Genética y Biología molecular de Neurospora crassa. Nallely Cano. Instituto de Fisiología Celular. UNAM.

1. Genética y Biología Molecular en Neurosporacrassa Nallely Cano Domínguez Instituto de Fisiología Celular UNAM Laboratorio 107 Oriente

2. Neurosporacrassaen la naturaleza

3. De Moniliasitophilaa Neurospora Premio de la Sociedad Americana de Botánica 1956 Bernard Ogilvie Dodge

4. “Cada uno de esos miles de tipos de genes tienen, en general, una única especificidad. Esto significa que una enzima usualmente tendrá su final específicamente en un grupo y sólo un gen” GEORGE WELLS BEADLE EDWARD L. TATUM Premio Nobel en Medicina 1958 por su hipótesis de “un gen-una enzima”

5. Experimentos de Beadle y Tatum Encuentran tres mutantes distintas que necesitaban arginina (arg-1, arg-2 y arg-3) para crecer y probaron si eran capaces de crecer en medio con ornitina y/o citrulina arg-1 arg-3 arg-2 Citrulina Arginina Ornitina Precursor “Las características de una célula (su fenotipo) a su vez están producidas por su metabolismo interno, que está controlado por las enzimas que intervienen en los distintos pasos metabólicos”. La adición de arginina al medio restaura el crecimiento

6. reconoce a Neurosporacrassacomo uno de los 12 modelos eucariontes para la investigación biomédica The ¿Por qué Neurosporacrassaes un buen modelo genético?

8. Pueden reconocerse las distintas estructuras diferenciadas

9. Produce ascas grandes lo que facilita hacer estudios de meiosisAscogonia Protoperitecio

10. Fácil mantenimiento en el laboratorio ✔ Medio Vogel y 1.5% de sacarosa Medio con 2% de sorbosa 3 días en oscuridad y 2 días en luz a 30°C 2 días en oscuridad a 30°C

11. Fácil mantenimiento en el laboratorio ✔ Medio sintético de cruza “Racetubes”

12. ✔ No es patógeno pero ha servido como modelo para el estudio de procesos que se han conservado en los hongos patógenos Las cepas se pueden preservar durante mucho tiempo ✔

13. Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center (www.fgsc.net) ✔ Peritecios de la cepa mutante per-1 Mutante “Band” Cepa “algodonosa” (fluffy)

14. ✔ Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center afectadas en la formación de las ascosporas Ascosporas mutante peak Ascas de la mutante Perforated Ascosporas gigantes mutante Banana Ascas de una cepa silvestre Ascosporas de las mutante cys-3

15. Su genoma se encuentra secuenciado ✔ Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68

16. Características del genoma de N. crassa Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68

17. ✔ La secuencia del genoma de Neurosporacrassase encuentra disponible en la red en la página del BROAD INSTITUTE

18. Busquemos un gen… nor-1

19. En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del gen de interés

20. En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del gen de interés

21. Se obtiene la secuencia génica y las regiones 5´y 3´que flanquean al gen nor-1

22. Se pueden obtener mutantes nulas en un gen fácilmentePor la técnica del “Double Joint PCR” ✔

23. Los métodos de transformación de Neurosporacrassa Por electroporación Por esferoplastos Enzimas Líticas

24. Existen herramientas disponibles para etiquetar proteínas (GFP, RFP, 6H, HA) his-3 amp pMF272 Promotor de ccg-1 his-3 gfp nor-1

25. Localización de Proteínas mediante fusiones con GFP

26. Microscopía confocal Microscopía de TIRF de polimerización de microtúbulos de una hifa de una cepa WT Uchida M. et al. 2008. FungalGeneticBiology. 2008 May;45(5):683-92 Microscopía confocal de una cepa con la construcción arg-4::gfp(Bowman)

27. Microscopía confocal y epifluorescencia Hifas con una construcción vma-1::rfp(se localiza en las vacuolas) Bardiya, N. et al 2008. Genetics. 178 (1): 593-6

28. Microscopia de BarridoConidia Anastomosis Tubes (CAT´s) Roca, M. G. et al 2005. EukaryoticCell. P. 911-919

29. Ritmo circadiano

30. Proceso de conidiación en N. crassa 1 ERO 6 – 15 min 40 min Hifas en crecimiento Adhesión de las hifas 2 ERO ERO 2.5 - 12 h 5 – 30 min 1.5 h – 2.5 h 3 ERO 6.5 h - 8.5 h 8.5 - 15 h ERO: Especies Reactivas de Oxígeno Conidiación Micelio Aéreo

31. Hansbergy Aguirre, 1990 Estado diferenciado Estado no diferenciado O2 + nutrientes O2 + nutrientes [ERO] diferenciación Muerte Celular O2 + nutrientes germinación [ERO] “La diferenciación celular de los microorganismos se da como respuesta a un estado hiperoxidante” Aguirre, J. et al. (2005), Trends in Microbiol. 13(3):111-8

32. PREDICCIONES Mutaciones en los mecanismos antioxidantes Mutaciones en los mecanismos pro-oxidantes

33. Las NADPH oxidasas en células fagocíticas y sus ortólogos en hongos O2 O2.- Flavocitocromo b558 gp91phox NOX NOX p22 phox p22 phox gp91phox p47phox Rac-GTP p40phox Proteínas reguladoras p67phox BEM-1 p40phox NADPH NADP+ p47phox GEF p67phox Rac-GTP Rac-GDP RhoGDI NOR-1 Modificado de Lambeth, D. (2004). Nature review.4:181-1189

34. NOX-1 isessentialfor sexual and asexual development Δnox-1strains NOX p22phox gp91phox WT WT ∆nox-1 ∆nox-1 (a) WT nox-1 p40phox NOX-1 isessentialfor sexual frutingbodiesdevelopmentandalsorequiredfor normal developmentofaerialhyphaeandconidiation, as well as forvegetativegrowth. p47phox Cano-Dominguezet al. 2008. EukaryoticCell, 7(8):1352-61 NOR-1 Rac-GTP p67phox

35. NOX-2 isrequieredfor sexual sporefunction Δnox-2strains NOX p22phox gp91phox nox-2 x nox-2 WT x WT p40phox p47phox TheascosporesfromΔnox-2 homozygouscrossesfailedtogerminate NOR-1 Rac-GTP p67phox

36. NOR-1 isrequiredfor NOX-1 and NOX-2 activity Δnor-1strains NOX p22phox gp91phox WT nor-1 p47phox p40phox ∆nox-2 X ∆nor-1 WT X WT NOR-1 Rac-GTP p67phox

37. Agradecimientos Dr. Jesús Aguirre Biol. Olivia Sánchez Laboratorio 107 Oriente Dr. Wilhelm Hansberg Dr. Pablo Rangel Laboratorio 103 Oriente

38. GRACIAS!!!