois da ATA (adaptado de So et al, 2013).
  18. 18. 18 Figura 3- Representação esquemática da implantação de scaffolds a partir do isolamento e expansão de células ex vivo que são posteriormente semeadas no scaffold (adaptado de Porter et al, 2009). Fig.4 – (A) Esquema de instalação do electrospinning em (B) uma imagem recolhida através de microscopia electrónica de varrimento de nanofibras de poliuretano (adaptado de Beachley et al, 2010). Isolamento de células Expansão em cultura Implantação “Plantação” no scaffold

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